Summary
Galleria mellonella wurde vor kurzem als reproduzierbares, billiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für den Mycobacterium tuberculosis-Komplex etabliert. Hier beschreiben und zeigen wir die Schritte, die unternommen wurden, um eine erfolgreiche Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux zu etablieren.
Abstract
Tuberkulose ist die weltweit führende Ursache für die Sterblichkeit von Infektionskrankheiten und etwa ein Viertel der Weltbevölkerung wird angenommen, dass sie mit Mycobacterium tuberculosisinfiziert ist. Trotz jahrzehntelanger Forschung müssen viele der Mechanismen hinter dem Erfolg von M. tuberculosis als pathogener Organismus noch untersucht werden, und die Entwicklung sichererer, wirksamerer antimykobakterieller Medikamente ist dringend erforderlich, um dem Anstieg und der Ausbreitung der medikamentenresistenten Tuberkulose. Das Fortschreiten der Tuberkuloseforschung wird jedoch durch traditionelle Säugetierinfektionsmodelle, die teuer, zeitaufwändig und ethisch anspruchsvoll sind, in einen Engpass gesteckt. Zuvor haben wir die Larven des Insekts Galleria mellonella (größere Wachsmotte) als neuartiges, reproduzierbares, kostengünstiges, hochdurchlässiges und ethisch akzeptables Infektionsmodell für Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes etabliert. Hier beschreiben wir die Erhaltung, Zubereitung und Infektion von G. mellonella mit biolumineszierendem Mycobacterium bovis BCG lux. Mit diesem Infektionsmodell kann eine mykobakterielle dosisabhängige Virulenz beobachtet werden, und eine schnelle Auslesung der in vivo mykobakteriellen Belastung mittels Biolumineszenzmessungen ist leicht erreichbar und reproduzierbar. Obwohl es Einschränkungen gibt, wie das Fehlen eines vollständig kommentierten Genoms für die transkriptomische Analyse, kann eine ontologische Analyse gegen genetisch ähnliche Insekten durchgeführt werden. Als kostengünstiges, schnelles und ethisch akzeptables Modell für Tuberkulose kann G. mellonella als Vorscreen verwendet werden, um die Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln zu bestimmen und die vergleichende mykobakterielle Virulenz vor der Anwendung konventioneller Säugetiere zu bestimmen. Modelle. Die Verwendung des G. mellonella-Mykobakterien-Modells wird zu einer Verringerung der beträchtlichen Anzahl von Tieren führen, die derzeit in der Tuberkuloseforschung verwendet werden.
Introduction
Tuberkulose (TB) stellt eine große Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit dar, mit 9 Millionen neuen Fällen pro Jahr und 1,5 Millionen Todesfällen1. Darüber hinaus wird geschätzt, dass ein Viertel der Weltbevölkerung mit dem Erreger der Krankheit infiziert ist, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Unter der infizierten Bevölkerung werden 5 bis 10 % im Laufe ihres Lebens eine aktive TB-Krankheit entwickeln. Darüber hinaus stellt das Aufkommen und die Ausbreitung von multiresistentem (MDR) und extensiv-medikamentösem (XDR) resistentem Mtb eine ernste Bedrohung für die Seuchenbekämpfung dar, wobei 123 Länder mindestens einen XDR-Fallmelden 1. Die Behandlung von TB erfordert einen Cocktail von mindestens vier antimykobakteriellen Medikamenten, von denen Isoniazid und Rifampicin für eine Mindestdauer von sechs Monaten verschrieben werden; Behandlung ist oft mit komplexen Nebenwirkungen und Toxizitäten verbunden. Der Schutz vor dem einzigen zugelassenen Impfstoff gegen TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ist variabel2. Ein unvollständiges Verständnis der Pathogenese von TB behindert die Entwicklung neuer Therapie- und Impfstrategien erheblich.
