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Immunology and Infection

결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용

doi: 10.3791/59703 Published: June 30, 2019
* These authors contributed equally

Summary

갤러리아 멜로넬라는 최근 결핵 균복합체에 대한 재현가능하고 저렴하며 윤리적으로 허용되는 감염 모델로 설립되었습니다. 여기에서 우리는 생물 발광 균 bovis BCG 럭스와 G. 멜로넬라의 성공적인 감염을 확립하기 위해 취한 단계를 설명하고 보여줍니다.

Abstract

결핵은 전염병 사망률의 주요 한 글로벌 원인이고 세계 인구의 대략 사분의 일은 결핵균에 감염되는 것으로 여겨진다. 수십 년간의 연구에도 불구하고 병원성 유기체로서 M. 결핵의 성공 뒤에 있는 많은 메커니즘이 조사되어야 하며, 보다 안전하고 효과적인 항균 제의 개발이 시급히 증가하고 약물 내성 결핵의 확산. 그러나, 결핵 연구의 진행은 비싸고, 시간이 걸리고, 윤리적으로 도전적인 전통적인 포유류 감염 모형에 의해 병목 현상됩니다. 이전에 우리는 M. 결핵 복합체의 구성원을 위한 소설, 재현가능, 저비용, 높은 처리량 및 윤리적으로 허용되는 감염 모형으로 곤충 갤러리아 mellonella (큰 왁스 나방)의 애벌레를 설치했습니다. 여기에서 우리는 생물 발광 성 진균 bovis BCG 럭스와 G. 멜로넬라의 유지 보수, 준비 및 감염을 설명합니다. 이 감염 모델을 사용하여, 진균 투여 량 의존적 독성을 관찰 할 수 있으며, 생물 발광 측정을 사용하여 생체 내 진균 부담의 신속한 판독은 쉽게 달성하고 재현 할 수 있습니다. 전사분석을 위한 완전 하게 비고를 받은 게놈의 부족과 같은 한계가 존재하지만, 유전적으로 유사한 곤충에 대한 존재론적 분석이 수행될 수 있다. 결핵에 대한 저비용, 신속하고 윤리적으로 수용 가능한 모델로서, G. mellonella는 약물 효능 및 독성을 결정하고, 기존의 포유류를 사용하기 전에 비교 균균 독성을 결정하기 위한 사전 스크린으로 사용될 수 있습니다. 모델. G.mellonella-mycobacteria 모델의 사용은 현재 결핵 연구에 사용되는 동물의 상당수의 감소로 이어질 것입니다.

Introduction

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결핵 (TB)는 연간 9백만 건의 새로운 사례와 150만 명의 사망자1을가진 글로벌 공중 위생에 중요한 위협입니다. 또한, 세계 인구의 1/4이 질병의 원인인 결핵(Mtb)에 감염된 것으로 추정된다. 감염된 인구 중 5-10%는 일생 동안 활성 결핵 질환을 앓게 됩니다. 더욱이, 다중 약 저항하는 (MDR) 및 광용약 (XDR) 저항하는 Mtb의 출현 그리고 퍼짐은 질병 통제에심각한 위협을 제기합니다, 와 123 국가는 적어도 1개의 XDR 케이스 1를 보고했습니다. 결핵의 치료는 적어도 4 개의 항 균제 의 칵테일을 필요로하며, 그 중 는 리팜피신이 최소 6 개월 동안 처방됩니다. 치료는 종종 복잡 한 부작용 및 독성과 관련 된. 결핵에 대하여 유일한 허가된 백신에서 보호, 진균 bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), 가변 2입니다. 결핵의 병인에 대한 불완전한 이해는 새로운 치료 및 예방 접종 전략의 개발을 크게 방해합니다.

