Summary
Galleria mellonella etablerades nyligen som en reproducerbar, billig och etiskt godtagbar infektions modell för mykobakteriets tuberkuloskomplex . Här beskriver vi och demonstrerar de åtgärder som vidtagits för att etablera en framgångs rik infektion av G. mellonella med bioluminiscerande Mycobacterium bovis BCG Lux.
Abstract
Tuberkulos är den ledande globala orsaken till dödlighet i infektions sjukdomar och ungefär en fjärdedel av världens befolkning tros vara infekterad med Mycobacterium tuberkulos. Trots decennier av forskning, många av mekanismerna bakom framgången för M. tuberkulos som patogen organism återstår att undersökas, och utvecklingen av säkrare, effektivare antimykobakteriella läkemedel är brådskande behövs för att ta itu med ökningen och spridningen av resistent tuberkulos. Emellertid, utvecklingen av tuberkulos forskning är Flask halsar av traditionella däggdjurs infektion modeller som är dyra, tids krävande, och etiskt utmanande. Tidigare har vi etablerat larver av insekten Galleria mellonella (större vax Moth) som en roman, reproducerbar, låg kostnad, hög genom strömning och etiskt acceptabel infektions modell för medlemmar av M. tuberkulos Complex. Här beskriver vi underhåll, beredning och infektion av G. mellonella med bioluminiscerande Mycobacterium bovis BCG Lux. Med hjälp av denna infektions modell, mykobakteriell dos beroende virulens kan observeras, och en snabb avläsning av in vivo mykobakteriell börda med hjälp av bioluminescens mätningar är lätt att uppnå och reproducerbara. Även om det finns begränsningar, såsom avsaknaden av en fullt kommenterad genom för transkriptomisk analys, kan ontologisk analys mot genetiskt liknande insekter utföras. Som en låg kostnad, snabb och etiskt godtagbar modell för tuberkulos, G. mellonella kan användas som en pre-Screen för att fastställa läkemedels effekt och toxicitet, och för att fastställa jämför ande mykobakteriell virulens före användning av konventionella däggdjurs Modeller. Användningen av G. mellonella-mycobacteria modellen kommer att leda till en minskning av det stora antalet djur som för närvarande används i tuberkulos forskning.
Introduction
Tuberkulos (TB) är ett stort hot mot den globala folkhälsan med 9 000 000 nya fall per år och 1 500 000 dödsfall1. Dessutom uppskattas det att en fjärdedel av världens befolkning är infekterad med sjukdomens smittämne, Mycobacterium tuberkulos (MTB). Bland den infekterade populationen kommer 5 − 10% att utveckla en aktiv TUBERKULOSSJUKDOM under deras livstid. Vidare, uppkomsten och spridningen av multiresistenta (MDR) och omfattande-Drug (XDR) resistenta MTB utgör ett allvarligt hot mot sjukdoms kontroll, med 123 länder som rapporterar minst en XDR fall1. Behandling av tbc kräver en cocktail av minst fyra anti-mykobakteriella läkemedel, av vilka Isoniazid och Rifampicin ordineras under en period av minst sex månader; behandling är ofta förknippad med komplexa biverkningar och toxiciteter. Skydd från det enda licensierade vaccinet mot tbc, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), är variabel2. En ofullständig förståelse av patogenesen av tbc hämmar kraftigt utvecklingen av nya terapeutiska och vaccinations strategier.
