Summary
Galleria mellonella была недавно создана как воспроизводимая, дешевая и этически приемлемая модель инфекции для комплекса mycobacterium tuberculosis. Здесь мы описываем и демонстрируем шаги, предпринятые для создания успешной инфекции G. mellonella с биолюминесцентными Mycobacterium bovis BCG lux.
Abstract
Туберкулез является ведущей глобальной причиной смертности от инфекционных заболеваний, и считается, что примерно четверть населения мира инфицирована туберкулезом микобактерий. Несмотря на десятилетия исследований, многие из механизмов успеха М. туберкулеза как патогенного организма еще предстоит изучить, и разработка более безопасных, более эффективных антимикобактериальных препаратов срочно необходимы для решения проблемы роста и распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза. Тем не менее, прогрессирование исследований туберкулеза является узким местом традиционных моделей инфекции млекопитающих, которые являются дорогостоящими, трудоемкими и этически сложными. Ранее мы создали личинки насекомого Galleria mellonella (большая восковая моль) как новую, воспроизводимую, низкую стоимость, высокопроизводительную и этически приемлемую модель инфекции для членов туберкулезного комплекса М. Здесь мы описываем техническое обслуживание, подготовку и инфекцию G. mellonella с биолюминесцентным Mycobacterium bovis BCG lux. Используя эту модель инфекции, микобактериальная доза зависимой вирулентности можно наблюдать, и быстрое считывание in vivo микобактериальной нагрузки с использованием измерений биолюминесценции легко достижимо и воспроизводимо. Хотя существуют ограничения, такие как отсутствие полностью аннотированного генома для транскриптомического анализа, онтологический анализ против генетически похожих насекомых может быть проведен. Как низкая стоимость, быстрая и этически приемлемая модель для туберкулеза, G. mellonella может быть использован в качестве предварительного скрининга для определения эффективности и токсичности препарата, а также для определения сравнительной микобактериальной вирулентности до использования обычных млекопитающих Модели. Использование модели G. mellonella-mycobacteriaприведет к сокращению значительного числа животных, используемых в настоящее время в исследованиях туберкулеза.
Introduction
Туберкулез (ТБ) представляет собой серьезную угрозу для глобального общественного здравоохранения: 9 миллионов новых случаев заболевания в год и 1,5 миллиона случаев смерти1. Кроме того, по оценкам, четверть населения мира инфицирована возбудительным агентом болезни, Микобактерия туберкулеза (Mtb). Среди инфицированного населения в течение жизни у 5–10% будет развиваться активное заболевание туберкулезом. Кроме того, появление и распространение множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широко лекарственной (ШлУ) резистентной МТБ представляет собой серьезную угрозу для борьбы с болезнями, при этом 123 страны сообщают по крайней мере об одном случае ШЛУ1. Для лечения туберкулеза требуется коктейль из не менее четырех антимикобактериальных препаратов, из которых изониазид и рифампицин назначаются на минимальный срок в шесть месяцев; лечение часто связано со сложными побочными эффектами и токсичности. Защита от единственной лицензированной вакцины против туберкулеза, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Gu'rin (BCG), является переменной2. Неполное понимание патогенеза туберкулеза существенно затрудняет разработку новых терапевтических стратегий и стратегий вакцинации.