Seit Jahrzehnten sind Tierinfektionsmodelle für die TB-Forschung von entscheidender Bedeutung, um die grundlegende Pathogenese und die Wirtsreaktion auf Infektionen zu verstehen und neuartige antimykobakterielle Wirkstoffe, Immuntherapeutika und neue Impfstoffkandidaten zu bewerten3, 4. Die Forschung mit Tierinfektionsmodellen von TB ist jedoch notorisch schwierig, da die Pathogenese und das Fortschreiten der TB-Infektion komplex sind und es kein einzelnes Tiermodell gibt, das das gesamte Spektrum und wichtige Merkmale der Krankheit imitiert5 ,6. Darüber hinaus sind Tierversuche teuer, zeitaufwändig und erfordern eine vollständige ethische Rechtfertigung. Dennoch wurden Tierinfektionsmodelle von TB bei nichtmenschlichen Primaten (z. B. Makaken), Meerschweinchen, Kaninchen, Rindern, Schweinen, Mäusen und Zebrafischen beschrieben, wobei jeder seine Einschränkungenhat 3,4. Das murine Modell ist das am häufigsten verwendete Modell aufgrund von Kosten, Verfügbarkeit von inzuchtlinien, Reproduzierbarkeit der Infektion und Fülle von immunologischen Reagenzien. Sie bilden jedoch in der Regel keine Granulome, die mit Hypoxiegebieten assoziiert sind, die für eine latente Tuberkuloseinfektion (LTBI) charakteristisch sind (LTBI)6. Meerschweinchen sind sehr anfällig für Mtb-Infektionen, mit Pathologie und frühe Granulombildung ähnlich denen beim Menschen, und sind weit verbreitet in Impfstofftests verwendet; doch der Mangel an immunologischen Reagenzien behindert ihre Verwendung als Infektionsmodell7. Zebrafische eignen sich aufgrund ihrer geringen Größe, schnellen Fortpflanzung und fortgeschrittenen genetischen Werkzeuge für großangelegte Screenings in präklinischen Studien im Frühstadium, sind aber anatomisch und physiologisch verschieden vom Menschen und nur anfällig für Mycobacterium marinum Infektion3. Die Tiermodelle, die der menschlichen Mtb-Infektion am ehesten ähneln, sind nichtmenschliche Primaten (z.B. der Makaken), aber sie sind teuer und haben erhebliche ethische und praktische Überlegungen, die ihre Verwendung erheblich einschränkt8.
Die Insektenlarven der größeren Wachsmotte oder Wabenmotte,Galleria mellonella, sind als Infektionsmodell für eine Vielzahl von bakteriellen und Pilzpathogenen9und als Bildschirm für neuartige antimikrobielle Wirkstoffkandidaten immer beliebter geworden. 10. G. mellonella ist ein erfolgreiches Wirbellosenmodell aufgrund seines ausgeklügelten angeborenen Immunsystems (bestehend aus zellulären und humoralen Abwehrmaßnahmen), das einen hohen Grad an struktureller und funktioneller Ähnlichkeit mit dem von Wirbeltieren teilt11 . Dazu gehören Immunmechanismen wie die Phagozytose von Krankheitserregern durch Hämozyten (funktionell ähnlich wie Säugetiermakrophagen und Neutrophile)12,13, die Produktion und Zirkulation von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und Komplement-ähnliche Proteine innerhalb der Hämolymphe (analog zum Säugetierblut) von G. mellonella11. Weitere Vorteile9,14,15 von G. mellonella Larven als Modell sind 1) ihre große Größe (20 x 30 mm), die eine einfache Manipulation und Infektion ermöglicht, sowie die Sammlung von Gewebe und Hämolymphe für Analysen, 2) einfache Wartung bei 37 °C, kompatibel zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger, 3) präzise Injektion ohne Anästhesie, 4) Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe kann mit weniger Wirkstoff zur Bewertung beurteilt werden, 5) Mangel an ethische Zwänge im Vergleich zur Verwendung von Säugetieren, 6) große Gruppengrößen können im Vergleich zu Tiermodellen verwendet werden, die eine größere Reproduzierbarkeit ermöglichen, und 7) kürzere Zeiten für Infektionsexperimente sind erforderlich.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass G. mellonella als neuartiges Infektionsmodell zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen durch biolumineszierende M. bovis BCG lux, eine genetisch veränderte Version des Impfstoffstamms und des Mtb-Komplexes (MTBC)16. Während G. mellonella bisher als Infektionsmodell für nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) verwendet wurde, sind vor allem M. marinum und Mycobacterium abscessus17,18, Studien mit MTBC auf die von Li et al.16. Biolumineszierende nichtpathogene mykobakterielle Stämme, die auf Containment-Ebene (CL) 2 als Ersatz für Mtb eingesetzt werden können, bieten die Vorteile von Sicherheit und Praktikabilität gegenüber pathogenen Mykobakterien. Nach der Infektion mit BCG luxbeginnen Larven, frühe granulomähnliche Strukturen zu entwickeln, die wertvolle Einblicke in die Rolle der angeborenen Immunität bei der Etablierung einer TB-Infektion bieten könnten16. Darüber hinaus hat dieses einfache Modell für wirbellose Infektionen das Potenzial, eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Bewertung der TB-Pathogenese zu ermöglichen, die eine kontrollierte Herausforderung und mehrere Replikationen zur Reproduzierbarkeit umfasst. Darüber hinaus hat das Modell das Potenzial, in der frühen Entwicklung neue Anti-TB-Medikamente und Impfstoffkandidaten zu testen, wodurch die Gesamtzahl der Versuchstiere reduziert wird. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Wirts- und Pathogenstruktur, Transkriptom und Proteom zu messen, um Arzneimittelziele zu bestimmen und Wirkmechanismen neuartiger Medikamente und therapeutischer Impfstoffe zu bewerten, ist ebenfalls von Vorteil.