I årtionden djur infektion modeller har varit avgörande för TBC forskning för att förstå grundläggande patogenes och värd svar på infektion, och att utvärdera nya anti-mykobakteriella medel, immuno-Therapeutics och nya vaccin kandidater3, 4. emellertid, forskning med djur infektion modeller av tuberkulos är notoriskt svårt eftersom patogenes och progression av tuberkulos infektion är komplexa, och det finns ingen enda djur modell som imiterar hela spektrumet och viktiga egenskaper hos sjukdomen5 ,6. Dessutom är djur försök dyra, tids krävande att genomföra och kräver full etisk motivering. Ändå har djur infektions modeller av tbc beskrivits i icke-mänskliga primater (t. ex. Makaker), marsvin, kaniner, nötkreatur, svin, möss och zebra fiskar, med var och en med sina begränsningar3,4. Den murina modellen är den vanligaste modellen på grund av kostnader, till gången på inavlade linjer, reproducerbarhet av infektion och överflöd av immunologiska reagenser. Emellertid, de normalt inte bildar granulom i samband med områden av hypoxi som är karakteristiska för latent tuberkulos infektion (ltbi)6. Marsvin är mycket mottagliga för MTB -infektion, med patologi och tidig granulombildning liknande dem hos människor, och används ofta i vaccin testning; men avsaknaden av immunologiska reagenser hämmar deras användning som en infektions modell7. Zebrafish lämpar sig för storskalig screening i tidiga prekliniska studier på grund av sin ringa storlek, snabba reproduktion och avancerade genetiska verktyg, men är anatomiskt och fysiologiskt olika för människor och är endast mottagliga för Mycobacterium Marinum infektion3. De djur modeller som närmast liknar mänsklig MTB infektion är icke-mänskliga primater (t. ex. makak), men de är dyra och har betydande etiska och praktiska överväganden som avsevärt begränsar deras användning8.
Insekten larv av större vax Moth eller Honeycomb Moth, Galleria mellonella, har blivit alltmer populärt som en infektions modell för en mängd olika bakterie-och svamppatogener9, och som en skärm för nya antimikrobiella läkemedels kandidater 10. G. mellonella är en framgångs rik ryggradslösa modell på grund av dess sofistikerade medfödda immun system (bestående av cellulära och humorala försvar) som delar en hög grad av strukturell och funktionell likhet med ryggradsdjur11 . Detta inkluderar immunmekanismer såsom fagocytos av patogener av hemocyter (funktionellt liknar däggdjurs makrofag och neutrofiler)12,13, produktion och cirkulation av antimikrobiella peptider (ampere) och komplement-liknande proteiner inom hemolymfa (analogt med däggdjurs blod) av G. mellonella11. Andra fördelar9,14,15 av G. mellonella larver som modell inkluderar 1) deras stora storlek (20 − 30 mm) vilket möjliggör enkel manipulation och infektion, samt insamling av vävnad och hemolymfa för analyser, 2) enkelt underhåll vid 37 ° c, kompatibel för att studera humana patogener, 3) exakt infektion genom injektion utan behov av anestesi, 4) effekten av antimikrobiella medel kan bedömas med hjälp av mindre läkemedel för utvärdering, 5) brist på etiska begränsningar jämfört med användning av däggdjur, 6) stora grupp storlekar kan användas jämfört med djur modeller som möjliggör större reproducerbarhet, och 7) kortare tider för infektions experiment krävs.
I en färsk studie, visade vi att G. mellonella kan användas som en ny infektions modell för att studera patogenesen av infektion av bioluminiscerande M. bovis BCG Lux, en genetiskt modifierad version av vaccin stammen och medlem av MTB -komplexet (mtbc)16. Medan G. mellonella har tidigare använts som en infektions modell för icke-tuberculous mykobakterier (NTM), främst M. Marinum och Mycobacterium abscessus17,18, studier med mtbc är begränsade till som Li et al.16. Bioluminescent icke-patogena mykobakteriella stammar, som kan användas vid inne slutning nivå (CL) 2 som ett surrogat för MTB, erbjuda fördelarna med säkerhet och funktionalitet över patogena mykobakterier. Efter infektion med BCG Lux, larver börja utveckla tidiga granuloma-liknande strukturer, som skulle kunna ge värdefull inblick i den roll som medinneboende immunitet vid upprättandet av tuberkulos infektion16. Dessutom, denna enkla ryggradslösa infektions modell har potential att ge en snabb, billig och pålitlig utvärdering av TB patogenes införliva kontrollerad utmaning och flera replikat för reproducerbarhet. Dessutom har modellen potential att användas för att avskärma nya anti-TB läkemedel och vaccin kandidater i tidig utveckling, vilket minskar det totala antalet försöks djur. Förmågan att mäta förändringar i värd-och patogen struktur, transkriptome och proteom för att fastställa narkotika mål och bedöma verkningsmekanismer för nya läkemedel och terapeutiska vacciner, är också fördelaktigt.
