Summary
Galleria mellonella è stata recentemente fondata come un modello di infezione riproducibile, economico ed eticamente accettabile per il complesso della tubercolosi Mycobacterium. Qui descriviamo e dimostriamo i passi compiuti per stabilire l'infezione di successo di G. mellonella con Mycobacterium bovis BCG lux bioluminescente.
Abstract
La tubercolosi è la principale causa globale di mortalità per malattie infettive e si ritiene che circa un quarto della popolazione mondiale sia infettata da Mycobacterium tuberculosis. Nonostante decenni di ricerca, molti dei meccanismi alla base del successo di M. tuberculosis come organismo patogeno rimangono da studiare, e lo sviluppo di farmaci antimicobatterici più sicuri e più efficaci sono urgentemente necessari per affrontare l'ascesa e diffusione della tubercolosi farmacoresistente. Tuttavia, la progressione della ricerca sulla tubercolosi è collodiata dai modelli di infezione tradizionale dei mammiferi che sono costosi, dispendiosi in termini di tempo e eticamente impegnativi. In precedenza abbiamo stabilito le larve dell'insetto Galleria mellonella (maggiore falena di cera) come un nuovo modello di infezione riproducibile, a basso costo, ad alto consumo e eticamente accettabile per i membri del complesso M. tuberculosis. Qui descriviamo la manutenzione, la preparazione e l'infezione di G. mellonella con Mycobacterium bovis BCG lux bioluminescente. Utilizzando questo modello di infezione, si può osservare la virulenza dipendente dalla dose micobatterica e una rapida lettura del carico micobatterico in vivo utilizzando le misurazioni della bioluminescenza è facilmente realizzabile e riproducibile. Sebbene esistano limitazioni, come la mancanza di un genoma completamente annotato per l'analisi trascrittomica, è possibile effettuare analisi ontologiche contro gli insetti geneticamente simili. Come modello a basso costo, rapido ed eticamente accettabile per la tubercolosi, G. mellonella può essere utilizzato come pre-schermo per determinare l'efficacia e la tossicità del farmaco e per determinare la virulenza micobatterica comparativa prima dell'uso di mammiferi convenzionali Modelli. L'uso del modello G. mellonella-mycobacteria porterà a una riduzione del numero sostanziale di animali attualmente utilizzati nella ricerca sulla tubercolosi.
Introduction
La tubercolosi (TB) è una grave minaccia per la salute pubblica globale, con 9 milioni di nuovi casi all'anno e 1,5 milioni di decessi1. Inoltre, si stima che un quarto della popolazione mondiale sia infettato dall'agente causale della malattia, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Tra la popolazione infetta, il 5-10% svilupperà una malattia da TB attiva nel corso della loro vita. Inoltre, l'emergere e la diffusione di Mtb multifarmacoresistenti (MDR) e ampiamente resistenti ai farmaci (XDR) rappresenta una grave minaccia per il controllo delle malattie, con 123 paesi che riportano almeno un caso XDR1. Il trattamento della tBC richiede un cocktail di almeno quattro farmaci anti-micobatterici, di cui isoniazid e rifampicina sono prescritti per una durata minima di sei mesi; trattamento è spesso associato a effetti collaterali complessi e tossicità. La protezione dall'unico vaccino autorizzato contro la TUBErcolosi, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), è variabile2. Una comprensione incompleta della patogenesi della TB ostacola significativamente lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e di vaccinazione.