На протяжении десятилетий модели инфекции животных имеют жизненно важное значение для исследования туберкулеза, чтобы понять основной патогенез и принимающей ответ на инфекцию, а также оценить новые анти-микобактериальные агенты, иммуно-терапевтические и новые кандидаты вакцины3, 4.Однако исследования с использованием моделей инфекции животных тб, как известно, трудно, как патогенез и прогрессирование туберкулезной инфекции являются сложными, и нет единой модели животных, которая имитирует весь спектр и важные особенности болезни5 ,6. Кроме того, эксперименты на животных являются дорогостоящими, отнимают много времени и требуют полного этического обоснования. Тем не менее, модели инфекции животных туберкулеза были описаны у нечеловеческих приматов (например, макаки), морских свинок, кроликов, крупного рогатого скота, свиней, мышей и зебры, причем каждый из них имеет свои ограничения3,4. Модель мурина является наиболее часто используемой моделью из-за стоимости, наличия инбредных линий, воспроизводимости инфекции и обилия иммунологических реагентов. Однако, они обычно не образуют гранулемы, связанные с областями гипоксии, которые характерны для скрытой туберкулезной инфекции (LTBI)6. Гвинейские свиньи очень восприимчивы к инфекции Mtb, с патологией и ранним образованием гранулемы, аналогичным и тем, которые существуют у людей, и широко используются в тестировании вакцин; однако отсутствие иммунологических реагентов затрудняет ихиспользование в качестве инфекционной модели 7. Зебрафиш подходит для крупномасштабного скрининга на ранних стадиях доклинических исследований из-за их небольшого размера, быстрого размножения и передовых генетических инструментов, но анатомически и физиологически отличаются от человека и только восприимчивы к Микобактерия маринум инфекции3. Модели животных, наиболее похожие на человеческую инфекцию Mtb являются нечеловеческими приматами (например, макаки), но они дороги ею и имеют значительные этические и практические соображения, которые значительно ограничивают их использование8.
Личинки насекомых больше йош ной или сот моли, Galleria mellonella, становятся все более популярными в качестве модели инфекции для различных бактериальных и грибковых патогенов9, и в качестве экрана для новых кандидатов противомикробных препаратов наркотиков 10. G. mellonella является успешной моделью беспозвоночных из-за своей сложной врожденной иммунной системы (состоящей из клеточной и гуморальной защиты), которая разделяет высокую степень структурного и функционального сходства с позвоночными11 . Это включает в себя иммунные механизмы, такие как фагоцитоз патогенных микроорганизмов гемоцитами (функционально похожие на млекопитающих макрофага и нейтрофилов)12,13, производство и циркуляция антимикробных пептидов (АМП) и дополняют белки в гемолимфе (аналог крови млекопитающих) G. mellonella11. Другие преимущества9,14,15 личинок G. mellonella в качестве модели включают 1) их большой размер (20-30 мм), который позволяет легко манипуляции и инфекции, а также сбор тканей и гемолимфа для анализа, 2) легкое обслуживание при 37 градусах Цельсия, совместимое для изучения патогенных микроорганизмов человека, 3) точная инфекция путем инъекций без необходимости анестезии, 4) эффективность противомикробных препаратов может быть оценена с использованием меньше госпрепарата для оценки, 5) отсутствие этические ограничения по сравнению с использованием млекопитающих, 6) большие размеры группы могут быть использованы по сравнению с животными моделями, позволяющими большую воспроизводимость, и 7) более короткое время для экспериментов инфекции не требуется.
В недавнем исследовании, мы показали, что G. mellonella может быть использован в качестве новой модели инфекции для изучения патогенеза инфекции биолюминесцентных M. bovis BCG люкс, генетически модифицированная версия штамма вакцины и член комплекса Mtb (MTBC)16. В то время как G. mellonella ранее использовалась в качестве модели инфекции для нетуберкулезных микобактерий (NTM), в основном M. marinum и Mycobacterium abscessus17,18, исследования с использованием MTBC ограничены что Ли и др.16. Биолюминесцентные непатогенные микобактериальные штаммы, которые могут быть использованы на уровне сдерживания (CL) 2 в качестве суррогата Для Mtb, предлагают преимущества безопасности и практичности по сравнению с патогенными микобактериями. После заражения BCG lux, личинки начинают развивать ранние гранулемы-подобные структуры, которые могли бы дать ценную информацию о роли врожденного иммунитета в создании туберкулезной инфекции16. Кроме того, эта простая модель инфекции беспозвоночных может обеспечить быструю, недорогостоящую и надежную оценку патогенеза туберкулеза, включающую контролируемые вызовы и множественные репликации для воспроизводимости. Кроме того, эта модель может быть использована для скрининга новых противотуберкулезных препаратов и вакцин кандидатов в раннем развитии, что сокращает общее число животных в экспериментах. Способность измерять изменения в структуре хозяина и патогена, транскриптоме и протеоме для определения целей лекарств и оценки механизмов действия новых препаратов и терапевтических вакцин также выгодна.