Hier beschreiben wir die experimentellen Protokolle zur Herstellung eines biolumineszierenden M. bovis BCG lux inoculum und G. mellonella larven für mykobakterielle Infektionen, sowie die Bestimmung von Larven und mykobakteriellen Überleben als Reaktion auf eine Infektion.
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Protocol
HINWEIS: Alle nachstehend beschriebenen Arbeiten sind in einem CL2-Labor innerhalb eines mikrobiologischen Sicherheitsschranks der Klasse 2 (MSC) gemäß den örtlichen Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien durchzuführen.
1. Vorbereitung von M. bovis BCG lux für Infektionen
- Auftauen eines gefrorenen 1,2 ml Glycerins (15%) Bestand von M. bovis BCG lux, dem Montrealer Impfstoffstamm, der mit dem Shuttle-Plasmid pSMT1 transformiert wurde, das die LuxAB-Gene von Vibrio harveyi trägt, die für das Luciferase-Enzym19kodieren.
- Impfung 15 ml Middlebrook 7H9 Brühe mit 0,2% Glycerin, 10% Albumin, Dextrose, Kataalase (ADC) Anreicherung und 50 g/ml Hygromycin mit einem aufgetauten 1,2 ml Aliquot von BCG lux, in einem gekennzeichneten 250 mL Erlenmeyer Kolben.
- Den Kolben in einen versiegelten Biosicherheitsbehälter geben und bei 37 °C in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 220 U/min für 72 h (oder bis die Kultur die Wachstumsphase erreicht) inkubieren.
- Überprüfen Sie das Wachstum der BCG-Lux-Kultur, indem Sie 1:10 Verdünnungen der Kultur in Luminometer-Röhren mit Phosphatgepufferter Saline (PBS, pH 7,4, 0,01 M Phosphatpuffer, 0,0027 M Kaliumchlorid und 0,137 M Natriumchlorid) in duplizierter Verwendung vorbereiten. Vortex, und laden Sie die Luminometer-Röhren in das Luminometer und messen Sie die Biolumineszenz (relative Lichteinheit [RLU]/mL) mit n-Decylaldehyd als Substrat (1% v/v in absolutem Ethanol)20.
HINWEIS: Das Verhältnis der RLU/Kolonie bildenden Einheiten (CFU) wurde zuvor auf 3:1 festgelegt, als BCG lux in vitro in Middlebrook 7H9 Brühe20angebaut wurde. - Zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.175 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pellet und den Überstand in ein geeignetes Desinfektionsmittel mit bekannter mykobakterizidischer Aktivität zu entsorgen. Entsorgen Sie alle Kulturabfälle mit Desinfektionsmitteln, die für Mykobakterien geeignet sind, und folgen Sie den örtlichen Richtlinien.
- Waschen Sie das Zellpellet zweimal in PBS mit 0,05% Polysorbat 80 (PBS-T), um bakterielle Verklumpung zu verhindern.
- Nach der Endwäsche, Dekant-Abfallüberstand, setzen Sie das mykobakterielle Zellpellet in PBS-T wieder auf und verdünnen Sie die mykobakterielle Suspension mit RLU-Messungen auf die gewünschte Zelldichte.
- Mit PBS-T die zehnfache serielle Verdünnung des Inokulums in 24-Well-Platten vorbereiten. Plate out 10 l auf Middlebrook 7H11 Agar-Platten (0,5% Glycerin, 50 g/mL Hygromycin, 10% Ölsäure, Albumin, Dextrose, Kataalase [OADC]) in dupliziert, um Inokulum CFU-Zahlen aufzuzählen.