Per decenni i modelli di infezione animale sono stati fondamentali per la ricerca sulla TB per comprendere la patogenesi di base e la risposta dell'ospite all'infezione e per valutare nuovi agenti anti-micobatterici, immuno-terapie e nuovi candidati al vaccino3, 4.Tuttavia, la ricerca che utilizza modelli di infezione animale di TB è notoriamente difficile in quanto la patogenesi e la progressione dell'infezione da TB sono complesse, e non esiste un singolo modello animale che imita l'intero spettro e le caratteristiche importanti della malattia5 ,6. Inoltre, gli esperimenti sugli animali sono costosi, richiedono molto tempo per intraprendere e richiedono una giustificazione etica completa. Tuttavia, i modelli di infezione animale di TB sono stati descritti in primati non umani (ad esempio, macachi), porcellini d'India, conigli, bovini, maiali, topi e pesci zebra, ciascuno con i loro limiti3,4. Il modello murino è il modello più comunemente usato a causa del costo, della disponibilità di linee inbred, della riproducibilità dell'infezione e dell'abbondanza di reagenti immunologici. Tuttavia, in genere non formano granulomi associati a aree di ipossia che sono caratteristiche dell'infezione da tubercolosi latente (LTBI)6. I maiali della Guinea sono altamente sensibili all'infezione da Mtb, con patologia e formazione precoce di granuloma simili a quelli nell'uomo, e sono ampiamente utilizzati nei test sui vaccini; tuttavia la mancanza di reagenti immunologici ne ostacola l'uso come modello di infezione7. I pesci zebra sono adatti per lo screening su larga scala in studi preclinici in fase iniziale a causa delle loro piccole dimensioni, della rapida riproduzione e degli strumenti genetici avanzati, ma sono anatomicamente e fisiologicamente diversi dall'uomo e sono suscettibili solo Mycobacterium marinum infezione3. I modelli animali più simili all'infezione umana da Mtb sono primati non umani (ad esempio, il macaco), ma sono costosi e hanno considerazioni etiche e pratiche significative che limitano notevolmente il loro uso8.
La larva di insetti della falena di cera maggiore o facaccia,Galleria mellonella, sono diventati sempre più popolari come modello di infezione per una varietà di patogeni batterici e fungini9, e come schermo per nuovi candidati farmaco antimicrobico 10. G. mellonella è un modello di invertebrato di successo grazie al suo sofisticato sistema immunitario innato (composto da difese cellulari e umorali) che condivide un alto grado di somiglianza strutturale e funzionale con quello dei vertebrati11 . Ciò include meccanismi immunitari come la fagocitosi degli agenti patogeni da parte degli emociti (funzionalmente simili al macrofago mammifero e ai neutrofili)12,13, la produzione e la circolazione di peptidi antimicrobici (AMP) e proteine complementari all'interno dell'emolina (analoga al sangue dei mammiferi) di G. mellonella11. Altri vantaggi9,14,15 di G. mellonella larve come modello includono 1) le loro grandi dimensioni (20-30 mm) che consente una facile manipolazione e infezione, così come la raccolta di tessuto e eterogenea per le analisi, 2) facile manutenzione a 37 gradi centigradi, compatibile per lo studio di agenti patogeni umani, 3) infezione precisa per iniezione senza la necessità di anestesia, 4) l'efficacia degli agenti antimicrobici può essere valutata utilizzando meno farmaco per la valutazione, 5) mancanza di mancanza di sono necessari vincoli etici rispetto all'uso di mammiferi, 6) di grandi dimensioni di gruppo rispetto ai modelli animali che consentono una maggiore riproducibilità e sono necessari 7) tempi più brevi per gli esperimenti di infezione.
In uno studio recente, abbiamo dimostrato che G. mellonella può essere utilizzato come un nuovo modello di infezione per studiare la patogenesi dell'infezione da bioluminescente M. bovis BCG lux, una versione geneticamente modificata del ceppo vaccino e membro del complesso Mtb (MTBC)16. Mentre G. mellonella è stato precedentemente utilizzato come modello di infezione per micobatteri non tubercolari (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus17,18, gli studi utilizzando MTBC sono limitati a quella di Li et al.16. I ceppi miobatterici bioluminescenti non patogeni, che possono essere utilizzati a livello di contenimento (CL) 2 come surrogato per Mtb, offrono i vantaggi di sicurezza e praticità rispetto ai micobatteri patogeni. Dopo l'infezione da BCG lux, le larve iniziano a sviluppare strutture antiche simili a granuloma, che potrebbero fornire preziose informazioni sul ruolo dell'immunità innata nella creazione di infezione da TB16. Inoltre, questo semplice modello di infezione da invertebrati ha il potenziale per fornire una valutazione rapida, a basso costo e affidabile della patogenesi della TB che incorpora sfide controllate e repliche multiple per la riproducibilità. Inoltre, il modello ha il potenziale per essere utilizzato per vagliare nuovi farmaci anti-TB e vaccini candidati nello sviluppo precoce, riducendo il numero complessivo di animali in sperimentazione. Anche la capacità di misurare i cambiamenti nella struttura dell'ospite e dell'agente patogeno, il trascrittoma e il proteoma per determinare gli obiettivi dei farmaci e valutare i meccanismi di azione di nuovi farmaci e vaccini terapeutici, sono vantaggiosi.