Här beskriver vi de experimentella protokollen för beredning av en bioluminiscerande M. bovis BCG Lux inokulatet och G. mellonella larver för mykobakteriell infektion, samt bestämning av både larv och mykobakteriell överlevnad som svar på infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: allt arbete som beskrivs nedan ska utföras i ett CL2-laboratorium inom ett klass 2-mikrobiologiskt säkerhets skåp (MSC) enligt lokala hälso-och säkerhets rikt linjer.
1. beredning av M. bovis BCG Lux för infektion
- Avfrostning av fryst 1,2 mL glycerol (15%) lager av M. bovis BCG Lux, den Montreal vaccin stammen omvandlas med Shuttle Plasmid pSMT1 bär luxab gener från Vibrio harveyi kodning luciferas enzymet19.
- Inokulera 15 mL Middlebrook 7H9 buljong innehåll ande 0,2% glycerol, 10% albumin, dextros, katalas (ADC) berikning och 50 μg/mL hygromycin med en avfrostad 1,2 mL alikvot av BCG Lux, i en märkt 250 ml Erlenmeyerkolv.
- Placera kolven i en sluten behållare för biosäkerhet och inkubera vid 37 ° c i en orbital shaker inkubator vid 220 RPM för 72 h (eller tills kulturen når mitten av log fas av tillväxt).
- Kontrol lera tillväxten av BCG Lux kultur genom att förbereda 1:10 utspädningar av kulturen i luminometer rör med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4, 0,01 m fosfatbuffert, 0,0027 m kaliumklorid och 0,137 m natriumkloridlösning) i två exemplar. Vortex, och ladda luminometerrören i luminometern och mät bioluminescens (relativ ljus enhet [RLU]/mL) med n-decyl aldehyd som substrat (1% v/v i absolut etanol)20.
Anmärkning: Förhållandet mellan RLU-/kolonibildande enheter (CFU) fastställdes tidigare till 3:1 när BCG Lux odlades in vitro i Middlebrook 7H9 buljong20. - Centrifugera kulturen vid 2 175 x g i 10 min vid rums temperatur för att pelletera cellerna och Kassera supernatanten i ett lämpligt desinfektions medel med känd mykobaktericid aktivitet. Kassera allt odlings avfall med desinfektions medel som lämpar sig för mykobakterier enligt lokala rikt linjer.
- Tvätta cellpelleten två gånger i PBS innehåll ande 0,05% polysorbat 80 (PBS-T) för att förhindra bakterie klumpar.
- Efter den slutliga tvätt, Dekantera avfall supernatant, omsuspendera mykobakteriell cell pellet i PBS-T och späda ut den mykobakteriella SUS pensionen till önskad cell täthet med hjälp av rlu mätningar.
- Bered tiofaldigt seriella utspädningar av inokulatet i 24-well-plattor med PBS-T. Platta ut 10 μl på Middlebrook 7h11 agar tallrikar (0,5% glycerol, 50 μg/ml hygromycin, 10% oljesyra, albumin, dextros, katalas [oadc]) i två exemplar för att räkna upp inokulatet CFU räknas.
2. beredning av G. mellonella larver
- Köp sista INSTAR larver från lämpliga källor och underhålla larverna i mörkret vid 18 ° c vid ankomst och användning inom 1 vecka efter köpet. Alternativt kan larver vara självuppfödda i enlighet med Jojāo et al.21-protokollet. För inköpta larver, kassera alla döda, missfärgade eller pupating larver före förvaring.
Anmärkning: Pupating larver är morfologiskt distinguishable till de sista INSTAR larverna. - Identifiera och välj friska larver för experiment, baserat på enhetlig grädde färg med liten eller ingen missfärgning (melanization), storlek (2 − 3 cm i längd), vikt (ca 250 mg), visar en hög grad av motilitet, och besitter förmågan att rätt sig när de vänds.
- Räkna försiktigt de friska larverna (minst 20 − 30 per grupp) till en petriskål (94/15 mm) fodrad med ett lager av filtrerpapper (94/15 mm) med hjälp av trubbiga pincetter för att minimera kontaminering och förvara vid rums temperatur i mörker tills användning.