수십 년 동안 동물 감염 모델은 결핵 연구가 감염에 대한 기본 병인 및 숙주 반응을 이해하고 새로운 항균제, 면역 치료제 및 새로운 백신 후보물질을 평가하는 데 필수적이었습니다3, 4. 그러나 결핵의 동물 감염 모델을 사용한 연구는 결핵 감염의 발병 기전과 진행이 복잡하기 때문에 악명이 높고 질병의 전체 스펙트럼과 중요한 특징을 모방하는 단일 동물 모델이 없습니다5 ,6. 또한, 동물 실험은 비용이 많이 들고, 수행해야 하는 시간이 많이 걸리며 완전한 윤리적 정당성이 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 결핵의 동물 감염 모델은 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이), 기니피그, 토끼, 소, 돼지, 마우스 및 제브라피시각각그들의 한계를 갖는3,4. murine 모형은 비용, 근친 선의 가용성, 감염의 재현성 및 면역학 시약의 풍부 때문에 가장 일반적으로 이용되는 모형입니다. 그러나, 그(것)들은 전형적으로 잠복 결핵 감염 (LTBI)6의특징인 저산소증의 지역과 관련되었던 육아종을 형성하지 않습니다. 기니 피그는 Mtb 감염에 매우 취약, 병리와 인간에서 그와 유사한 초기 육아종 형성, 백신 테스트에 널리 사용 된다; 그러나 면역 학적 시약의 부족은 감염 모델7로사용을 방해합니다. Zebrafish는 작은 크기, 빠른 번식 및 고급 유전 도구로 인해 초기 단계 의 전임상 연구에서 대규모 스크리닝에 적합하지만 해부학적 및 생리학적으로 인간과 다르며 인간에게만 취약합니다. 마이코박테리움 마리눔 감염3. 인간 Mtb 감염과 가장 밀접하게 유사한 동물 모델은 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이)이지만, 그들은 비싸고 그들의 사용을 상당히 제한하는 상당한 윤리적 및 실용적인 고려사항을 가지고있다8.

큰 왁스 나방이나 벌집 나방의 곤충 유충,갤러리아 멜로넬라, 다양한 세균 및 곰팡이 병원균에 대한 감염모델로 서 점점 더 인기를 끌고 있다 9, 그리고 새로운 항균 약물 후보에 대한 화면으로 10. G. mellonella는 척추 동물11과 높은 수준의 구조적 및 기능적 유사성을 공유하는 정교한 선천적 면역 체계 (세포 및 체액 방어로 구성)로 인해 성공적인 무척추 동물 모델입니다. . 이는 혈세포(포유류 대식세포 및 호중구와 기능적으로 유사함)에 의한 병원균의 식균과 같은 면역 기전을 포함하며,12,13,항균 펩티드(AMPs)의 생산 및 순환 및 G. 멜로넬라11의혈림프 (포유류 혈액과 유사) 내의 보체와 유사한 단백질. 다른장점 9,14,15 모델로 G. mellonella 애벌레포함 1) 그들의 큰 크기 (20−30 mm) 쉬운 조작 및 감염에 대 한 허용, 조직의 컬렉션 뿐만 아니라 분석을 위한 헤모림프, 2) 37°C에서의 간편한 유지보수, 인간 병원체 연구를 위한 용이함, 3) 마취없이 주사에 의한 정밀감염, 4) 항균제의 효능평가, 5) 부족 포유류의 사용에 비해 윤리적 제약, 6) 큰 그룹 크기는 더 큰 재현성을 허용하는 동물 모델에 비해 사용될 수 있으며, 7) 감염 실험에 대한 짧은 시간이 필요합니다.

최근 연구에서, 우리는 G. mellonella가 생물 발광 M. bovis BCG lux에 의한 감염의 병인을 연구하기위한 새로운 감염 모델로 사용될 수 있음을 입증, 백신 균주 및 회원의 유전자 변형 버전 Mtb 단지 (MTBC)16. G. mellonella는 이전에 비 결핵 진균 (NTM)에 대한 감염 모델로 사용되었지만, 주로 M. 마리눔 및 진균 농양17,18,MTBC를 이용한 연구는 리 외16. Mtb의 대리로 봉쇄 수준 (CL) 2에서 사용할 수있는 생물 발광 비 병원성 진균 균주는 병원성 진균에 비해 안전성과 실용성의 장점을 제공합니다. BCG 럭스에감염 에 이어, 애벌레는 결핵 감염의 설립에 선천적 면역의 역할에 귀중한 통찰력을 제공 할 수있는 초기 육아종과 같은 구조를 개발하기 시작16. 또한, 이러한 간단한 무척추동물 감염 모델은 재현성을 위해 조절된 도전과 다중 복제를 통합한 결핵 발병기전에 대한 신속하고 저렴한 비용의 신뢰할 수 있는 평가를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있다. 더욱이, 이 모델은 초기 개발에서 신규한 항결핵 약물 및 백신 후보를 스크리핑하는데 사용될 가능성이 있으며, 실험에서 동물의 전체 수를 감소시킵니다. 숙주 및 병원체 구조의 변화를 측정하는 능력, 전사체 및 프로테오메는 약물 표적을 결정하고 새로운 약물 및 치료 백신의 작용 메커니즘을 평가하는 능력도 유리하다.