Qui descriviamo i protocolli sperimentali per la preparazione di una bioluminescente M. bovis BCG lux inoculum e G. mellonella larva per l'infezione micobatterica, così come la determinazione sia della larva che del micobatterico sopravvivenza in risposta all'infezione.
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Protocol
NOTA: Tutto il lavoro descritto di seguito deve essere svolto in un laboratorio CL2 all'interno di un mobile di sicurezza microbiologico di classe 2 (MSC) secondo le linee guida locali in materia di salute e sicurezza.
1. Preparazione di M. bovis BCG lux per l'infezione
- Scongelare un glicerolo congelato da 1,2 mL (15%) stock di M. bovis BCG lux, il ceppo di vaccino di Montreal trasformato con la navetta plasmid pSMT1 portando i geni luxAB da Vibrio harveyi codifica l'enzima luciferasi19.
- Inolate 15 mL di brodo Middlebrook 7H9 contenente 0,2% glicerolo, 10% albumina, dextrose, catalasi (ADC) arricchimento e 50 g/mL hygromycin con uno scongelato 1,2 mL di BCG lux, in un etichettato 250 mL Erlenmeyer flask.
- Posizionare il pallone in un contenitore di biosicurezza sigillato e incubare a 37 gradi centigradi in un'incubatrice orbitale a 220 giri/min per 72 h (o fino a raggiungere la fase di crescita intermedia del log).
- Controllare la crescita della coltura lux BCG preparando 1:10 diluazioni della coltura nei tubi luminometrici utilizzando la salina tamponata di fosfato (PBS, pH 7.4, 0,01 M buffer fosfato, 0.0027 M di cloruro di potassio e 0,137 M di cloruro di sodio) in duplicato. Vortice, e caricare i tubi del luminometro nel luminometro e misurare la bioluminescenza (unità di luce relativa [RLU]/mL) utilizzando l'aldeide n-decito come substrato (1% v/v in etanolo assoluto)20.
NOT: Il rapporto tra rLU/colony forming units (CFU) era precedentemente determinato a essere 3:1 quando BCG lux è stato coltivato in vitro nel brodo Middlebrook 7H920. - Centrifugare la coltura a 2.175 x g per 10 min a temperatura ambiente per pellet le cellule e scartare il solttante in un disinfettante appropriato con attività micobatericidale nota. Smaltire tutti i rifiuti di coltura con disinfettanti appropriati per i micobatteri seguendo le linee guida locali.
- Lavare due volte il pellet cellulare in PBS contenente lo 0,05% di polisasore 80 (PBS-T) per evitare l'agglomerazione batterica.
- Dopo il lavaggio finale, decant waste supernatant, risospendere il pellet micobatterico cellulare in PBS-T e diluire la sospensione micobatterica alla densità cellulare desiderata utilizzando misurazioni RLU.
- Preparare le diluizioni seriali di dieci volte dell'inoculum in piastre da 24 pozzetti utilizzando PBS-T. Piastra fuori 10 .L su Middlebrook 7H11 piastre di agar (0.5% glicerol, 50 g/mL igromycin, 10% acido oleico, albumina, dextrose, catalasi [OADC]) in duplicato per enumerare i conteggi CFU inoculum.
2. Preparazione di G. mellonella Larve
- Acquistare larve a stella ultima da fonti appropriate e mantenere le larve al buio a 18 gradi centigradi all'arrivo e utilizzare entro 1 settimana dall'acquisto. In alternativa, le larve possono essere allevate autonomamente seguendo il protocollo di Jojào et al.21. Per le larve acquistate, scartare eventuali larve morte, scolorite o pupating prima dello stoccaggio.
NOT: Larve pupa sono morfologicamente distinguibili fino alle ultime larve instar. - Identificare e selezionare larve sane per la sperimentazione, sulla base di colore crema uniforme con poca o nessuna scolorimento (melanizzazione), dimensioni (2,3 cm di lunghezza), peso (circa 250 mg), mostrando un alto livello di motilità, e in possesso della capacità di destra se stessi quando girato.
- Contate attentamente le larve sane (minimo 20-30 per gruppo) in una piastra Petri (94/15 mm) rivestita con uno strato di carta da filtro (94/15 mm) utilizzando una pinzetta smussata per ridurre al minimo la contaminazione e conservarla a temperatura ambiente al buio fino all'uso.