2. Zubereitung von G. mellonella Larven
- Kaufen Sie die letzten Instar-Larven aus geeigneten Quellen und halten Sie die Larven bei der Ankunft bei 18 °C und verwenden Sie sie innerhalb von 1 Woche nach dem Kauf. Alternativ können Larven nach dem Protokoll von Jojao et al.21selbst gezüchtet werden. Entsorgen Sie bei gekauften Larven alle toten, verfärbten oder verpupten Larven vor der Lagerung.
HINWEIS: Verpupatierende Larven sind morphologisch von den letzten Insternlarven unterscheidbar. - Identifizieren und wählen Sie gesunde Larven für Experimente, basierend auf gleichmäßiger Cremefarbe mit wenig bis gar keiner Verfärbung (Melanisierung), Größe (2 x 3 cm Länge), Gewicht (ca. 250 mg), mit einem hohen Maß an Beweglichkeit und besitzen die Fähigkeit, richtig sich selbst, wenn sie umgedreht werden.
- Zählen Sie die gesunden Larven (mindestens 20 bis 30 pro Gruppe) sorgfältig in eine Petrischale (94/15 mm), die mit einer Schicht Filterpapier (94/15 mm) ausgekleidet ist, indem Sie eine stumpfe Pinzette verwenden, um die Kontamination zu minimieren und bei Raumtemperatur im Dunkeln bis zum Gebrauch aufzubewahren.
3. Infizieren von G. mellonella mit BCG lux
- Minimieren Sie die Unordnung innerhalb des MSC, um das Risiko von Kontaminationen und Nadelstichverletzungen zu reduzieren.
- Bereiten Sie die Injektionsplattform vor, indem Sie ein kreisförmiges Filterpapier (94 mm) auf eine flache erhöhte Oberfläche kleben. Weiche oder harte Oberflächen können verwendet werden und sind vollständig von der Benutzerpräferenz abhängig, z. B. Pipettenkastendeckel oder ein Nylon-Scheuerschwamm.
- Sterilisieren Sie eine 25-L-Mikrospritze (25 g) durch Ansaugung von 3 Volumen von 70% Ethanol und weitere Spülung mit 3 Volumen sterilen PBS-T.
- Aspirieren Sie 10 l BCG Lux Inokulum (in Abschnitt 1) oder PBS-T in die sterilisierte 25-L-Mikrospritze. Verwenden Sie eine separate Spritze für die PBS-T-Negativkontrolle.
HINWEIS: Setzen Sie das BCG lux inoculum nach 10 Injektionen aus, um eine gleichmäßige Zellsuspension zu gewährleisten. - Verwenden Sie eine Pinzette, um eine Larve aufzunehmen und auf die Injektionsplattform zu legen.
- Auf der Plattform, kippen Sie die Larve auf den Rücken und immobilisieren, indem Sie den Kopf und Schwanz mit der Pinzette zu sichern. Suchen Sie das letzte linke Probe, das vom Kopf der Larve nach unten zählt, und legen Sie die Spitze der Nadel (5 x 6 mm) vorsichtig in einem Winkel von 10 bis 20° auf die horizontale Ebene ein.
HINWEIS: Kurze und schmale Pinzetten ermöglichen eine einfache Immobilisierung bei minimalem Larvenstress. Achten Sie darauf, nicht über eindringen, die den Darm punktieren und verursachen Nicht-BCG Lux spezifische Melanisierung oder Tod. - Zählen Sie die infizierten Larven in eine Petrischale, die mit einer Schicht Filterpapier ausgekleidet ist, eine einzelne 90 mm Petrischale kann bis zu 30 Larven aufnehmen.
- Bewahren Sie die Petrischale mit den Larven in einer belüfteten oder nicht versiegeltendunklen Box in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 auf.
4. Überwachung des Überlebens von G. mellonella nach der Infektion
- Überwachen Sie im Laufe des Zeitverlaufs alle 24 h das Überleben der Larven. Larven gelten als tot, wenn sie sich nicht als Reaktion auf Berührung bewegen.