여기에서 우리는 생물 발광 M. bovis BCG 럭스 접종및 진균 감염을 위한 G. mellonella 애벌레의 제조를 위한 실험 적인 프로토콜을 기술합니다, 뿐만 아니라 애벌레와 진균균 둘 다의 결정 감염에 응하여 생존.

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Protocol

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참고: 아래에 설명된 모든 작업은 지역 보건 및 안전 지침에 따라 클래스 2 미생물 안전 캐비닛(MSC) 내의 CL2 실험실에서 수행되어야 합니다.

1. M. 보비스 BCG 럭스의 제조 감염

  1. 냉동 1.2 mL 글리세롤 해동 (15%) M. bovis BCG lux의 재고, 몬트리올 백신 균주는 루시프라아효소19를코딩하는 비브리오 하비이로부터 luxAB 유전자를 운반하는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 변형하였다.
  2. 0.2% 글리세롤, 10% 알부민, 덱스트로스, 카랄라제(ADC) 농축액을 함유한 미들브룩 7H9 국물 15mL, BCG 럭스의해동 된 1.2 mL aliquot와 50 μg/mL 의 hygromycin을 250 mL 에를렌 플라스크에 함유.
  3. 플라스크를 밀봉된 생물안전성 용기에 넣고 72시간 동안 220 rpm의 궤도 셰이커 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다(또는 배양이 성장의 중간 로그 단계에 도달할 때까지).
  4. 인산완충식염수(PBS, pH 7.4, 0.01 M 인산완충제, 0.0027M염화칼륨 및 염화나트륨 0.137M)를 이용하여 광도계 튜브에서 배양액의 1:10 희석을 준비하여 BCG 럭스 배양액의 성장을 점검한다. 와류는, 발광계 튜브를 발광계에 적재하고 n-데실 알데히드를 기판으로 사용하여 생물 발광(상대광 단위[RLU]]/mL)을 측정한다(절대에탄올에서 1% v/v).20.
    참고: RLU/콜로니 형성 단위(CFU)의 비율은 이전에 미들브룩 7H9 국물20에서BCG 럭스로 시험관내에서 재배되었을 때 3:1로 결정되었다.
  5. 원심분리기는 실온에서 10분 동안 2,175 x g에서 배양하여 세포를 펠렛하고 상황제를 알려진 진균 활성을 가진 적절한 소독제로 폐기한다. 모든 배양 폐기물은 현지 지침에 따라 진균에 적합한 소독제로 폐기하십시오.
  6. 세균 응집을 방지하기 위해 0.05 % 폴리 소르트 80 (PBS-T)을 포함하는 PBS에서 세포 펠릿을 두 번 씻는다.
  7. 최종 세척 후, decant 폐기물 상급제, PBS-T에서 진균 세포 펠릿을 다시 중단하고 RLU 측정을 사용하여 원하는 세포 밀도로 진균 현탁액을 희석.
  8. PBS-T를 사용하여 24 웰 플레이트에서 접종의 10 배 직렬 희석을 준비하십시오. 미들브룩 7H11 한천 플레이트(0.5% 글리세롤, 50 μg/mL 히그로마이신, 10% 올레산, 알부민, 덱스트로스, 카알라제 [OADC])에 10 μL을 플레이트하여 접종 CFU 카운트를 열거합니다.