3. infekterande G. mellonella med BCG Lux
- Minimera röran inom MSC för att minska risken för kontaminering och nålstick skada.
- Förbered injektions plattformen genom att tejka ett cirkulärt filter papper (94 mm) till en plan upphöjd yta. Mjuka eller hårda ytor kan användas och är helt beroende av användarens preferenser, t. ex., pipettlådlock eller en nylonskur svamp.
- Sterilisera en 25 μL mikrospruta (25 G) genom att aspirera 3 volymer av 70% etanol och skölj ytterligare med 3 volymer sterilt PBS-T.
- Aspirera 10 μl BCG Lux inokulatet (berett i avsnitt 1) eller PBS-T i den steriliserade 25 μl-mikrosprutan. Använd en separat spruta för PBS-T-negativ kontroll.
Anmärkning: Omsuspendera BCG Lux -inokulatet efter 10 injektioner för att säkerställa enhetlig cell SUS pension. - Använd pincett för att plocka upp en larv och placera på injektions plattformen.
- På plattformen, flip larvaen på ryggen och immobilisera genom att säkra huvudet och svansen med pincetten. Lokalisera den sista vänstra proleg räkna ner från huvudet på larven och försiktigt in spetsen på nålen (5-6 mm) vid en 10 − 20 ° vinkel till horisontal planet.
Anmärkning: Korta och smala pincetter möjliggör enkel immobilisering med minsta larv stress. Var uppmärksam inte över penetrera som kan punktera tarmen och orsaka icke-BCG Lux specifik melanization eller dödsfall. - Räkna de infekterade larverna i en petriskål fodrad med ett lager av filter papper, en enda 90 mm petriskål rymmer upp till 30 larver.
- Förvara petriskål som innehåller larverna i en ventilerad eller icke-förseglad mörk låda i en inkubator vid 37 ° c med 5% CO2.
4. övervaka överlevnaden av G. mellonella efter infektion
- Över tiden kursen, övervaka överlevnaden av larverna varje 24 h. larver anses döda när de inte röra sig i ett svar på beröring.
5. mätning av in vivo-bördan för BCG Lux i G. mellonella
- Vid varje tidpunkt väljer man slumpmässigt fem infekterade larver som tidigare utarbetats i avsnitt 3 och steriliserar försiktigt de larv ytorna med bomulls knopp indränkt i 70% etanol.
Anmärkning: Detta steg är viktigt vid plätering larv Homogenatet för mykobakteriell CFU uppräkning som icke-steriliserade larver kan leda till kontaminering. - Placera larverna individuellt i 2 mL lyseringslösning Matrix rör som innehåller 800 μL steril PBS.
- Homogenisera larverna med hjälp av en Homogenisatorer för 60 s vid 6,0 m/s.
- Centrifugera lyseringslösning-rören vid 3 500 x g i 5 s för att avlägsna Homogenatet från locken och häll försiktigt ut Homogenatet i sterila luminometerrör individuellt.
Anmärkning: För CFU-uppräkning (steg 5,7), se till att reservera 100 μL homogenat i ett sterilt, 1,5 mL reaktions rör. - Återvinner kvarvarande homogenat genom tvättning av lyseringslösning Matrix rören med 1 mL PBS-T och pipetten i motsvarande luminometerrör.
- Vortex luminometerrören och mät bioluminescens av de homogenater som tidigare beskrivits i steg 1,4.
- Bered tiofaldigt seriella utspädningar av Homogenatet i 24-välsorterade odlings plattor med PBS-T. Platta ut 10 μL av utspädningen på Middlebrook 7H11 agar-plattor innehåll ande 0,5% glycerol, 50 μg/mL hygromycin, 10% OADC och 20 μg/mL piperacillin, för att fastställa RLU/CFU-förhållandet för BCG Lux efter in vivo-infektion.
Anmärkning: Piperacillin eliminerar naturligt G. mellonella bakterieflora med minimal tillväxthämning av BCG Lux16.
