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Immunology and Infection

利用无脊椎杆菌作为感染模型研究结核分枝杆菌复合物

doi: 10.3791/59703 Published: June 30, 2019
* These authors contributed equally

Summary

最近,肺结核分枝杆菌的可重复、廉价和合乎道德的感染模型被确立为一种可重复、廉价和合乎道德的感染模式。在这里,我们描述和演示了为成功感染生物发光分枝杆菌BCG lux而采取的措施。

Abstract

结核病是全球传染病死亡的主要原因,全世界约有四分之一的人口被认为感染了结核分枝杆菌。尽管进行了几十年的研究,但结核病作为致病性有机体成功背后的许多机制仍有待研究,迫切需要开发更安全、更有效的抗菌药物,以应对其上升趋势和耐药结核病的传播。然而,结核病研究的进展受到传统哺乳动物感染模式的瓶颈,这种模式成本高昂、耗时且在伦理上具有挑战性。此前,我们建立了昆虫巨虫(大蜡蛀虫)的幼虫,作为一种新颖的、可重复的、低成本的、高通量的、在伦理上可接受的感染模型,适用于M.结核病复合体的成员。在这里,我们描述了G.梅隆藻的维护,制备和感染与生物发光分枝杆菌BCG lux。使用这种感染模型,可以观察到分菌剂量依赖性毒性,并且使用生物发光测量快速读出体内的分体剂负担是很容易实现的和可重复的。尽管存在局限性,例如缺乏用于转录组分析的完全带批过的基因组,但可以对基因相似的昆虫进行本体分析。作为一种低成本、快速且道德上可接受的结核病模型,G. mellonella可用作预筛选,以确定药物疗效和毒性,并在使用传统哺乳动物之前确定比较分线杆菌毒性模型。使用G.梅隆氏杆菌模型将减少目前用于结核病研究的大量动物数量。

Introduction

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结核病是全球公共卫生的主要威胁,每年有900万新发病例和150万例死亡。此外,据估计,世界人口的四分之一感染了该病的病原体,肺结核分枝杆菌(Mtb)。在受感染人群中,5-10%的人在其一生中会发展为活动性结核病。此外,耐多药药(MDR)和广泛耐药Mtb的出现和蔓延对疾病控制构成严重威胁,123个国家报告至少有一例XDR病例1。结核病的治疗需要至少四种抗霉菌药物的鸡尾酒,其中无尼菌和利福平的处方期限至少为六个月;治疗通常与复杂的副作用和毒性相关。唯一获得许可的结核病疫苗,博维斯杆菌杆菌(BCG)的保护是可变的2。对结核病发病机制的不完全了解严重阻碍了新的治疗和疫苗接种策略的发展。

几十年来,动物感染模型对于结核病研究了解感染的基本发病机制和宿主反应,以及评估新型抗分菌制剂、免疫疗法和新疫苗候选药物至关重要。 4.然而,使用结核病动物感染模型的研究是出了名的困难,因为结核病感染的发病机制和进展是复杂的,并且没有一个单一的动物模型可以模仿疾病的全部谱系和重要特征5 ,6.此外,动物实验费用昂贵,耗时,需要充分的道德理由。然而,在非人类灵长类动物(如猴)、豚鼠、兔子、牛、猪、小鼠和斑马鱼中,有结核病的动物感染模型,每种都有其局限性3、4。由于成本、近亲繁殖系的可用性、感染的可重复性和免疫试剂的丰富性,鼠类模型是最常用的模型。然而,它们通常不会形成与缺氧区域相关的肉芽肿,这些缺氧区域是潜伏性肺结核感染(LTBI)6。几内亚猪极易感染Mtb,病理学和早期肉芽瘤形成与人类相似,并广泛用于疫苗测试;然而,缺乏免疫试剂阻碍了他们作为感染模式7的使用。斑马鱼由于其体积小、繁殖速度快、遗传工具先进,在临床前研究中适合大规模筛选,但在解剖学和生理上与人类不同,只易受到分枝杆菌感染3.最类似于人类Mtb感染的动物模型是非人类灵长类动物(例如,猴),但它们价格昂贵,并且具有重要的伦理和实际考虑,大大限制了它们的使用8。