2. G. 멜로넬라 애벌레의 준비

  1. 적절한 공급원으로부터 마지막 인스타 애벌레를 구입하고 도착 시 18°C에서 어둠 속에서 애벌레를 유지하고 구입 후 1주일 이내에 사용한다. 대안적으로, 애벌레는 Jojáo 외21의프로토콜에 따라 자가 사육될 수 있다. 구입 한 애벌레의 경우, 저장하기 전에 죽은, 변색 또는 사춘기 애벌레를 폐기하십시오.
    참고: 퍼핑 애벌레는 마지막 스타 애벌레와 형태학적으로 구별할 수 있습니다.
  2. 변색이 거의 또는 전혀 없는 균일한 크림 색상(멜라늄화), 크기(길이 2−3cm), 체중(약 250mg), 높은 수준의 운동성을 표시하고, 올바른 기능을 갖춘 실험을 위해 건강한 애벌레를 식별하고 선택하십시오. 뒤집을 때 스스로 를 돌수 있습니다.
  3. 무딘 엔드 핀셋을 사용하여 필터 페이퍼 층(94/15mm)이 늘어선 페트리 접시(그룹당 최소 20-30mm)를 무딘 엔드 핀셋을 사용하여 오염을 최소화하고 사용 전까지 실내 온도에서 보관하는 페트리 접시(그룹당 최소 20-30mm)를 조심스럽게 계산합니다.

3. BCG 럭스와 G. 멜로넬라 감염

  1. 오염 및 바늘 스틱 손상의 위험을 줄이기 위해 MSC 내의 혼란을 최소화합니다.
  2. 원형 필터 용지(94mm)를 평평한 올려지면에 테이핑하여 사출 플랫폼을 준비합니다. 연질 또는 단단한 표면을 사용할 수 있으며 피펫 상자 뚜껑 또는 나일론 수선 스폰지와 같은 사용자 선호도에 전적으로 의존합니다.
  3. 70% 에탄올 3부피를 흡입하여 25 μL 마이크로시링지(25G)를 멸균하고 3부로 멸균 된 PBS-T로 추가 헹구어 보시고.
  4. BCG 럭스 접종(섹션 1에서 제조) 또는 PBS-T의 10 μL을 멸균된 25 μL 마이크로시링제내로 흡인한다. PBS-T 음성 제어에 별도의 주사기를 사용합니다.
    참고: 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 10회 주사 후 BCG 럭스 접종을 다시 중단하십시오.
  5. 핀셋을 사용하여 유충 하나를 집어 들고 주입 플랫폼에 놓습니다.
  6. 플랫폼에서 애벌레를 등뒤로 뒤집어 핀셋으로 머리와 꼬리를 고정시켜 고정합니다. 애벌레의 머리에서 카운트 다운 마지막 왼쪽 proleg를 찾아 조심스럽게 수평 평면에 10-20 ° 각도로 바늘의 끝 (5−6mm)를 삽입합니다.
    참고: 짧고 좁은 핀셋은 애벌레의 응력을 최소화하면서 쉽게 고정할 수 있습니다. 창 자를 뚫고 비 BCG 럭스 특정 멜 라 늄 화 또는 죽음을 일으킬 수 있습니다 침투 를 통해 주의.
  7. 감염된 애벌레를 여과지 층이 늘어선 페트리 접시에 세면, 단일 90mm 페트리 접시는 최대 30개의 애벌레를 수용할 수 있다.
  8. 유충을 함유한 페트리 접시를 5% CO2로 37°C에서 인큐베이터 내부에 환기또는 밀봉되지 않은 어두운 상자에 보관한다.

4. 감염 다음 G. 멜로넬라의 생존을 모니터링

  1. 시간이 지남에 따라, 매 24 시간 마다 애벌레의 생존을 모니터링 합니다.