Здесь мы описываем экспериментальные протоколы для подготовки биолюминесцентных M. bovis BCG lux inoculum и G. mellonella личинок для микобактериальной инфекции, а также определение как личинки, так и микобактерии выживаемости в ответ на инфекцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы, описанные ниже, должны быть выполнены в лаборатории CL2 в классе 2 микробиологической безопасности кабинета (MSC) в соответствии с местными стандартами здоровья и безопасности.
1. Подготовка M. bovis BCG lux для инфекции
- Разморозить замороженный 1,2 мл глицерола (15%) запас M. bovis BCG люкс, Монреаль вакцины штамм преобразован с челноч plasmid pSMT1 проведения luxAB генов от Vibrio harveyi кодирования фермента люциферазы19.
- Прививать 15 мл бульона Middlebrook 7H9, содержащего 0,2% глицерола, 10% альбумина, декстрозу, каталазу (ADC) обогащения и 50 мкг/мл гигромицина с размороженной 1,2 мл аликво из BCG lux, в маркированной 250 мл эрленмейерской флящи.
- Поместите колбу в герметичную биобезопасность контейнера и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в орбитальном шейкер-инкубаторе при 220 об/мин при 72 ч (или до тех пор, пока культура не достигнет середины этапа роста).
- Проверьте рост культуры BCG lux, подготовив 1:10 разбавления культуры в люминометрических трубках с использованием фосфатного буферного соления (PBS, pH 7.4, 0.01 M фосфатный буфер, 0.0027 M хлорид калия и 0.137 M хлорид натрия) в дубликате. Vortex, и загрузить люминометр труб в светинометр и измерить биолюминесценции (относительная световая единица "RLU"/mL) с использованием n-decyl альдегида в качестве субстрата (1% v/v в абсолютном этаноле)20.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение RLU / колонии формирования единиц (CFU) ранее было определено, чтобы быть 3:1, когда BCG люкс был выращен в пробирке в Миддлбрук 7H9 бульон20. - Центрифуга культуры на 2175 х г в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы гранулы клетки и отказаться от супернатанта в соответствующий дезинфицирующее средство с известными микобактерии деятельности. Утилизировать все культурные отходы с дезинфицирующими средствами, подходящими для микобактерий в соответствии с местными руководящими принципами.
- Вымойте клеточные гранулы дважды в PBS, содержащий 0,05% полисорбат 80 (PBS-T), чтобы предотвратить бактериальную слипания.
- После окончательной стирки, декантотходов супернатанта, resuspend микобактериальные гранулы клетки в PBS-T и разбавить микобактериальную подвеску до желаемой плотности клеток с помощью измерений RLU.
- Приготовьте десятикратные серийные разбавления инокулума в 24-колодцах пластин с помощью PBS-T. Плита из 10 л на Middlebrook 7H11 агар пластин (0,5% глицерола, 50 мкг/мл гигромицин, 10% олеиновой кислоты, альбумина, декстроза, каталаза "OADC") в дублировать, чтобы перечислить инокула CFU рассчитывает.
2. Подготовка G. mellonella Larvae
- Покупка последних личинок instar из соответствующих источников и поддерживать личинки в темноте при 18 градусов по прибытии и использовать в течение 1 недели после покупки. Кроме того, личинки могут быть самостоятельно воспитаны в соответствии с протоколом Joj'o et al.21. Для приобретенных личинок, отбросить любые мертвые, обесцвеченные или окунающих личинок до хранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Укудные личинки морфологически различимы до последних личинок instar. - Определите и выберите здоровые личинки для экспериментов, основанные на равномерном кремовом цвете с практически без обесцвечивания (меланизация), размер (2'3 см в длину), вес (приблизительно 250 мг), демонстрируя высокий уровень подвижности, и обладая способностью правильно себя, когда перевернулся.
- Тщательно подсчитайте здоровые личинки (минимум 20-30 на группу) в чашку Петри (94/15 мм), облицованную слоем фильтровальной бумаги (94/15 мм), используя тупой пинцет, чтобы свести к минимуму загрязнение и хранить при комнатной температуре в темноте до использования.