大蜡蛀虫或蜂窝蛀虫的昆虫幼虫,作为各种细菌和真菌病原体的感染模型,作为新型抗菌药物候选药物的屏幕,已越来越受欢迎10. G. 梅隆纳是一个成功的无脊椎动物模型,由于其复杂的先天免疫系统(由细胞和体液防御组成),与脊椎动物的高度结构和功能相似性11.这包括免疫机制,如血细胞对病原体的噬菌体(功能上类似于哺乳动物巨噬细胞和嗜中性粒细胞)12、13、抗微生物肽(AMPs)的生产和循环,以及G. 梅隆内拉11的血淋巴(类似于哺乳动物血液)中的补体状蛋白质。其他优势9,14,15G. 梅隆拉幼虫模型包括 1) 其大尺寸 (20–30 毫米), 允许容易的操作和感染, 以及组织和收集用于分析的溶量,2)在37°C下易于维护,兼容研究人类病原体,3)无需麻醉而注射精确感染,4)抗菌剂的疗效可评估使用较少的药物进行评估,5)缺乏与使用哺乳动物相比,伦理限制,6)大组尺寸可以使用相比动物模型,允许更大的可重复性,7)更短的时间进行感染实验。

在最近的一项研究中,我们证明了G.mellonella可以作为一种新的感染模型来研究生物发光M.bovis BCG lux的感染发病机制,这是一种转基因版本的疫苗菌株和成员Mtb综合体(MTBC)16虽然G. 梅隆纳以前曾被用作非结核分枝杆菌(NTM)的感染模型,主要是M.Marinum和分枝杆菌肿17,18,使用MTBC的研究仅限于李等人的16。生物致发光非致病性分枝杆菌菌株,可在密封水平(CL)2用作Mtb的代用品,比致病性分枝杆菌具有安全性和实用性的优点。在感染BCG lux后,幼虫开始发展早期肉芽肿样结构,这可能为了解先天免疫在结核病感染16的建立中的作用提供有价值的见解。此外,这种简单的无脊椎动物感染模型有可能为结核病发病机制提供快速、低成本和可靠的评估,包括受控挑战和多重复制,以实现可重复性。此外,该模型还有可能用于筛选早期开发中的新型抗结核药物和疫苗候选药物,从而减少实验动物的总数。测量宿主和病原体结构、转录组和蛋白酶的变化以确定药物靶点和评估新药和治疗性疫苗作用机制的能力也是有益的。

在这里,我们描述了制备生物发光体 M. bovis BCG lux 接种剂G. 梅隆ella幼虫用于分体细菌感染的实验方案,以及幼虫和分乳杆菌的测定因感染而存活。

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Protocol

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注:以下描述的所有工作均需在 CL2 实验室内按照当地健康和安全准则在 2 类微生物安全柜 (MSC) 内进行。

1. 培养M. bovis BCG lux感染

  1. 解冻冷冻1.2 mL甘油(15%)库存M.bovis BCG lux, 蒙特利尔疫苗菌株与穿梭质粒pSMT1转换携带从Vibrio哈维维编码荧光酶酶19的luxAB基因.
  2. 接种15 mL的米德布鲁克7H9汤含有0.2%甘油,10%白蛋白,德克斯罗斯,催化酶(ADC)浓缩和50μg/mL湿霉素与BCG lux的解冻1.2 mL阿利胶,在标签250 mL Erlenmeyer烧瓶。
  3. 将烧瓶放入密封的生物安全容器中,在220 rpm的轨道摇床培养箱中以37°C孵育72小时(或直到培养达到生长的中生阶段)。
  4. 使用磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH 7.4,0.01 M 磷酸盐缓冲液,0.0027 M 氯化钾和 0.137 M 氯化钠)在灯具管中制备 1:10 稀释培养物,检查 BCG lux培养物的生长情况。涡旋,并将发光仪管加载到灯具中,并使用n-decyl醛作为基质测量生物发光(相对光单位[RLU]/mL)20。
    注:RLU/殖民地形成单位(CFU)的比例先前被确定为3:1,当BCG lux在米德布鲁克7H9肉汤20体中体外生长。
  5. 在室温下将培养物在2,175 x g下离心10分钟,将细胞颗粒化,并将上清液丢弃到具有已知菌球活性的适当消毒剂中。按照当地指南,使用适合分枝杆菌的消毒剂处理所有培养废物。
  6. 在含有0.05%聚糖80(PBS-T)的PBS中清洗细胞颗粒两次,以防止细菌结块。
  7. 最后洗涤后,去胶废物上清液,在PBS-T中重新悬浮分菌细胞颗粒,并使用RLU测量将分片菌悬浮液稀释至所需的细胞密度。
  8. 使用 PBS-T 在 24 孔板中制备 10 倍的电解连续稀释。在米德布鲁克 7H11 琼脂板(0.5% 甘油、50 μg/mL 湿霉素、10% 油酸、白蛋白、脱氧糖、催化酶 [OADC])中,在重复中加入 10 μL,以枚举接种 CFU 计数。