5. G. 멜로넬라에서 BCG 럭스의 생체 내 부담 측정

  1. 각 시점에서, 무작위로 섹션 3에서 이전에 제조 된 5 개의 감염된 애벌레를 선택하고 70 % 에탄올에 담근 면봉을 사용하여 애벌레 표면을 부드럽게 살균합니다.
    참고: 이 단계는 비 살균 된 유충이 오염으로 이어질 수 있기 때문에 균균 CFU 열거를 위해 애벌레 균질화를 도금 할 때 중요합니다.
  2. 애벌레를 멸균 PBS 800 μL을 함유하는 2 mL 포싱 매트릭스 튜브에 개별적으로 놓습니다.
  3. 6.0 m/s에서 60 s에 대 한 균질 화를 사용 하 여 애벌레를 균질화.
  4. 3,500 x g의 용해 튜브를 뚜껑에서 균질화를 제거하고 균질계를 멸균 광도계 튜브로 신중하게 디케이팅합니다.
    참고: CFU 열거(단계 5.7)의 경우 멸균 된 1.5 mL 반응 튜브에서 100 μL의 균질화를 예약해야합니다.
  5. 1 mL의 PBS-T 및 피펫으로 용해 매트릭스 튜브를 해당 발광계 튜브로 세척하여 남은 균질계를 회수합니다.
  6. 발광계 튜브를 소용돌이시키고 1.4단계에서 앞서 설명한 균질제의 생물발광을 측정하였다.
  7. PBS-T를 사용하여 24웰 배양 플레이트에서 동질계의 10배 직렬 희석을 준비합니다. 0.5% 글리세롤, 50 μg/mL 의 히그로마이신, 10% OADC 및 20 μg/mL 피페라실린을 함유한 미들브룩 7H11 한천 플레이트에 희석된 10 μL을 플레이트하여 생체 감염 시 다음 BCG 럭스의 RLU/CFU 비율을 결정합니다.
    참고: 피페라실린은 BCG lux16의최소한의 성장 억제로 네이티브 G. 멜로넬라 미생물을 제거합니다.

6. 통계분석

  1. 수집된 데이터를 사용하여 Kaplan-Meier 생존 곡선을 플롯하고 Mantel-Cox(로그 랭크) 테스트를 수행하여 결과의 유의를 결정합니다.

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Representative Results

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여기에서 우리는 G. mellonella를 사용하여 얻을 수 있는 대표적인 데이터를 제시합니다 - BCG 럭스 감염 모형 및 MTBC의 일원을 위한 감염 모형으로 G. mellonella의 이득을 강조합니다 (그림 1). 주요 기술 사항이 있는 실험 절차는 그림2에 설명되어 있습니다.

Figure 1
그림 1: 감염 모델로 G. 멜로넬라의 장점. 이 그림은 카바나와 시한(22)에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 실험 절차의 개요. (A) M. bovis BCG 럭스와감염에 대한 G. 멜로넬라의 유지 보수 및 준비 . (B) BCG 럭스 문화 및 감염에 대한 접종의 준비. (C) BCG 럭스와 G. 멜로넬라의 감염 . (D) G. 멜로넬라 애벌레에서 BCG 럭스의 독성 및 생체 내 부담의 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

BCG 럭스 투여량 의존성 독성은 G. 멜로넬라 유충에서 96시간 배양 기간(도 3)에 걸쳐 관찰되었고, 50% 애벌레 사망률(LD50)에필요한 치명적인 투여량은 1 x 107 CFU로 결정되었다. 시험된 BCG 럭스 투여량의 독성을 반영하는 생존 분포는 유의한 상이하였다(p&0.0001). 대조군은 PBS-T의 10 μL 용량으로 주입되거나 단순히 가시가 있는 바늘 부상을 시뮬레이트하여, 애벌레 건강에 영향을 미치지 않았거나 다른 시점에서 운동성 및 멜라늄화에 대한 관찰 적 검사에 의해 결정된 바와 같이 사망률의 증가로 이어지지 않았다.

Figure 3
그림 3: M. bovis BCG 럭스의다양한 접종에 대한 응답으로 G. 멜로넬라의 카플란-메이어 생존 곡선 . 건강한 애벌레 (그룹 당 n ≥ 10), BCG 럭스의다양한 용량으로 감염되었다. 애벌레는 37°C에서 배양하고 최대 96시간 동안 매 24시간마다 생존을 위해 모니터링하였다. 감염되지 않은 그룹은 PBS로 주입되었고, 가시가 있는 그룹(바늘만 삽입)은 애벌레 건강에 대한 바늘 손상의 효과를 입증하였다. 두 개의 독립적인 실험의 수단이 95% 신뢰 구간과 함께 접종에 해당하는 색상의 점선으로 표시됩니다. 이 수치는 Li 외16에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

BCG 럭스로 감염된 모든 애벌레는 시간이 지남에 따라 생리적 변화를 나타내고, BCG lux의 2 x 107 CFU 용량에 감염된 유충에 대해, 애벌레 등쪽 선의 멜라늄화는 48 시간 후 감염(pi)에서 관찰되었고, 체계적으로 관찰되었다. 멜라늄화는 96 hpi로부터 관찰되었다(도 4). 더욱이, 멜라화의 엄격과 사춘기에 애벌레의 능력에 의해 감소된 애벌레의 운동성은 감염되지 않은 통제와 비교하여 감염시 손실되었습니다.