5. Messung der In-Vivo-Belastung von BCG lux in G. mellonella
- Wählen Sie zu jedem Zeitpunkt nach dem Zufallsprinzip fünf infizierte Larven aus, die zuvor in Abschnitt 3 hergestellt wurden, und sterilisieren Sie die Larvenoberflächen vorsichtig mit Wattestäbchen, die in 70 % Ethanol getränkt sind.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, wenn Larvenhomogenat für die mykobakterielle KBE-Enumeration als nicht sterilisierte Larven kontaminiert werden kann. - Die Larven einzeln in 2 ml Lysing-Matrix-Röhrchen geben, die 800 l steriles PBS enthalten.
- Homogenisieren Sie die Larven mit einem Homogenisator für 60 s bei 6,0 m/s.
- Zentrifugieren Sie die Lysing-Rohre bei 3.500 x g für 5 s, um Homogenat aus den Deckeln zu entfernen, und dekannieren Sie das Homogenat sorgfältig einzeln in sterile Luminometerröhren.
HINWEIS: Achten Sie bei der CFU-Enumeration (Schritt 5.7) darauf, 100 l Homogenat in einem sterilen 1,5 ml Reaktionsrohr zu reservieren. - Stellen Sie alle verbleibenden Homogenate wieder her, indem Sie die Lysing-Matrixrohre mit 1 ml PBS-T und Pipette in die entsprechenden Luminometer-Rohre waschen.
- Wirbeln Sie die Luminometerröhren und messen Sie die Biolumineszenz der zuvor in Schritt 1.4 beschriebenen Homogenate.
- Mit PBS-T die zehnfache serielle Verdünnung des Homogenats in 24-Well-Kulturplatten vorbereiten. Verfestigen Sie 10 l der Verdünnung auf Middlebrook 7H11 Agarplatten, die 0,5 % Glycerin, 50 g/ml Hygromycin, 10 % OADC und 20 g/ml Piperacillin enthalten, um das RLU/CFU-Verhältnis von BCG Lux nach in vivo-Infektion zu bestimmen.
HINWEIS: Piperacillin eliminiert native G. mellonella Mikrobiota mit minimaler Wachstumshemmung von BCG lux16.
6. Statistische Analyse
- Zeichnen Sie die Kaplan-Meier-Überlebenskurve anhand der gesammelten Daten und führen Sie den Mantel-Cox(Log-Rank)-Test durch, um die Signifikanz des Ergebnisses zu bestimmen, wobei *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 und ****p < 0.0001.
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Representative Results
Hier stellen wir repräsentative Daten vor, die mit dem Modell g. mellonella — BCG lux infektionsmodell erhalten werden können und heben die Vorteile von G. mellonella als Infektionsmodell für Mitglieder des MTBC hervor (Abbildung 1). Experimentelle Verfahren mit wichtigen technischen Punkten sind in Abbildung 2beschrieben.
Abbildung 1: Die Vorteile von G. mellonella als Infektionsmodell. Diese Figur wurde von Kavanagh und Sheehan22adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gliederung der experimentellen Verfahren. (A) Wartung und Vorbereitung von G. mellonella zur Infektion mit M. bovis BCG lux. (B) Vorbereitung der BCG-Luxkultur und inokulum zur Infektion. (C) Infektion von G. mellonella mit BCG lux. (D) Messung der Virulenz und In-vivo-Belastung von BCG lux bei G. mellonella Larven. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
BCG Lux dosisabhängige Virulenz wurde bei G. mellonella Larven über eine 96 h Inkubationszeit beobachtet (Abbildung 3), und die für 50% Larvensterblichkeit (LD50)erforderliche tödliche Dosis wurde auf 1 x 107 KBE festgelegt. Die Überlebensverteilung, die die Virulenz der getesteten BCG-Lux-Dosen widerspiegelt, war signifikant unterschiedlich (p < 0.0001). Kontrollgruppen, die mit einer Dosis von 10 L PBS-T injiziert wurden, oder solche, die einfach simulierte Nadelverletzungen gestochen haben, haben keine Auswirkungen auf die Gesundheit der Larven oder führen zu einer Erhöhung der Sterblichkeit, wie sie durch Beobachtungskontrollen der Beweglichkeit und Melanisierung zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt wird.