6. statistisk analys
- Rita Kaplan-Meier-överlevnads kurvan med insamlade data och utför mantel-Cox-testet (log-rank) för att fastställa resultatets betydelse, där * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 och * * * * p < 0,0001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi representativa data som kan erhållas med hjälp av g. mellonella -BCG Lux infektions modell och belysa fördelarna med g. mellonella som en infektions modell för medlemmar i mtbc (figur 1). Experimentella procedurer med viktiga tekniska punkter beskrivs i figur 2.
Figur 1: fördelarna med G. mellonella som en infektions modell. Denna siffra har anpassats från Kavanagh och Sheehan22. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beskrivning av experimentella procedurer. A) underhåll och beredning av G. mellonella vid infektion med M. bovis BCG Lux. Bberedning av BCG Lux -kulturen och inokulatet för infektion. C) infektion av G. mellonella med BCG Lux. Dmätning av virulens och in vivo-belastningen av BCG Lux i G. mellonella larver. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
BCG Lux dos beroende virulens observerades i G. mellonella larver över en 96 h inkubations tid (figur 3), och den dödliga dos som krävs för 50% larv dödlighet (ld50) fastställdes till 1 x 107 CFU. Överlevnads fördelningen som återspeglar virulens hos de testade BCG Lux -doserna var signifikant annorlunda (p < 0,0001). Kontroll grupper injiceras med en 10 μL dos av PBS-T eller de helt enkelt prickade simulera nålskador, påverkade inte larv hälsa eller leda till en ökning av dödligheten som bestäms av observationella kontroller av motilitet och melanization vid olika tidpunkter.
Figur 3: Kaplan-Meir överlevnads kurva för G. mellonella som svar på varierande inokulat av M. bovis BCG Lux. Friska larver (n ≥ 10 per grupp), var infekterade med varierande doser av BCG Lux. Larverna var inkuberas vid 37 ° c och övervakas för överlevnad var 24 h för upp till 96 h. Den oinfekterade gruppen injicerades med PBS, och en stack grupp (insättning av nål endast) visade effekten av nålskada på larv hälsa. Medlen för två oberoende experiment visas, med 95% KONFIDENS intervall, representerade som prickade linjer i motsvarande färg till inoculum. Denna siffra har anpassats från Li et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Alla larver infekterade med BCG Lux visade fysiologiska förändringar över tid och, för larver infekterade med en 2 x 107 CFU dos av BCG Lux, melanization av larv rygg linjen observerades från 48 h post infektion (PI), och systematiska melanization observerades från 96 h PI (figur 4). Dessutom minskades motiliteten hos larverna med svårighets graden av melanization och larverna att pupate försvann vid infektion i jämförelse med icke-infekterade kontroller.
Figur 4: Melanisering av G. mellonella som svar på infektion med M. bovis BCG Lux. Friska larver vid 0 h var infekterade med en 2 x 107 CFU dos av BCG Lux. Vid 48 h och 96 h pi, melanization längs larv dorsala linjen och systematisk melanization, respektive, observerades.
Överlevnad BCG Lux inom G. mellonella larver bestämdes över 2 veckor genom bioluminescens mätning av larv homogenater. Infektion med en 1 x 107 CFU dos av BCG Lux resulterade i en initial ned gång av BCG Lux bioluminescens från 0 − 72 h PI. Men från 72 − 144 h pi, den bioluminescens av BCG Lux plateaued, vilket tyder på inrättandet av ihållande infektion (figur 5).
Figur 5: in vivo-börda för M. bovis BCG Lux i G. mellonella kvantifierad med hjälp av bioluminescens (relativ ljus enhet, rlu/ml) under en två veckors tid kurs. Friska larver (n = 30) var infekterade med 1 x 107 CFU dos av BCG Lux. In vivo belastningen kvantifierades genom homogenisering av fem larver vid varje tidpunkt (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h), och mätning av bioluminescens av homogenat. Medlen för tre oberoende experiment visas, och felstaplar representerar standard avvikelsen för medelvärdet. Denna siffra har skrivits om från Li et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Eftersom den snabba och reproducerbara kvantifieringen av in vivo-mykobakteriell tillväxt i dessa studier bestämdes genom mätning av bioluminescens, bör förhållandet mellan RLU och CFU också bestämmas in vivo. I vårt särskilda infektions system varierade in vivo-förhållandet mellan RLU och CFU från 2:1-5:1, med ett genomsnitt på 4:1 över den 168-h tids banan (figur 6).