3. Заражение G. mellonella с BCG люкс
- Свести к минимуму беспорядок в MSC, чтобы уменьшить риск загрязнения и травмы иглы палкой.
- Подготовьте инъекционную платформу, прикрепив круглую фильтровальную бумагу (94 мм) к плоской приподнятой поверхности. Мягкие или твердые поверхности могут быть использованы и полностью зависит от предпочтений пользователя, например, крышки пипетки коробки или нейлоновой губки.
- Стерилизовать микрозыринг 25 л (25 G) путем усыпления 3 тома 70% этанола и дальнейшего промыть с 3 томами стерильных PBS-T.
- Аспир 10 Зл инокулума BCG lux (подготовлен в разделе 1) или PBS-T в стерилизованный микросиринг 25 ЛЛ. Используйте отдельный шприц для отрицательного контроля PBS-T.
ПРИМЕЧАНИЕ: Resuspend BCG lux inoculum после 10 инъекций, чтобы обеспечить однородную суспензию клеток. - Используйте пинцет, чтобы забрать одну личинку и поместить на платформу инъекций.
- На платформе, переверните личинку на спину и обездвижить, закрепив голову и хвост с помощью пинцета. Найдите последнюю левую пролегную отсчет от головы личинки и осторожно вставьте кончик иглы (5-6 мм) под углом 10–20 градусов к горизонтальной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Короткие и узкие пинцеты позволяют легко импровизировать при минимальном личинке стресса. Обратите внимание не более проникают, которые могут проколоть кишечник и вызвать не-BCG люкс специфической меланизации или смерти. - Подсчитайте инфицированных личинок в чашку Петри, облицованную слоем фильтровальной бумаги, в одной тарелке Петри 90 мм может вместить до 30 личинок.
- Храните чашку Петри, содержащую личинки в вентилируемой или незапечатанной темнойкоробке внутри инкубатора при 37 градусах Цельсия с 5% CO 2.
4. Мониторинг выживаемости G. mellonella после заражения
- С течением времени, контролировать выживание личинок каждые 24 ч. Larvae считаются мертвыми, когда они не могут двигаться в ответ на ощупь.
5. Измерение In Vivo бремя BCG люкс в G. mellonella
- В каждый момент времени, случайным образом выбрать пять инфицированных личинок, ранее подготовленных в разделе 3 и мягко стерилизовать личиночных поверхностей с помощью ватных тампонов пропитанной 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет важное значение при облицовке личиночного гомената для перечисления микобактерии CFU, так как нестерилизованные личинки могут привести к загрязнению. - Поместите личинки индивидуально в 2 мл лизидных матричных трубок, содержащих 800 л стерильных PBS.
- Гомогенизировать личинки с помощью гомогенизатора на 60 с при 6,0 м/с.
- Centrifuge лизидных труб оков на 3500 х г в течение 5 с, чтобы удалить гомогенат из крышки, и тщательно decant гомогенат в стерильные луминозетерные трубки индивидуально.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для перечисления CFU (шаг 5.7) обеспечить резервирование 100 л гомегената в стерильной реакционной трубке 1,5 мл. - Восстановить все оставшиеся гомогенаты путем мытья лизинговых матричных труб с 1 мл PBS-T и пипетки в соответствующих люминометрических труб.
- Vortex светилометровых труб и измерить биолюминесценцию гомогенатов ранее описано в шаге 1.4.
- Приготовьте десятикратные серийные разбавления гомената в 24-ну колодцевую культурную пластину с помощью PBS-T. Плита из 10 л разбавления на Middlebrook 7H11 агар пластин, содержащих 0,5% глицерола, 50 мкг /мЛ гигромицин, 10% OADC и 20 мкг /мЛ пиперациллин, чтобы определить rLU /CFU соотношение BCG люкс следующие в виво инфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пиперациллин устраняет родную микробиоту G. mellonella с минимальным ингибированием роста BCG lux16.