3. Infettare G. mellonella con BCG lux
- Ridurre al minimo il disordine all'interno della MSC per ridurre il rischio di contaminazione e lesioni del bastone dell'ago.
- Preparare la piattaforma di iniezione toccando una carta da filtro circolare (94 mm) su una superficie rialzata piatta. Le superfici morbide o dure possono essere utilizzate e dipendono interamente dalle preferenze dell'utente, ad esempio i coperchi delle pipette box o una spugna di perlone in nylon.
- Sterilizzare un microsiringe da 25 L (25 G) aspirando 3 volumi del 70% di etanolo e risciacquare ulteriormente con 3 volumi di PBS-T sterile.
- Aspirate 10 L di BCG lux inoculum (preparato nella sezione 1) o PBS-T nella sterilizzata microsiringe 25 -L. Utilizzare una siringa separata per il controllo negativo PBS-T.
NOT: Risospendere l'inoculum di BCG dopo 10 iniezioni per garantire una sospensione cellulare uniforme. - Utilizzare una pinzetta per raccogliere una larva e posizionare sulla piattaforma di iniezione.
- Sulla piattaforma, capovolgere la larva sulla sua schiena e immobilizzare fissando la testa e la coda con le pinzette. Individua l'ultimo conto alla rovescia sinistra dalla testa della larva e inserisci con attenzione la punta dell'ago (5-6 mm) con un angolo di 10-20 gradi rispetto al piano orizzontale.
NOT: Le pinzette corte e strette consentono una facile immobilizzazione con minimo stress larvale. Prestare attenzione a non superpenetrare che può forare l'intestino e causare non-BCG lux melanizzazione specifica o la morte. - Contare le larve infette in un piatto Petri foderato con uno strato di carta da filtro, un singolo piatto Petri 90 mm può ospitare fino a 30 larve.
- Conservare il piatto Petri contenente le larve in una scatola scura ventilata o non sigillata all'interno di un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
4. Monitoraggio della sopravvivenza di G. mellonella in seguito all'infezione
- Nel corso del tempo, monitorare la sopravvivenza delle larve ogni 24 h. Le larve sono considerate morte quando non si muovono in risposta al tatto.
5. Misurazione del fardello In Vivo di BCG lux in G. mellonella
- Ad ogni momento, selezionare casualmente cinque larve infette precedentemente preparate nella sezione 3 e sterilizzare delicatamente le superfici larve utilizzando tamponi di cotone imbevuti di etanolo 70%.
NOT: Questo passaggio è importante quando placcatura larval omogenate per l'enumerazione CFU micobatterica come larve non sterilizzate può portare alla contaminazione. - Posizionare le larve singolarmente in tubi a matrice liscida 2 mL contenenti 800 -L di PBS sterile.
- Omogeneizzare le larve utilizzando un omogeneizzatore per 60 s a 6,0 m/s.
- Centrifugare i tubi di lisciviatura a 3.500 x g per 5 s per rimuovere l'omogeneità dai coperchi e decantare con attenzione l'omogenea in tubi luminosi sterili singolarmente.
NOT: Per l'enumerazione CFU (passaggio 5.7), assicurarsi di riservare 100 L L di omogeneo in un tubo di reazione sterile da 1,5 mL. - Recuperare l'omopure rimanente lavando i tubi a matrice di lising con 1 mL di PBS-T e pipette nei tubi luminometri corrispondenti.
- Vorticare i tubi del luminometro e misurare la bioluminescenza degli omogenei descritta in precedenza al punto 1.4.
- Preparare diluizioni seriali decuplicate dell'omogeneo in piastre di coltura a 24 pozzi utilizzando PBS-T. Piastra fuori 10 l della diluizione su Middlebrook 7H11 piastre di agar contenenti 0,5% glicerolo, 50 g/mL igromycina, 10% OADC e 20 g/mL piperacillin, per determinare il rapporto RLU/CFU del BCG lux a seguito di infezione in vivo.
NOT: Piperacillin elimina il nativo G. mellonella microbiota con inibizione della crescita minima di BCG lux16.
6. Analisi statistiche
- Tracciare la curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier utilizzando i dati raccolti ed eseguire il test Mantel-Cox (Log-rank) per determinare il significato del risultato, in cui
p;0,05 ,p & < 0.0001 e .p < 0.0001.