Figure 4
그림 4: M. bovis BCG 럭스와감염에 대 한 응답에서 G. 멜로넬라의 멜라늄 . 0 시간에서 건강한 애벌레는 BCG 럭스의2 x 107 CFU 투여량에 감염되었다. 48 시간 및 96 h pi에서, 애벌레 등쪽 라인과 체계적인 멜라늄화를 따라 각각 멜라늄화가 관찰되었다.

G. 멜로넬라 유충 내 BCG 럭스의 생존은 애벌레 균질제의 생물 발광 측정을 통해 2주 동안 결정되었다. BCG 럭스의 1 x 107 CFU 투여량에 의한 감염은 0-72 h pi로부터 BCG 럭스 생물 발광의 초기 감소를 초래하였다. 그러나, 72-144 h pi에서, BCG 럭스 고원의 생물 발광은, 지속적인감염의 확립을 나타낸다 (그림 5).

Figure 5
그림 5: G. 멜로넬라에서 M. bovis BCG 럭스의 생체 내 부담은 2주 동안 의 생물 발광(상대광 단위, RLU/mL)을 사용하여 정량화하였다. 건강한 애벌레(n=30)는 BCG 럭스의1 x 107 CFU 투여량으로 감염되었다. 생체내 부담은 매 시점(0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h)에서 5마리의 애벌레를 균질화하고, 균질화의 생물발광을 측정함으로써 정량화되었다. 세 개의 독립적인 실험의 수단이 표시되고, 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. 이 그림은 Li 등 에서 전재되었습니다.16. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이러한 연구에서 생체 내 마이코박테리아 성장의 신속하고 재현 가능한 정량화는 생물 발광의 측정에 의해 결정되었기 때문에, RLU 및 CFU의 비율도 생체 내에서 결정되어야 한다. 우리의 특정 감염 시스템에서, RLU와 CFU의 생체 내 비율은 2:1-5:1에서, 168 시간 과정에 걸쳐 4:1의 평균으로(그림6).

Figure 6
그림 6: G. 멜로넬라에서 M. 보비스 BCG 럭스의 생체 내 RLU/CFU 비율을결정합니다. 건강한 애벌레(n=30)는 BCG 럭스의1 x 107 CFU 투여량으로 감염되었다. 각 시점(0, 24, 96 및 168h)에서 4개의 감염/제어(PBS-T) 유충을 균질화하고 균질제를 생물 발광을 측정하고 7H11 agar에 도금하여 CFU 수를 열거했습니다. 두 개의 독립적인 실험의 수단이 표시되고 오차 막대는 평균의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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감염 모델로 G. mellonella의 사용은 독성의 연구를위한 세균및 곰팡이 병원체의 수에 대해 설립되었다, 숙주 병원체 상호 작용, 및 새로운 치료법에 대한 화면으로10,22. 다음 논의는 MTBC에 대한 감염 모델로 G. 멜로넬라의 사용에 대한 실험 절차에 기초한다.

실험 전에 순진한 애벌레의 건강은 실험의 결과에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 변색 되거나 부상당한 유충은 도착 시 제거되며 실험에 사용되지 않는 것이 중요합니다. 도착 시 동일한 컨테이너 내에서 많은 수의 유충이 죽은 것으로 밝혀지면 기존의 감염이 사망의 원인이 될 수 있으므로 배치를 폐기하는 것이 좋습니다. 가능하면 구매/도착 당일에 가까운 애벌레를 사용하여 실험을 수행하십시오. 사용하기 전에 유충을 18°C에 저장하여 사춘기를 방지하고 실험에 사용할 수 있는 애벌레의 수를 최대화한다. 건강한 애벌레는 배달/구매 후 최대 7일 동안 사용할 수 있습니다. 감염 후, 아직 알려지지 않은 이유로, 죽은 애벌레의 존재는 샘플 집단에서 사망률을 증가시키는 것으로 나타나므로 페트리 접시에서 죽은 애벌레를 제거해야합니다. 자가 사육 유충의 사용자에 대 한, 구입 한 애벌레에 비해 생물학적 가변성을 인식 하는 것이 중요 하다, 식이 요법과 성장 조건에 차이가 애벌레 면역에 영향을 미칠 수 있습니다 21,23. 실험간 가변성은 실험 간에 일관되게 사육된 유충의 공급원, 또는 사료 및 성장 조건을 유지함으로써 제한될 수 있다. 모든 실험에서 '공백'과 '찌르기' 부정적인 컨트롤을 포함해야 합니다. 블랭크 컨트롤은 현탁액 매트릭스(PBS-T 또는 매체 국물)의 오염 또는 독성을 나타내는 지표이며, 가시 제어는 애벌레 건강에 대한 바늘 손상의 효과를 모방합니다. 또한, 이러한 대조군은 유충 배치 사이의 생물학적 변이를 정상화하여 실험 간의 재현성과 정확성을 보장합니다.