2.准备G.梅洛内拉拉·拉瓦

  1. 从适当的来源购买最后一个星幼虫,并在抵达后18°C的暗处保持幼虫,并在购买后1周内使用。或者,幼虫可以按照Jojéo等人21的协议进行自我饲养。对于购买的幼虫,在储存前丢弃任何死、变色或幼虫。
    注:幼虫在形态上与最后一个星幼虫有区别。
  2. 识别和选择健康的幼虫进行实验,基于均匀的奶油色,很少或没有变色(黑色素),大小(2⁄3厘米的长度),重量(约250毫克),显示高水平的运动,并具有正确的能力自己,当翻身。
  3. 仔细计数健康的幼虫(每组至少20-30),放入培养皿(94/15毫米),内衬一层过滤纸(94/15毫米),使用钝端钳子,以尽量减少污染,并在黑暗中储存在室温下,直到使用。

3. 用 BCG lux感染G. 梅洛内拉

  1. 尽量减少 MSC 内的杂物,以降低污染和针棒损伤的风险。
  2. 将圆形滤纸(94 mm)贴在平坦的凸起表面上,准备喷射平台。可以使用软或硬表面,完全取决于用户偏好,例如移液盒盖或尼龙冲刷海绵。
  3. 通过吸气 3 卷 70% 乙醇,用 3 卷无菌 PBS-T 进一步冲洗,对 25 μL 微注射器 (25 G) 进行消毒。
  4. 将 BCG lux接种液(在第 1 节中制备)或 PBS-T 吸气 10 μL,吸入灭菌的 25 μL 微注射器中。使用单独的注射器进行 PBS-T 阴性控制。
    注:在10次注射后重新暂停BCG lux接种,以确保细胞悬浮均匀。
  5. 使用钳子拿起一个幼虫,并放置在注射平台上。
  6. 在平台上,将幼虫翻转到其背上,然后用钳子固定头部和尾部,从而固定。从幼虫头找到最后一个左前倾计数点,并小心地将针尖(5⁄6 mm)以 10±20° 角插入水平平面。
    注:短和窄钳子允许以最小的幼虫应力轻松固定。注意不要过度渗透,这可能刺穿肠道,并导致非BCG lux特异性黑色素或死亡。
  7. 将受感染的幼虫计数到培养皿中,内衬一层过滤纸,一个90毫米的培养皿可以容纳多达30个幼虫。
  8. 将含有幼虫的培养皿储存在37°C的孵化器内,并储存在通风箱内或非密封的暗箱中,并含有5%的CO2。