Abbildung 3: Kaplan-Meir-Überlebenskurve von G. mellonella als Reaktion auf die unterschiedliche Inocula von M. bovis BCG lux. Gesunde Larven (n 10 pro Gruppe) wurden mit unterschiedlichen Dosen von BCG Luxinfiziert. Larven wurden bei 37 °C inkubiert und alle 24 h bis zu 96 h auf überleben überwacht. Die nicht infizierte Gruppe wurde mit PBS injiziert, und eine gestochene Gruppe (nur das Einsetzen von Nadeln) zeigte die Wirkung von Nadelverletzungen auf die Gesundheit der Larven. Die Mittel zweier unabhängiger Experimente werden mit einem Konfidenzintervall von 95 % dargestellt, das als gepunktete Linien in entsprechender Farbe zum Inokulum dargestellt wird. Diese Figur wurde von Li et al.16adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Alle mit BCG lux infizierten Larven zeigten physiologische Veränderungen im Laufe der Zeit und bei Larven, die mit einer 2 x 107 KBE-Dosis von BCG Luxinfiziert waren, wurde eine Melanisierung der Larven-Rückenlinie von 48 h nach der Infektion (pi) beobachtet und systematisch Melanisierung wurde von 96 h pi beobachtet (Abbildung 4). Darüber hinaus verringerte sich die Beweglichkeit der Larven mit der Schwere der Melanisierung und die Fähigkeit der Larven zu verpupaten ging bei der Infektion im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen verloren.
Abbildung 4: Melanisierung von G. mellonella als Reaktion auf eine Infektion mit M. bovis BCG lux. Gesunde Larven bei 0 h wurden mit einer 2 x 107 KBE-Dosis von BCG Luxinfiziert. Bei 48 h bzw. 96 h pi wurde eine Melanisierung entlang der Larvendorsallinie bzw. eine systematische Melanisierung beobachtet.
Das Überleben von BCG lux innerhalb der G. mellonella Larven wurde über 2 Wochen durch Biolumineszenzmessung von Larvenhomogenaten bestimmt. Eine Infektion mit einer 1 x 107 KBE-Dosis von BCG Lux führte zu einem anfänglichen Rückgang der BCG-Lux-Biolumineszenz von 0 bis 72 h pi. Jedoch, von 72-144 h pi, die Biolumineszenz von BCG lux Plateau, was auf die Etablierung einer anhaltenden Infektion (Abbildung5).
Abbildung 5: In-vivo-Belastung von M. bovis BCG lux in G. mellonella quantifiziert mit Biolumineszenz (relative Lichteinheit, RLU/mL) über einen zweiwöchigen Zeitverlauf. Gesunde Larven (n = 30) wurden mit 1 x 107 KBE-Dosis BCG Luxinfiziert. Die In-vivo-Belastung wurde quantifiziert, indem jeweils fünf Larven (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h) homogenisiert und die Biolumineszenz des Homogenats gemessen wurden. Die Mittel werten drei unabhängige Experimente aus, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar. Diese Zahl wurde von Li et al.16nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Da die schnelle und reproduzierbare Quantifizierung des in vivo mykobakteriellen Wachstums in diesen Studien durch die Messung der Biolumineszenz bestimmt wurde, sollte auch das Verhältnis von RLU und CFU in vivo bestimmt werden. In unserem speziellen Infektionssystem lag das In-vivo-Verhältnis von RLU und CFU zwischen 2:1-5:1, mit einem Durchschnitt von 4:1 über den 168-h-Zeitkurs (Abbildung6).
Abbildung 6: Bestimmung des in vivo RLU/CFU-Verhältnisses von M. bovis BCG lux in G. mellonella. Gesunde Larven (n = 30) wurden mit 1 x 107 KBE-Dosis BCG Luxinfiziert. Zu jedem Zeitpunkt (0, 24, 96 und 168 h) wurden vier infizierte/Kontrolllarven (PBS-T) homogenisiert, und die Homogenate wurden auf Biolumineszenz gemessen und auf 7H11 Agar aufgebracht, um die KBE-Zahlen aufzuzählen. Die Mittel wertet zwei unabhängige Experimente aus, und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell wurde für eine Reihe von bakteriellen und Pilzpathogenen für die Untersuchung von Virulenz, Wirt-Pathogen-Interaktion, und als Bildschirm für neuartige Therapeutika10,22etabliert. Die folgende Diskussion basiert auf dem experimentellen Verfahren zur Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell für die MTBC.