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Representative Results
Qui presentiamo dati rappresentativi che possono essere ottenuti utilizzando il modello di infezione G. mellonella - BCG lux ed evidenziano i benefici di G. mellonella come modello di infezione per i membri della MTBC (Figura 1). Le procedure sperimentali con punti tecnici chiave sono descritte nella Figura 2.
Figura 1: I benefici di G. mellonella come modello di infezione. Questa cifra è stata adattata da Kavanagh e Sheehan22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Struttura delle procedure sperimentali. (A) Manutenzione e preparazione di G. mellonella per l'infezione da M. bovis BCG lux. (B) Preparazione della coltura del lux BCG e inoculo per l'infezione. (C) Infezione di G. mellonella con BCG lux. (D) Misurazione della virulenza e onere in vivo di BCG lux nelle larve di G. mellonella. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La virulenza dipendente dalla dose di lux BCG è stata osservata nelle larve di G. mellonella in un periodo di incubazione di 96 h (Figura3), e la dose letale richiesta per il 50% di mortalità larvale (LD50) è stata determinata come 1 x 107 CFU. La distribuzione di sopravvivenza che riflette la virulenza delle dosi di lux BCG testate era significativamente diversa (p < 0,0001). I gruppi di controllo iniettati con una dose di 10 -L di PBS-T o quelli semplicemente pungenti simulando le lesioni dell'ago, non hanno influenzato la salute larvale o hanno portato ad un aumento della mortalità come determinato da controlli osservazionali sulla motilità e la metanizzazione in diversi punti temporali.
Figura 3: Curva di sopravvivenza Kaplan-Meir di G. mellonella in risposta alla variazione di inoculo di M. bovis BCG lux. Larve sane (n - 10 per gruppo), sono state infettate con dosi variabili di BCG lux. Le larve sono state incubate a 37 gradi centigradi e monitorate per la sopravvivenza ogni 24 h fino a 96 h. Il gruppo non infetto è stato iniettato con PBS, e un gruppo pungente (solo inserimento dell'ago) ha dimostrato l'effetto della lesione dell'ago sulla salute larvale. Vengono mostrati i mezzi di due esperimenti indipendenti, con intervallo di confidenza del 95%, rappresentati come linee tratteggiate nel colore corrispondente all'inoculum. Questa cifra è stata adattatada Li et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tutte le larve infettate da BCG lux mostravano cambiamenti fisiologici nel tempo e, per le larve infettate da una dose 2 x 107 CFU di BCG lux, la melanizzazione della linea dorsale larvale è stata osservata da 48 h post infezione (pi), e sistematica melanizzazione è stata osservata da 96 h pi (Figura 4). Inoltre, la motilità delle larve si è ridotta con la gravità della melanizzazione e la capacità delle larve di pupate è stata persa dopo l'infezione rispetto ai controlli non infetti.
Figura 4: Melanizzazione di G. mellonella in risposta all'infezione da M. bovis BCG lux. Larve sane a 0 h sono state infettate da una dose 2 x 107 CFU di BCG lux. A 48 h e 96 h pi, è stata osservata la melanizzazione lungo la linea dorsale larvale e la melanizzazione sistematica, rispettivamente.
La sopravvivenza del lux BCG all'interno delle larve di G. mellonella è stata determinata per 2 settimane attraverso la misurazione della bioluminescenza degli omogenei larvali. L'infezione con una dose di BCG lux da 1 x 107 ha provocato un declino iniziale della bioluminescenza del lux BCG da 0-72 h pi. Tuttavia, a partire da 72-144 h pi, la bioluminescenza del BCG lux si è stabilizzato, indicando l'istituzione di un'infezione persistente (Figura 5).
Figura 5: Onere in vivo di M. bovis BCG lux in G. mellonella quantificato utilizzando la bioluminescenza (unità di luce relativa, RLU/mL) per un corso di tempo di due settimane. Larve sane (n - 30) sono state infettate con 1 x 107 dose di CFU di BCG lux. L'onere in vivo è stato quantificato omogeneizzando cinque larve ad ogni punto temporale (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h) e misurando la bioluminescenza dell'omogenea. Vengono mostrati i mezzi di tre esperimenti indipendenti e le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media. Questa cifra è stata ristampata daLi et al. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Poiché la quantificazione rapida e riproducibile della crescita micobatterica in vivo in questi studi è stata determinata dalla misurazione della bioluminescenza, il rapporto tra RLU e CFU dovrebbe essere determinato anche in vivo. Nel nostro particolare sistema di infezione, il rapporto in vivo di RLU e CFU variava da 2:1-5:1, con una media di 4:1 nel corso temporale di 168 ore (Figura 6).