Figur 6: bestämning av RLU/CFU-förhållandet in vivo för M. bovis BCG Lux i G. mellonella. Friska larver (n = 30) var infekterade med 1 x 107 CFU dos av BCG Lux. Vid varje tidpunkt (0, 24, 96 och 168 h) var fyra larverna homogeniserade, och homogenaterna mättes för bioluminescens och sattes ut på 7H11 agar för att räkna upp CFU-värden. Medlen för två oberoende experiment visas och felstaplar representerar standard avvikelsen för medelvärdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användning av G. mellonella som en infektions modell har fastställts för ett antal bakteriella och svamppatogener för studiet av virulens, Host-patogen interaktion, och som en skärm för nya Therapeutics10,22. Följande diskussion bygger på det experimentella förfarandet för användning av G. mellonella som en infektions modell för mtbc.
Hälsan hos de naiva larverna före experiment kan ha en avsevärd inverkan på resultatet av experimentet. Därför är det viktigt att alla missfärgade och/eller skadade larver avlägsnas vid ankomsten och inte används för några experiment. Om ett stort antal larver hittas döda i samma behållare vid ankomsten, är det lämpligt att kassera partiet som redan existerande infektioner kan vara orsaken till döden. Om möjligt utföra experiment med larverna så nära dagen för inköp/ankomst. Se till att larverna förvaras vid 18 ° c före användning för att förhindra puppningen och för att maximera antalet larver som finns tillgängliga för experiment. Friska larver kan användas i upp till 7 dagar efter leverans/köp. Efter infektion, se till att ta bort alla döda larver från petriskål som, av okänd anledning ännu okända, förekomsten av döda larver verkar öka dödligheten i urvalet befolkningen. För användare av självuppfödda larver är det viktigt att vara medveten om biologisk variation jämfört med inköpta larver, eftersom variationen i diet-och tillväxt förhållanden kan påverka den larv immunitet21,23. Inter-experimentella variabiliteter kan begränsas genom att hålla källan, om den köps, eller foder och tillväxt villkor för de uppfödda larverna konsekvent mellan experimenterande. I alla experiment är det nödvändigt att inkludera "tomma" och "prickade" negativa kontroller. blind kontrollen är en indikator på kontaminering eller toxicitet i SUS pension matrisen (PBS-T eller medie buljong), och den prickade kontrollen härmar effekten av nålskadan på larv hälsa. Dessutom normaliserar dessa kontroller alla biologiska variationer mellan partier av larver, vilket säkerställer reproducerbarhet och noggrannhet mellan experimenten.
För injektion av G. mellonella larver, rekommenderas användning av en 25 G nål som större nålar kan orsaka kraftig blödning och skarpare mindre nålar kan lätt punktera tarmen av larverna, vilket leder till larv dödlighet och falskt positiva Resultat. Konventionella metoder för nål injektion immobilisera typiskt larverna för hand, vilket ökar risken för nålskada. Genom att använda en pincett för att immobilisera larverna reduceras risken för nålsticks skador betydligt eftersom handen inte är i närheten av nålen vid något tillfälle under infektionen. Alternativt kan larverna immobiliseras genom kylning. Emellertid, kall chock vid 12 ° c i 15 min före infektion har dokumenterats för att förbättra den medinnat immun svaret mot infektion. Därför bör analysen av de resultat som erhålls via kylning noggrant överväga dess effekt24. Med hjälp av vår teknik, medel genom strömning av injektion (2 − 3 larver per minut) kan uppnås med användar praxis; Detta är jämförbart med hastigheten på konventionell injektion från vår erfarenhet (3 − 4 larver per min). Dessutom, vår metod kan anpassas för högre genom strömning injektion genom att använda en pedal driven injektion plattform består av en infusionspump med en engångs spruta ansluten till en 25 G fjäril kanyl.