Die Gesundheit der naiven Larven vor dem Experimentieren kann einen erheblichen Einfluss auf das Ergebnis des Experiments haben. Daher ist es wichtig, dass alle verfärbten und/oder verletzten Larven bei der Ankunft entfernt werden und nicht für Experimente verwendet werden. Wenn eine große Anzahl von Larven bei der Ankunft tot im selben Behälter gefunden werden, ist es ratsam, die Charge zu entsorgen, da bereits bestehende Infektionen die Todesursache sein können. Wenn möglich, führen Sie Experimente mit den Larven in der Nähe des Tages des Kaufs / Ankunft. Vor der Verwendung stellen Sie sicher, dass die Larven bei 18 °C gelagert werden, um eine Verdunstung zu verhindern und die Anzahl der larven zu maximieren, die für Experimente zur Verfügung stehen. Gesunde Larven können bis zu 7 Tage nach der Lieferung/dem Kauf verwendet werden. Nach der Infektion, stellen Sie sicher, alle toten Larven aus der Petrischale zu entfernen, da aus noch unbekannten Gründen das Vorhandensein von toten Larven scheint die Sterblichkeitsrate in der Probenpopulation zu erhöhen. Für Anwender von selbst gezüchteten Larven ist es wichtig, sich der biologischen Variabilität im Vergleich zu gekauften Larven bewusst zu sein, da Varianz in Ernährung und Wachstumsbedingungen einen Einfluss auf die Larvenimmunität21,23haben kann. Interexperimentelle Variabilitäten können begrenzt werden, indem die Quelle, wenn sie gekauft wird, oder die Futter- und Wachstumsbedingungen der aufgezogenen Larven zwischen den Experimenten konsistent bleiben. In allen Experimenten ist die Einbeziehung von "leeren" und "gestachelten" Negativkontrollen von wesentlicher Bedeutung; Die Blankokontrolle ist ein Indikator für die Kontamination oder Toxizität der Suspensionsmatrix (PBS-T oder Medienbrühe), und die gestochene Kontrolle imitiert die Wirkung der Nadelverletzung auf die Larvengesundheit. Darüber hinaus normalisieren diese Kontrollen jede biologische Variation zwischen Larvenchargen und gewährleisten so die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit zwischen den Experimenten.
Für die Injektion von G. mellonella Larven wird die Verwendung einer 25 G Nadel empfohlen, da größere Messgeräte zu übermäßigen Blutungen führen können und schärfere kleinere Nadeln leicht den Darm der Larven durchstechen können, was zu Larvensterblichkeit und falsch positivem Ergebnisse. Herkömmliche Methoden der Nadelinjektion in der Regel immobilisieren die Larven von Hand, die das Risiko von Nadelverletzungen erhöht. Durch den Einsatz einer Pinzette zur Immobilisierung der Larven wird das Risiko einer Nadelstichverletzung deutlich reduziert, da sich die Hand während der Infektion zu keinem Zeitpunkt in unmittelbarer Nähe zur Nadel befindet. Alternativ könnten Larven durch Abkühlen immobilisiert werden. Jedoch, Kälteschock bei 12 °C für 15 min vor der Infektion wurde dokumentiert, um die angeborene Immunantwort auf Infektionen zu verbessern. Daher sollte die Analyse der Ergebnisse, die durch Kühlung erzielt werden, sorgfältig ihre Auswirkungen berücksichtigen24. Mit unserer Technik kann ein mittlerer Injektionsdurchsatz (2 bis 3 Larven pro Minute) mit Anwenderpraxis erreicht werden; dies ist vergleichbar mit der Geschwindigkeit der konventionellen Injektion aus unserer Erfahrung (3-4 Larven pro min). Darüber hinaus kann unser Verfahren für die Einspritzung mit höherem Durchsatz angepasst werden, indem eine pedalbetriebene Injektionsplattform verwendet wird, die aus einer Infusionspumpe mit einer Einwegspritze besteht, die mit einer 25 G Schmetterlingskanüle verbunden ist.