Figura 6: Determinazione del rapporto RLU/CFU in vivo di M. bovis BCG lux in G. mellonella. Larve sane (n - 30) sono state infettate con 1 x 107 dose di CFU di BCG lux. Ad ogni momento (0, 24, 96 e 168 h), quattro larve infette (PBS-T) sono state omogeneizzate e gli oomogenei sono stati misurati per la bioluminescenza e placcati su 7H11 agar per enumerare i conteggi CFU. Vengono mostrati i mezzi di due esperimenti indipendenti e le barre di errore rappresentano la deviazione standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'uso di G. mellonella come modello di infezione è stato stabilito per un certo numero di patogeni batterici e fungini per lo studio della virulenza, dell'interazione ospite-patogeno, e come schermo per nuove terapie10,22. La discussione seguente si basa sulla procedura sperimentale per l'utilizzo di G. mellonella come modello di infezione per la MTBC.
La salute delle larve ingenue prima della sperimentazione può avere un notevole impatto sull'esito dell'esperimento. Pertanto, è fondamentale che le larve scolorite e/o ferite vengano rimosse all'arrivo e non vengano utilizzate per alcuna sperimentazione. Se un gran numero di larve vengono trovate morte all'interno dello stesso contenitore all'arrivo, è consigliabile scartare il lotto poiché infezioni preesistenti possono essere la causa della morte. Quando possibile eseguire esperimenti utilizzando le larve il più vicino al giorno di acquisto / arrivo. Prima dell'uso assicurarsi di conservare le larve a 18 gradi centigradi per prevenire l'upupazione e per massimizzare il numero di larve disponibili per la sperimentazione. Le larve sane possono essere utilizzate fino a 7 giorni dopo la consegna/acquisto. In seguito all'infezione, assicurarsi di rimuovere eventuali larve morte dal piatto di Petri come, per ragioni ancora sconosciute, la presenza di larve morte sembra aumentare il tasso di mortalità nella popolazione campione. Per gli utenti di larve autoallevate, è importante essere consapevoli della variabilità biologica rispetto alle larve acquistate, poiché la varianza nelle condizioni di dieta e di crescita può avere un impatto sull'immunità larvale21,23. Le variabili intersperimentali possono essere limitate mantenendo coerente la fonte, se acquistata, o le condizioni di alimentazione e crescita delle larve allevate tra la sperimentazione. In tutti gli esperimenti, l'inclusione di controlli negativi "vuoti" e "spinti" sono essenziali; il controllo vuoto è un indicatore di contaminazione o tossicità della matrice di sospensione (bPB-T o brodo dei media), e il controllo pungente imita l'effetto della lesione dell'ago sulla salute larvale. Inoltre, questi controlli normalizzano qualsiasi variazione biologica tra lotti di larve, garantendo riproducibilità e precisione tra gli esperimenti.
Per l'iniezione di larve di G. mellonella, l'uso di un ago da 25 G è raccomandato in quanto gli aghi calibro più grandi possono causare un'eccessiva emorragia e aghi calibro più affilati più piccoli possono facilmente forare l'intestino delle larve, portando alla mortalità larva e al falso Risultati. I metodi convenzionali di iniezione dell'ago in genere immobilizzano le larve a mano, il che aumenta il rischio di lesioni da ago. Utilizzando una pinzetta per immobilizzare le larve, il rischio di lesioni abastone è significativamente ridotto in quanto la mano non è in prossimità dell'ago in qualsiasi momento durante l'infezione. In alternativa, le larve potrebbero essere immobilizzate mediante raffreddamento. Tuttavia, lo shock da freddo a 12 gradi centigradi per 15 minuti prima dell'infezione è stato documentato per migliorare la risposta immunitaria innata all'infezione. Pertanto, l'analisi dei risultati ottenuti tramite raffreddamento dovrebbe considerare attentamente il suo impatto24. Utilizzando la nostra tecnica, la media throughput di iniezione (2-3 larve al minuto) può essere raggiunto con la pratica dell'utente; questo è paragonabile alla velocità dell'iniezione convenzionale dalla nostra esperienza (3,4 larve al min). Inoltre, il nostro metodo può essere adattato per un'iniezione di throughput più elevata utilizzando una piattaforma di iniezione azionata a pedale composta da una pompa di infusione con una siringa usa e getta collegata a una cannula a farfalla da 25 G.