4. 监测感染后麦龙拉的存活率

  1. 随着时间的推移,每24小时监测幼虫的存活率。当幼虫在接触时无法移动时,它们被认为是死亡的。

5. 测量在G.梅洛内拉的BCG lux的Vivo负担

  1. 在每个时间点,随机选择5个以前在第3节中制备的受感染幼虫,并使用浸泡在70%乙醇中的棉芽拭子轻轻消毒幼虫表面。
    注:当为分菌CFU枚举电幼虫均质酸盐时,此步骤非常重要,因为非灭菌幼虫可能导致污染。
  2. 将幼虫单独放入含有800μL无菌PBS的2 mL解液基质管中。
  3. 在 6.0 m/s 下使用均质器使幼虫变质 60 s。
  4. 以 3,500 x g的离心,以 5 s 分离,从盖子上去除均质,并小心地将均质单独排入无菌灯具管中。
    注:对于 CFU 枚举(步骤 5.7),确保在无菌 1.5 mL 反应管中保留 100 μL 的均质。
  5. 将含有 1 mL PBS-T 和移液器的解液基管洗入相应的灯具管中,以恢复剩余的均质。
  6. 涡流光度计管,测量步骤 1.4 中前面描述的均质物的生物发光。
  7. 使用 PBS-T 在 24 孔培养板中制备均质的十倍连续稀释。将10μL的稀释量镀在米德布鲁克7H11琼脂板上,含有0.5%甘油、50微克/mL湿霉素、10%OADC和20μg/mL烟碱,以确定体内感染后BCG lux的RLU/CFU比。
    注:Piperacillin消除了本地G.梅洛内拉微生物群与BCG lux16最小生长抑制。

6. 统计分析

  1. 使用收集的数据绘制卡普兰-迈尔生存曲线,并执行曼特尔-考克斯(日志排名)测试,以确定结果的重要性,其中 _p < 0.05、_p <#p < 0.001 和 _p <

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Representative Results

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在这里,我们提出了可以使用G.梅隆纳和BCG lux感染模型获得的代表性数据,并强调了G.梅洛内拉作为MTBC成员感染模型的好处(图1)。图2概述了具有关键技术点的实验程序。

Figure 1
图1:G.梅隆内拉作为感染模型的好处。这个数字是从卡瓦纳和希恩22改编而成的。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:实验程序大纲。(A) 维护和准备G. 梅隆内拉感染M. bovis BCG lux.(B) 培养 BCG lux培养和接种的感染。(C) G. 梅隆内拉感染 BCG lux.(D)在G.梅隆拉幼虫体内BCG lux的毒性和体内负担的测量。请点击此处查看此图的较大版本。

在96小时潜伏期(图3)期间,在G.mellonella幼虫中观察到BCG lux剂量依赖性毒性,确定50%幼虫死亡率(LD50)所需的致命剂量为1 x 107 CFU。反映BCG lux剂量测试的毒性的存活率分布明显不同(p < 0.0001)。注射10μL剂量的PBS-T或那些只是刺打模拟针损伤的对照组,不影响幼虫健康,或导致死亡率上升,通过观察检查运动和黑色素在不同时间点确定。

Figure 3
图3:卡普兰-梅尔生存曲线的G.梅洛内拉响应M.bovis BCG lux的不同接种。健康幼虫(n = 每组10),感染了不同剂量的BCG lux。幼虫在37°C下孵育,每24小时监测一次生存,长达96小时。未感染的组被注射PBS,一个刺群(仅插入针头)表明针损伤对幼虫健康的影响。显示了两个独立实验的方法,置信区间为 95%,表示为与接种点对应颜色的虚线。这个数字是根据李等人16日改编的。请点击此处查看此图的较大版本。

所有感染 BCG lux的幼虫都显示随时间的变化,对于感染 2 x 107 CFU 剂量的 BCG lux的幼虫,从感染后 48 小时 (pi) 观察到幼虫背线的黑色化,并系统地进行从96小时pi(图4)观察到黑色化。此外,与未感染的对照组相比,幼虫在感染后失去活力,因黑色素化的严重程度而降低,幼虫的幼虫对幼虫的增泡能力丧失。

Figure 4
图4:对M.bovis BCG lux的感染,对G.梅隆内拉的美兰化作出反应。健康幼虫在0小时被感染2 x 107 CFU剂量的BCG lux。在48小时和96小时pi,分别观察到沿幼虫背线的黑色化和系统黑色化。

通过对幼虫均质物的生物发光测量,在2周内测定了G.mellonella幼虫体内BCG lux的存活率。感染 1 x 107 CFU 剂量的 BCG lux导致 BCG lux生物发光最初从 0–72 h pi 下降。然而,从72-144 h pi开始,BCG lux的生物发光趋于稳定,表明持续感染的建立(图5)。