6. Статистический анализ
- Участок каплан-Мейер кривой выживания с использованием данных, собранных и выполнять Mantel-Cox (Лог-рейтинг) тест, чтобы определить значение результата, где "p йlt; 0,05, йп йlt; 0,01, йп злт; 0,001, и "p"
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем репрезентативные данные, которые могут быть получены с помощью G. mellonella - BCG lux инфекции модели и выделить преимущества G. mellonella как инфекционная модель для членов MTBC (Рисунок 1). Экспериментальные процедуры с ключевыми техническими моментами изложены на рисунке 2.
Рисунок 1: Преимущества G. mellonella как модели инфекции. Эта цифра была адаптирована из Кавана и Шихан22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Описание экспериментальных процедур. (A) Обслуживание и подготовка G. mellonella для заражения с M. bovis BCG lux. (B) Подготовка BCG люкс культуры и инокулума для инфекции. (C) Инфекция G. mellonella с BCG lux. (D) Измерение вирулентности и in vivo бремя BCG люкс в G. личинки меллонелла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
BCG lux дозы зависимой вирулентности наблюдалась в G. mellonella личинок в течение 96 ч инкубационный период (рисунок3), и смертельная доза, необходимая для 50% личиночной смертности (LD50) было определено, чтобы быть 1 х 107 CFU. Распределение выживаемости, отражающее вирулентность проверенных доз BCG lux, значительно отличалось (p qlt; 0.0001). Контрольные группы вводили с дозой 10 Л Л PBS-T или те, просто кололи имитирующие повреждения иглы, не влияют на здоровье личинок или приводят к увеличению смертности, как это определено наблюдениями за подвижность и меланизации в разных точках времени.
Рисунок 3: Каплан-Меир кривой выживания G. mellonella в ответ на различные инокула M. bovis BCG люкс. Здоровые личинки (n 10 на группу), были инфицированы с различными дозами BCG люкс. Larvae были инкубированы при 37 градусах Цельсия и контролировались на выживание каждые 24 ч на протяжении до 96 ч. Неинфицированная группа была введена с PBS, и уколная группа (вставка только иглы) продемонстрировала влияние повреждения иглы на здоровье личинок. Показаны средства двух независимых экспериментов с 95% доверительным интервалом, представленными в виде пунктирных линий соответствующего цвета инокулума. Эта цифра была адаптирована из Li et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Все личинки, инфицированные BCG lux отображается физиологические изменения с течением времени и, для личинок, инфицированных 2 х 107 CFU дозу BCG люкс, меланизм личинки дорсальной линии наблюдалась от 48 ч после инфекции (пи), и систематической меланизация наблюдалась с 96 ч пи(рисунок 4). Кроме того, подвижность личинок снижается с тяжестью меланизации и способность личинок освящаться была потеряна при инфекции по сравнению с неинфицированными контроля.
Рисунок 4: Меланизация G. mellonella в ответ на инфекцию с M. bovis BCG люкс. Здоровые личинки на 0 ч были инфицированы 2 х 107 CFU дозы BCG люкс. При 48 ч и 96 ч пи наблюдалась меланизация вдоль личинки по линии доза и систематическая меланизация, соответственно.
Выживание BCG lux в личинках G. mellonella было определено в течение 2 недель с помощью измерения биолюминесценции личинок гомогенных. Инфекция с дозой 1 х 107 CFU BCG lux привела к первоначальному снижению биолюминесценции BCG lux с 0-72 ч пи. Тем не менее, с 72-144 ч пи, биолюминесценция BCG lux плато, что свидетельствует о создании стойких инфекции (Рисунок 5).
Рисунок 5: In vivo бремя M. bovis BCG люкс в G. mellonella количественно с использованием биолюминесценции (относительная единица света, RLU/mL) в течение двух недель курса времени. Здоровые личинки (n No 30) были инфицированы 1 х 107 CFU дозой BCG lux. Бремя In vivo оценивалось путем гомогенизации пяти личинок в каждой временной точке (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 ч) и измерения биолюминесценции гомогената. Показаны средства трех независимых экспериментов, а бары ошибок представляют собой стандартное отклонение среднего значения. Эта цифра была перепечатана из Li et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Поскольку быстрая и воспроизводимая количественная количественная оценка роста микобактерий in vivo в этих исследованиях определялась измерением биолюминесценции, соотношение RLU и CFU также должно быть определено in vivo. В нашей конкретной инфекционной системе соотношение in vivo RLU и CFU колебалось от 2:1-5:1, в среднем 4:1 в течение 168-h времени курса(рисунок 6).