G. mellonella 애벌레의 주입을 위해, 큰 게이지 바늘은 과도한 출혈을 일으킬 수 있고 더 선명한 작은 게이지 바늘은 애벌레의 창자를 쉽게 뚫을 수 있기 때문에 25 G 바늘의 사용은 유충 사망률과 거짓 양성으로 이끌어 냅니다. 결과. 바늘 주입의 전통적인 방법은 전형적으로 바늘 상해의 리스크를 증가시키는 손으로 애벌레를 고정시킵니다. 족집게를 사용하여 유충을 고정시킴으로써, 바늘 스틱 손상의 위험은 손이 감염 도중 어떤 시점에서 바늘에 근접하지 않기 때문에 현저하게 감소됩니다. 양자택일로, 애벌레는 냉각에 의해 고정화될 수 있었습니다. 그러나, 감염 전 15분 동안 12°C에서의 감기 충격은 감염에 대한 선천적인 면역 반응을 향상시키기 위해 문서화되었다. 따라서 냉각을 통해 얻은 결과의 분석은 그영향(24)을신중하게 고려해야 한다. 우리의 기술을 사용하여, 주입의 중간 처리량 (분당 2−3 애벌레) 사용자 연습으로 달성 될 수있다; 이것은 우리의 경험 (분 당 3−4 유충)에서 기존의 주입의 속도와 비교된다. 또한, 우리의 방법은 25G 나비 캐뉼라에 연결된 일회용 주사기주입 펌프로 구성된 페달 작동 주입 플랫폼을 활용하여 더 높은 처리량 주입을 위해 적응할 수 있습니다.

BCG 럭스 접종의 제제는 진균 배양부(20)의 RLU를 이용한CFU의 신속한 추정에 기초한다. 국물 문화에 대한 우리의 경험에서, CFU에 RLU의 비율은 3:120, G. mellonella에서 성장하는 BCG 럭스와 대조되는 CFU 비율은 5:120입니다. 조밀한 배양물에서 흔히 볼 수 있는 마이코박테리아 세포 응집 또는 '응집'은 응집이 신뢰할 수 없는 생물 발광 측정을 초래할 수 있기 때문에 RLU 측정에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 접종 제제에 응집 된 진균 배양을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 그러나, 증생매체에 폴리소르베이트(80)를 첨가하면 BCG 럭스의성장을 변화시가지 않고 세포 뭉침을 최소화한다. 16 모든 사소한 세포 응집은 PBS-T로 배양을 세척함으로써 해결될 수 있으며 판독으로 RLU를 사용하여 정확한 접종을 준비하는 데 필수적입니다. 또한, PBS-T 세척은 성장 중에 분비되는 세포외 독성 인자를 제거하는 데 필수적입니다. 진균 균주 및 통로 번호도 고려해야 합니다., 이 진균 응집의 심각도 영향을 미칠 수 있습니다25. 모든 경우에, 접종은 생물 발광 측정에 의해 정확한 CFU가 준비되었는지 확인하기 위하여 7H11 한천 격막에 CFU에 의해 기예되어야 합니다. 또한 생체 내 RLU/CFU 비율은 새로운 생물 발광 리포터 또는 주식으로 결정되어야 하며, 비율은 다를 수 있습니다.