Beredningen av BCG Lux inokulatet baseras på den snabba uppskattningen av CFU med hjälp av rlu i den mykobakteriella kulturen20. I vår erfarenhet av buljong kultur, förhållandet mellan RLU till CFU är 3:120, kontrasterande med BCG Lux växer i G. mellonella där rlu till CFU förhållandet är 5:120. Mykobakteriell cell aggregation eller "klumpar" som vanligen förekommer i täta kulturer kan påverka rlu-mätningarna, eftersom klumpar kan resultera i opålitliga mätningar av bioluminescens. Som sådan, användning av klumpgranulat mykobakteriell kultur för inokulatet beredning rekommenderas inte. Tillsats av polysorbat 80 till tillväxtmedia minimerar dock cell klumpar utan att förändra tillväxten av BCG Lux. 16 någon mindre cell klumpar kan lösas genom att tvätta kulturen med PBS-T och är avgörande för att förbereda en noggrann inokulatet med rlu som avläsning. Dessutom är PBS-T-tvätten avgörande för att avlägsna eventuell extracellulär virulensfaktor som utsöndras under tillväxt. Mycobakteriell stam och passage nummer bör också tas i beaktande, eftersom detta kan påverka svårighets graden av mykobakteriell aggregation25. I samtliga fall bör inokulatet räknas upp med CFU på 7H11 agar-plattor för att säkerställa att rätt CFU prepareras genom bioluminescens mätning. Dessutom bör rlu/CFU-förhållandet in vivo bestämmas med ny bioluminiscerande reporter eller aktier, eftersom förhållandet sannolikt kommer att variera.
G. mellonella har flera fördelar jämfört med konventionella modeller av TB-infektion, inklusive billigare kostnader för förvärv och underhåll, enkel infektion och forsknings kapacitet, särskilt i kombination med bioluminiscerande stammar16. Avsaknaden av etiska begränsningar möjliggör större urvals storlek (minst 20 − 30 larver per grupp) i jämförelse med däggdjurs modeller, vilket ger större förtroende och tillförlitlighet i de resultat som erhålls26,27. Emellertid, det finns ett antal begränsningar i användningen av G. mellonella som en infektions modell. Som en ryggradslösa djur, de saknar naturligtvis adaptiv immunitet gör dem olämpliga för antigenicitet eller immunologiska studier10. Cellulära medfödda immun svar av G. mellonella består av ett antal hemocyte typer, och plasmatocyter och granulocyter har rapporter ATS fungera på samma sätt som däggdjurs fagocyter (neutrofiler och makro Fager)12. Emellertid, roll och mekanismer för dessa cell typer förblir under kännetecknas, och direkta jämför ande studier mellan däggdjurs-och insektsfagocyter är ännu inte genomförts. Dessutom hindrar avsaknaden av en kommenterad G. mellonella genom analys av värd svaret på infektionen, och detta är för närvarande beroende av gen ontologi analys mot transkriptomic bibliotek av andra ryggradslösa djur, såsom Drosophila melanogaster och Bombyx Mori28.
Som en TB infektion modell, G. mellonella har en lovande framtid med sin förmåga att utveckla granuloma-liknande strukturer som svar på BCG Lux infektion16, som är viktiga patofysiologiska kännetecken för tuberkulos infektion och är en viktig funktion i utvecklingen av LTBI. Framtida arbete kommer att syfta till att karakterisera denna modell med ett särskilt intresse för bildandet av granuloma-liknande strukturer med hjälp av referens, kliniska och muterade MTB isolat under CL3 villkor. Dessutom, vi räknar med att det också kan vara användbart för nya anti-mykobakteriell agent screening, som en liknande G. mellonella modell användes för NTMS18, men detta återstår att fastställa. Antagandet av denna modell har förmågan att avsevärt minska antalet djur som används inom TB forsknings samfundet, samtidigt påskynda in vivo TB forsknings resultat under etiskt mer acceptabla villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av bidrag från forsknings rådet för bio teknik och biologisk vetenskap (BBSRC), som tilldelades PRL och YL (BB/P001262/1), och det nationella centret för utbyte, förfining och reduktion av djur i forskning (NC3Rs) som tilldelats PRL. SMN, BDR och YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