Рисунок 6: Определение соотношения in vivo RLU/CFU M. bovis BCG lux в G. mellonella. Здоровые личинки (n No 30) были инфицированы 1 х 107 CFU дозой BCG lux. В каждый момент времени (0, 24, 96 и 168 ч), четыре инфицированных / контроль (PBS-T) личинки были гомогенизированы, и гомогенаты были измерены для биолюминесценции и покрытием на 7H11 агар для перечисления CFU рассчитывает. Показаны средства двух независимых экспериментов, а бары ошибок представляют собой стандартное отклонение среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование G. mellonella в качестве модели инфекции была создана для ряда бактериальных и грибковых патогенов для изучения вирулентности, взаимодействия хозяина-патогена, а также в качестве экрана для новых терапевтических 10,22. Следующее обсуждение основано на экспериментальной процедуре использования G. mellonella в качестве модели инфекции для MTBC.
Здоровье наивных личинок до экспериментов может оказать значительное влияние на исход эксперимента. Поэтому крайне важно, чтобы любые обесцвеченные и/или поврежденные личинки удалялись по прибытии и не использовались для экспериментов. Если большое количество личинок найдены мертвыми в том же контейнере по прибытии, желательно отказаться от партии, как уже существующие инфекции могут быть причиной смерти. При возможности выполнить эксперименты с использованием личинок как можно ближе к дню покупки / прибытия. Перед использованием убедитесь, что для хранения личинок при 18 градусах Цельсия, чтобы предотвратить освящение и максимизировать количество личинок, доступных для экспериментов. Здоровые личинки могут быть использованы в течение 7 дней после доставки / покупки. После инфекции, убедитесь, чтобы удалить любые мертвые личинки из чашки Петри, как, по пока неизвестным причинам, наличие мертвых личинок, как представляется, увеличение смертности в выборке населения. Для пользователей самостоятельно выращенных личинок, важно быть в курсе биологической изменчивости по сравнению с приобретенными личинками, так как дисперсия в диете и условиях роста может оказать влияние на личиночной иммунитет21,23. Межэкспериментальные изменчивости могут быть ограничены, сохраняя источник, если приобретены, или корма и условия роста выращенных личинок последовательной между экспериментами. Во всех экспериментах важное значение имеет включение "пустых" и "колючих" отрицательных мер контроля; пустой контроль является индикатором загрязнения или токсичности суспензии матрицы (PBS-T или медиа-бульон), а уколотый контроль имитирует влияние повреждения иглы на здоровье личинок. Кроме того, эти меры контроля нормализуют любые биологические различия между партиями личинок, обеспечивая воспроизводимость и точность между экспериментами.
Для инъекций личинки G. mellonella, использование 25 G иглы рекомендуется как большие иглы калибровочных может вызвать чрезмерное кровотечение и острее меньше калибровочных игл может легко проколоть кишечник личинок, что приводит к гибели личинок и ложноположительных Результаты. Обычные методы инъекции иглы обычно обездвиживают личинки вручную, что повышает риск повреждения иглой. С помощью пинцета для обездвиживания личинок, риск травмы иглы палкой значительно снижается, как рука не находится в непосредственной близости от иглы в любой момент во время инфекции. Кроме того, личинки могут быть обездвижены путем охлаждения. Тем не менее, холодный шок при 12 градусах По Цельсию в течение 15 минут до заражения был задокументирован для повышения врожденного иммунного ответа на инфекцию. Поэтому при анализе результатов, полученных с помощью охлаждения, следует тщательно рассмотреть его воздействие24. Используя нашу технику, средняя пропускная их часть инъекций (2х3 личинки в минуту) может быть достигнута с помощью пользовательской практики; это сопоставимо со скоростью обычных инъекций из нашего опыта (3–4 личинки на мин). Кроме того, наш метод может быть адаптирован для более высокой пропускной записи инъекций с помощью педаль работает инъекционные платформы, состоящей из инфузионного насоса с одноразовым шприцем, подключенным к 25 G бабочка канюла.