G. mellonella는 특히 생물 발광 균주16과함께 저렴한 획득 및 유지 보수 비용, 감염 및 연구 처리량의 용이성을 포함하여 TB 감염의 기존 모델에 비해 몇 가지 장점을 보유하고 있습니다. 윤리적 제약의 부족은 포유류 모델에 비해 더 큰 샘플 크기 (그룹 당 최소 20-30 유충)를 허용,26,27얻은 결과에 더 큰 자신감과 신뢰성을 제공. 그러나, 감염 모델로 G. mellonella의 사용에 제한이 있다. 무척추 동물로서, 그들은 자연적으로 항원성 또는 면역 학적 연구10에적합하지 않은 적응 면역이 부족합니다. G. 멜로넬라의 세포 선천성 면역 반응은 다수의 혈세포 유형으로 구성되며, 혈장세포 및 과립구는 포유류 식세포(호중구 및 대식세포)와 유사하게 작용하도록 보고되었다 12. 그러나, 이 세포 모형의 역할 그리고 기계장치는 특징에 따라 남아 있고, 포유류와 곤충 식세포 사이 직접적인 비교 연구 결과는 아직 수행될 수 있습니다. 게다가, 주석이 추가된 G. mellonella 게놈의 부족은 감염에 호스트 반응의 분석을 방해하고, 이것은 현재 Drosophila와 같은 그밖 무척추 동물의 전사체 라이브러리에 대하여 유전자 온톨로지 분석에 의존합니다 멜라노가스터와 봄비엑스 모리28.

결핵 감염 모델로서, G. mellonella는 결핵 감염의 중요한 병리생리학적 특징인 BCG 럭스 감염16에응하여 육아종 과 같은 구조물을 개발하는 그것의 기능을 가진 유망한 미래를 보유하고 있습니다 LTBI의 개발에 기능. 향후 작업은 CL3 조건하에서 참조, 임상 및 돌연변이 Mtb 분리를 사용하여 육아종 유사 구조의 형성에 특별한 관심을 가지고 이 모델을 특성화하는 것을 목표로 할 것이다. 추가적으로, 우리는 또한 유사한 G. mellonella 모형이 NTMs18를위해 이용되었기 때문에, 새로운 항균제 검열을 위해 유용할 지도 모르다 예상합니다, 그러나 이것은 결정될 남아 있습니다. 이 모형의 채택은 극적으로 윤리적으로 더 수용가능한 조건 하에서 생체 내 결핵 연구 출력을 가속화하는 동안, 결핵 연구 지역 사회 내의 사용된 동물의 수를 현저하게 감소시키는 기능이 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 프로젝트는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회 (BBSRC)의 보조금에 의해 지원되었다, PRL및 YL에 수여 (BB / P001262/1), 및 연구에 동물의 교체, 정제 및 감소를위한 국립 센터 (NC3Rs) PRL에 수여, SMN, BDR 및 YL(NC/R001596/1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tube (Eppendorf) Eppendorf 22431021
20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips Any supplier n/a
24 well culture plate Greiner 662160
25 mL pipettes and pipette boy Any supplier n/a
3 compartment Petri dish (94/15 mm) Greiner 637102
Centrifuge Any supplier n/a
Class II saftey cabinet Any supplier n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) Corning CLS40183
Ethanol (>99.7%) VWR 208221.321
Galleria mellonella (250 per pk) Livefood Direct UK W250
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) MP Biomedicals 116005500
Hygromycin B Corning 30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953) Berthold 34622
Luminometer tubes Corning 352054
Lysing matrix (S, 2.0 mL) MP Biomedicals 116925500
Micro syringe (25 µL, 25 G) SGE 3000
Microcentrifuge Any supplier n/a
Middlebrook 7H11 agar BD Bioscience 283810
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience 271310
Middlebrook ADC enrichment BD Bioscience 212352
Middlebrook OADC enrichment BD Bioscience 212240
Mycobacterium bovis BCG lux Various n/a
n-decyl aldehyde Sigma-Aldrich D7384-100G
Orbital shaking incubator Any supplier n/a
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80) Sigma-Aldrich P8074-500ml
Small box Any supplier n/a dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer Any supplier n/a Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08) Berthold n/a Program LB953.TTB
Petri dish (94/15 mm) Greiner 633181
Filter paper (94 mm) Any supplier n/a Cut to fit

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References

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결핵 균복합체를 연구하기 위한 감염 모델로 무척추동물 갤러리아 멜로넬라 사용 <em></em> <em></em>
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Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).More

Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).

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