Figure 5
图5:在两周时间内使用生物发光(相对光单位,RLU/mL)对G.梅隆纳中的M.bovis BCG lux的体内负担进行量化。健康的幼虫(n = 30)感染了1 x 107 CFU剂量的BCG lux。在体内,通过在每个时间点(0、24、48、72、96、168、336 h)对5个幼虫进行均质化,并测量均质的生物发光,对体内负担进行了量化。显示了三个独立实验的方法,误差条表示均值的标准偏差。这个数字已由李等人转载。请点击此处查看此图的较大版本。

由于这些研究中体内分组菌生长的快速和可重复定量是由生物发光的测量决定的,因此RLU和CFU的比例也应在体内确定。在我们的特定感染系统中,RLU 和 CFU 的体内比在 2:1-5:1,在 168-h 时间过程中平均为 4:1(图6)。

Figure 6
图6:确定M.bovis BCG lux在G.梅洛内拉的体内RLU/CFU比。健康的幼虫(n = 30)感染了1 x 107 CFU剂量的BCG lux。在每个时间点(0、24、96 和 168 h),将 4 个受感染/对照 (PBS-T) 幼虫同质化,并测量同质物进行生物发光,并镀出 7H11 琼脂以枚举 CFU 计数。显示了两个独立实验的方法,误差条表示均值的标准偏差。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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利用G.mellonella作为感染模型,为一些细菌和真菌病原体的研究毒性,宿主-病原体相互作用,并作为屏幕为新的治疗10,22。以下讨论基于使用G.梅隆内拉作为MTBC感染模型的实验程序。

实验前幼虫的健康会对实验结果产生相当大的影响。因此,任何变色和/或受伤的幼虫在抵达时被移除,并且不用于任何实验,这一点至关重要。如果抵达时发现大量幼虫死在同一容器内,建议丢弃该批次,因为先前存在的感染可能是死亡原因。如果可能,在接近购买/到达当天时使用幼虫进行实验。使用前,确保将幼虫储存在18°C,以防止幼虫出现幼虫,并最大限度地增加可用于实验的幼虫数量。健康幼虫可在交货/购买后长达7天使用。感染后,确保从培养皿中取出任何死幼虫,因为由于未知的原因,死亡幼虫的存在似乎会增加样本人群的死亡率。对于自食其果幼虫的用户,重要的是要意识到与购买的幼虫相比的生物变异性,因为饮食和生长条件的差异会对幼虫免疫21,23产生影响。实验间变异性可以通过保持来源(如果购买)或实验间饲养幼虫的饲料和生长条件保持一致来加以限制。在所有实验中,必须纳入"空白"和"刺"负控制;空白控制是悬浮基质(PBS-T或介质汤)的污染或毒性指标,刺伤控制模拟针损伤对幼虫健康的影响。此外,这些对照组使幼虫批次之间的任何生物变异标准化,确保实验之间的可重复性和准确性。

对于注射G. 梅隆拉幼虫,建议使用25G针,因为较大的针可能导致过度出血,更锋利的较小量表针很容易刺穿幼虫的肠道,导致幼虫死亡和假阳性结果。传统的注射针头方法通常用手固定幼虫,这增加了针损伤的风险。通过使用钳子固定幼虫,针棒损伤的风险大大降低,因为手在感染期间的任何时候不靠近针头。或者,幼虫可以通过冷却而固定。然而,在感染前12°C的冷休克已有记录,以增强对感染的先天免疫反应。因此,分析通过冷却获得的结果应仔细考虑其影响24。利用我们的技术,通过用户实践,可以达到注射的中等吞吐量(每分钟2⁄3幼虫);从我们的经验来看,这与常规注射的速度相当(每分钟3⁄4幼虫)。此外,我们的方法可以通过利用踏板操作的注射平台来适应更高的通量注射,该平台由输注泵和一次性注射器连接到25 G蝴蝶管上组成。