Подготовка bcG lux inoculum основана на быстрой оценке CFU с использованием RLU микобактериальной культуры20. По нашему опыту с культурой бульона, соотношение RLU к CFU составляет 3:120, в отличие от BCG люкс растет в G. mellonella, где RLU к CFU соотношение 5:120. Микобактериальная агрегация клеток или "слипание", обычно наблюдаемые в плотных культурах, могут оказывать влияние на измерения RLU, так как слипание может привести к ненадежным измерениям биолюминесценции. Таким образом, использование слипается микобактериальной культуры для подготовки инокулума не рекомендуется. Тем не менее, добавление полисорбат атакжем к медиано-краттем сводят к минимуму слипание клеток, не изменяя роста BCG lux. 16 Любые незначительные ячейки слипания могут быть решены путем мытья культуры с PBS-T и имеет жизненно важное значение для подготовки точного инокулума с помощью RLU в качестве считывания. Кроме того, pbS-T мыть имеет жизненно важное значение для удаления любого внеклеточного фактора вирулентности выделяется во время роста. Микобактериальный штамм и номер прохода также должны быть приняты во внимание, так как это может повлиять на тяжесть микобактериальной агрегации25. Во всех случаях инокулум должен быть перечислен CFU на агарных пластинах 7H11, чтобы убедиться, что правильный CFU был подготовлен путем измерения биолюминесценции. Кроме того, соотношение RLU/CFU in vivo должно определяться с помощью нового биолюминесцентного репортера или запасов, так как соотношение, скорее всего, будет меняться.
G. mellonella имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными моделями туберкулезной инфекции, включая более дешевые расходы на приобретение и техническое обслуживание, простоту инфекции и пропускную силу исследований, особенно в сочетании с биолюминесцентными штаммами16. Отсутствие этических ограничений позволяет увеличить размер выборки (минимум 20-30 личинок на группу) по сравнению с моделями млекопитающих, что дает большую уверенность и надежность в полученных результатах26,27. Тем не менее, Есть ряд ограничений в использовании G. mellonella в качестве модели инфекции. Как беспозвоночные, они, естественно, не хватает адаптивного иммунитета, что делает их непригодными для антигенности или иммунологических исследований10. Клеточные врожденные иммунные реакции G. mellonella состоят из ряда типов гемоцитов, а плазматоциты и гранулоциты, как сообщается, функционируют аналогично фагоцитам млекопитающих (нейтрофилов и макрофагов)12. Однако роль и механизмы этих типов клеток по-прежнему характеризуются, и прямые сравнительные исследования между млекопитающими и фагоцитами насекомых еще предстоит провести. Кроме того, отсутствие аннотированного генома G. mellonella препятствует анализу реакции хозяина на инфекцию, и это в настоящее время зависит от генного онтологического анализа против транскриптомических библиотек других беспозвоночных, таких как Дрозофила меланогастер и Bombyx мори28.
Как модель инфекции туберкулеза, G. mellonella имеет многообещающее будущее с его способностью развивать гранулетомоподобные структуры в ответ на инфекцию BCG lux 16, которые являются жизненно важными патофизиологическими признаками тб-инфекции и являются ключевыми функция в развитии LTBI. Будущая работа будет направлена на характеристику этой модели с особым интересом к формированию грануломоподобных структур с использованием эталонных, клинических изолятов Mtb в условиях CL3. Кроме того, мы ожидаем, что он также может быть полезным для новых анти-микобактериальный агент скрининга, как аналогичные модели G. mellonella был использован для NTMs18, но это еще предстоит определить. Принятие этой модели имеет возможность значительно сократить число животных, используемых в научно-исследовательском сообществе по борьбе с туберкулезом, одновременно ускоряя результаты исследований в виво-ТБ в этически более приемлемых условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан грантами От Совета по исследованиям в области биотехнологии и биологических наук (BBSRC), присуждаемого PRL и YL (BB/P001262/1), и Национального центра по замене, переработке и сокращению животных в научных исследованиях (NC3Rs), присуждаемого PRL, SMN, BDR и YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