Die Herstellung von BCG lux inoculum basiert auf der schnellen Schätzung der CFU unter Verwendung von RLU der mykobakteriellen Kultur20. Nach unserer Erfahrung mit Brühekultur beträgt das Verhältnis von RLU zu CFU 3:120, im Gegensatz zu BCG Lux, der in G. mellonella wächst, wo das RLU-CFU-Verhältnis 5:120beträgt. Mykobakterielle Zellaggregation oder "Klumpenbildung", die häufig in dichten Kulturen zu finden ist, kann sich auf die RLU-Messungen auswirken, da Verklumpen zu unzuverlässigen Biolumineszenzmessungen führen kann. Daher wird die Verwendung von verklumpter mykobakterieller Kultur zur Inokulumzubereitung nicht empfohlen. Die Zugabe von Polysorbat 80 zu den Wachstumsmedien minimiert jedoch das Zellverklumpen, ohne das Wachstum von BCG luxzu verändern. 16 Jede kleinere Zellverklumpung kann durch Waschen der Kultur mit PBS-T gelöst werden und ist entscheidend für die Vorbereitung eines genauen Inokulums mit RLU als Auslese. Darüber hinaus ist die PBS-T-Wäsche entscheidend, um alle extrazellulären Virulenzfaktoren zu entfernen, die während des Wachstums sezerniert werden. Mykobakterielle Stamm- und Durchgangszahl sollte ebenfalls berücksichtigt werden, da diesdie Schwere der mykobakteriellen Aggregation 25 beeinflussen kann. In allen Fällen sollte das Inokulum von der KBE auf 7H11-Agarplatten aufgezählt werden, um sicherzustellen, dass die richtige KBE durch Biolumineszenzmessung hergestellt wurde. Darüber hinaus sollte das RLU/KFU-Verhältnis in vivo mit neuen biolumineszierenden Reportern oder Beständen bestimmt werden, da das Verhältnis wahrscheinlich variieren wird.
G. mellonella hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Modellen der TB-Infektion, einschließlich billigerer Anschaffungs- und Wartungskosten, leichter Infektion und Forschungsdurchsatz, insbesondere in Kombination mit biolumineszierenden Stämmen16. Der Mangel an ethischen Zwängen ermöglicht eine größere Stichprobengröße (mindestens 20 bis 30 Larven pro Gruppe) im Vergleich zu Säugetiermodellen, was ein größeres Vertrauen und eine größere Zuverlässigkeit in die erzielten Ergebnisse von26,27ermöglicht. Jedoch, Es gibt eine Reihe von Einschränkungen in der Verwendung von G. mellonella als Infektionsmodell. Als Wirbellose, Sie natürlich fehlt adaptive Immunität macht sie ungeeignet für Antigenität oder immunologische Studien10. Zelluläre angeborene Immunantworten von G. mellonella bestehen aus einer Reihe von Hämozytentypen, und Plasmatozyten und Granulozyten funktionieren berichten ähnlich wie Säugetierphagozyten (Neutrophile und Makrophagen)12. Die Rolle und die Mechanismen dieser Zelltypen sind jedoch nach wie vor untercharakterisiert, und direkte Vergleichsstudien zwischen Säugetier- und Insektenphagozyten müssen noch durchgeführt werden. Darüber hinaus behindert das Fehlen eines kommentierten G. mellonella-Genoms die Analyse der Wirtsreaktion auf Infektionen, und dies ist derzeit auf eine Gen-Ontologie-Analyse gegen transkriptomische Bibliotheken anderer wirbelloser Tiere wie Drosophila angewiesen. melanogaster und Bombyx mori28.
Als TB-Infektionsmodell hat G. mellonella eine vielversprechende Zukunft mit seiner Fähigkeit, granulomähnliche Strukturen als Reaktion auf BCG Lux-Infektion16zu entwickeln, die wichtige pathophysiologische Merkmale der TB-Infektion sind und ein Schlüsselsind sind in der Entwicklung von LTBI. Zukünftige Arbeiten werden darauf abzielen, dieses Modell mit einem besonderen Interesse an der Bildung von granulomähnlichen Strukturen unter Verwendung von Referenz-, klinischen und mutierten Mtb-Isolaten unter CL3-Bedingungen zu charakterisieren. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass es auch für neuartige antimykobakterielle Wirkstoff-Screening nützlich sein kann, da ein ähnliches G. mellonella-Modell für NTMs18verwendet wurde, aber dies muss noch ermittelt werden. Die Einführung dieses Modells hat die Fähigkeit, die Anzahl der in der TB-Forschungsgemeinschaft verwendeten Tiere deutlich zu reduzieren und gleichzeitig die In-vivo-TB-Forschungsergebnisse unter ethisch akzeptableren Bedingungen zu beschleunigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse des Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC) unterstützt, das PRL und YL (BB/P001262/1) und dem National Center for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) an PRL, SMN, BDR und YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
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