BCG lux接种的制备是基于使用分体菌培养20的RLU快速估计CFU。根据我们关于肉汤文化的经验,RLU与CFU的比率是3:120,与BCG lux在G.梅洛内拉增长,其中RLU与CFU的比率是5:120。在致密培养物中常见的分体细胞聚集或"结块"会对 RLU 测量产生影响,因为结块可能导致不可靠的生物发光测量。因此,不建议使用结块分菌培养物进行接种。然而,在生长介质中加入聚糖80可最大限度地减少细胞结块,而不改变BCG lux的生长。16任何轻微的细胞结块都可以通过用PBS-T洗涤培养体来解决,对于使用RLU作为读出来制备准确的接种液至关重要。此外,PBS-T 洗涤对于去除生长过程中分泌的任何细胞外毒性因子至关重要。分菌菌株和通过数也应考虑,因为这可能影响分菌聚集25的严重程度。在所有情况下,CFU 应在 7H11 琼脂板上枚举接种,以确保通过生物致发光测量制备正确的 CFU。此外,体内的RLU/CFU比率应通过新的生物发光报告器或股票来确定,因为该比率可能会有所不同。

与传统的结核病感染模式相比,G. mellonella具有多种优势,包括更低的采集和维护成本、易于感染和研究吞吐量,特别是与生物发光菌株16相结合。与哺乳动物模型相比,缺乏伦理约束使得样本量(每组至少20-30只幼虫)更大,在26、27的结果中给予更大的信心和可靠性。然而,在使用G.梅隆内拉作为感染模型存在一些限制。作为一种无脊椎动物,它们自然缺乏适应性免疫能力,因此不适合抗原化或免疫学研究。G. mellonella的细胞先天免疫反应由多种血细胞类型组成,据报道,血浆细胞和粒细胞的功能与哺乳动物的噬细胞(嗜中性球细胞和巨噬细胞)12类似。然而,这些细胞类型的作用和机制仍然具有特征,哺乳动物和昆虫噬细胞之间的直接比较研究尚未进行。此外,缺乏带批的G.mellonella基因组阻碍了对宿主对感染反应的分析,目前,这依赖于基因本体分析,针对其他无脊椎动物的转录库,如果蝇梅拉诺加斯特庞比克斯森28日。

作为结核病感染模型,G. mellonella具有光明的未来,它有能力开发肉芽肿样的结构,以应对 BCG lux感染16,这是结核病感染的重要病理生理学特征,也是关键LTBI 开发中的特点。未来的工作将旨在描述这种模式,特别感兴趣的是利用参照物、临床和突变Mtb分离物在CL3条件下形成肉芽肿样结构。此外,我们预计它也可用于新型抗异种细菌制剂的筛选,因为类似的G.梅隆拉模型用于NTMs18,但这仍有待确定。采用这一模型能够大大减少结核病研究社区中使用的动物数量,同时在道德上更可接受的条件下加速体内结核病研究产出。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

该项目得到了生物技术和生物科学研究理事会(BBSRC)的赠款支持,赠款授予PRL和YL(BB/P001262/1),以及国家研究动物替代、改良和减少中心(NC3R),授予PRL,SMN、BDR 和 YL (NC/R001596/1)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tube (Eppendorf) Eppendorf 22431021
20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips Any supplier n/a
24 well culture plate Greiner 662160
25 mL pipettes and pipette boy Any supplier n/a
3 compartment Petri dish (94/15 mm) Greiner 637102
Centrifuge Any supplier n/a
Class II saftey cabinet Any supplier n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) Corning CLS40183
Ethanol (>99.7%) VWR 208221.321
Galleria mellonella (250 per pk) Livefood Direct UK W250
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) MP Biomedicals 116005500
Hygromycin B Corning 30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953) Berthold 34622
Luminometer tubes Corning 352054
Lysing matrix (S, 2.0 mL) MP Biomedicals 116925500
Micro syringe (25 µL, 25 G) SGE 3000
Microcentrifuge Any supplier n/a
Middlebrook 7H11 agar BD Bioscience 283810
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience 271310
Middlebrook ADC enrichment BD Bioscience 212352
Middlebrook OADC enrichment BD Bioscience 212240
Mycobacterium bovis BCG lux Various n/a
n-decyl aldehyde Sigma-Aldrich D7384-100G
Orbital shaking incubator Any supplier n/a
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80) Sigma-Aldrich P8074-500ml
Small box Any supplier n/a dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer Any supplier n/a Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08) Berthold n/a Program LB953.TTB
Petri dish (94/15 mm) Greiner 633181
Filter paper (94 mm) Any supplier n/a Cut to fit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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利用无脊椎<em>杆菌</em>作为感染模型研究<em>结核分枝杆菌</em>复合物
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Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).More

Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).

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