La preparazione di BCG lux inoculum si basa sulla rapida stima della CFU utilizzando RLU della coltura micobatterica20. Nella nostra esperienza con la cultura del brodo, il rapporto tra RLU e CFU è di 3:120,in contrasto con il lux BCG in g. mellonella dove il rapporto Tra RLU e CFU è 5:120. L'aggregazione delle cellule micobatteriche o il "clumping" comunemente osservati nelle colture dense possono avere un impatto sulle misurazioni rLU, poiché l'agglomeramento può portare a misurazioni di bioluminescenza inaffidabili. Come tale, l'uso di coltura micobatterica raggruppata per la preparazione dell'inoculo non è raccomandato. Tuttavia, l'aggiunta di polisorbate 80 ai mezzi di crescita riduce al minimo l'agglomerazione delle cellule senza alterare la crescita di BCG lux. 16 Qualsiasi agglomeramento cellulare minore può essere risolto lavando la coltura con PBS-T ed è fondamentale per preparare un inoculum accurato utilizzando RLU come lettura. Inoltre, il lavaggio PBS-T è fondamentale per rimuovere qualsiasi fattore di virulenza extracellulare secreto durante la crescita. Anche il ceppo micobatterico e il numero di passaggio dovrebbero essere presi in considerazione, in quanto ciò può influire sulla gravità dell'aggregazione micobatterica25. In tutti i casi, l'inoculum deve essere elencato dalla CFU su piastre di agar 7H11 per garantire che la CFU corretta sia stata preparata mediante misurazione della bioluminescenza. Inoltre, il rapporto RLU/CFU in vivo deve essere determinato con nuovi reporter o azioni bioluminescenti, poiché il rapporto varierà probabilmente.
G. mellonella offre diversi vantaggi rispetto ai modelli convenzionali di infezione da TB, tra cui costi di acquisizione e manutenzione più economici, facilità di infezione e velocità effettiva di ricerca, soprattutto in combinazione con ceppi bioluminescenti16. La mancanza di vincoli etici consente una maggiore dimensione del campione (minimo 20-30 larve per gruppo) rispetto ai modelli di mammiferi, dando maggiore fiducia e affidabilità nei risultati ottenuti26,27. Tuttavia, ci sono una serie di limitazioni nell'uso di G. mellonella come modello di infezione. Come un invertebrato, naturalmente manca l'immunità adattativa che li rende inadatti per l'antigenicità o studi immunologici10. Le risposte immunitarie innate cellulari di G. mellonella sono costituite da un certo numero di tipi di emociti, e plasmatociti e granulociti sono stati segnalati per funzionare in modo simile ai fagociti mammiferi (neutrofili e macrofagi)12. Tuttavia, il ruolo e i meccanismi di questi tipi di cellule rimangono sotto caratterizzato, e studi comparativi diretti tra mammiferi e insetti fagociti devono ancora essere effettuati. Inoltre, la mancanza di un genoma Annotato G. mellonella ostacola l'analisi della risposta dell'ospite all'infezione, e questo è attualmente dipendente dall'analisi dell'ontologia genica contro le librerie trascrittomiche di altri invertebrati, come la Drosophila melanogaster e Bombyx mori28.
Come modello di infezione da TB, G. mellonella ha un futuro promettente con la sua capacità di sviluppare strutture simili a granuloma in risposta all'infezione di lusso BCG16, che sono segni distintivi patofisiologici vitali dell'infezione da TB e sono una chiave nello sviluppo di LTBI. Il lavoro futuro mirerà a caratterizzare questo modello con un particolare interesse per la formazione di strutture simili ai granulomi utilizzando isolare Mtb clinici e clinici di riferimento in condizioni CL3. Inoltre, prevediamo che può essere utile anche per lo screening di nuovi agenti anti-micobatterici, come un modello G. mellonella simile è stato utilizzato per NTM18, ma questo rimane da determinare. L'adozione di questo modello ha la capacità di ridurre significativamente il numero di animali utilizzati all'interno della comunità di ricerca sulla TB, accelerando contemporaneamente la produzione di ricerca in vivo sulla TB in condizioni eticamente più accettabili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato sostenuto da sovvenzioni del Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC), assegnate a PRL e YL (BB/P001262/1), e del National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3R) assegnato a PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
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