Summary
Galleria mellonella blev for nylig etableret som en reproducerbar, billig, og etisk acceptabel infektion model for Mycobacterium tuberkulose kompleks. Her beskriver og demonstrerer vi de skridt, der er taget for at etablere en vellykket infektion af G. mellonella med bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux.
Abstract
Tuberkulose er den førende globale årsag til dødeligheden blandt smitsomme sygdomme, og omkring en fjerdedel af verdens befolkning menes at være inficeret med Mycobacterium tuberkulose. Trods årtiers forskning er mange af mekanismerne bag succesen med M. tuberkulose som en patogen organisme endnu ikke undersøgt, og udviklingen af sikrere og mere effektive Antimykobakterielle lægemidler er tvingende nødvendige for at tackle stigningen og spredning af lægemiddel resistent tuberkulose. Udviklingen af tuberkulose forskning er imidlertid flavoret af traditionelle pattedyrs infektions modeller, som er dyre, tidskrævende og etisk udfordrende. Tidligere etablerede vi larverne af insektet Galleria mellonella (større voks møl) som en roman, reproducerbar, lav pris, høj-gennemløb og etisk acceptabel infektion model for medlemmer af M. tuberkulose kompleks. Her beskriver vi vedligeholdelse, klargøring og infektion af G. mellonella med bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux. Ved hjælp af denne infektions model kan der observeres mykobakteriel dosisafhængig virulens, og en hurtig aflæsning af in vivo-mykobakteriel byrde ved hjælp af bioluminiscenmålinger er let opnåelig og reproducerbar. Selv om der findes begrænsninger, såsom manglen på et fuldt kommenteret genom til transkriptomic analyse, kan der foretages en ontologisk analyse mod genetisk lignende insekter. Som en lav pris, hurtig og etisk acceptabel model for tuberkulose, G. mellonella kan bruges som en pre-Screen til at bestemme lægemidlets virkning og toksicitet, og til at bestemme komparativ mycobakterielle virulens før brugen af konventionelle pattedyr Modeller. Anvendelsen af G. mellonella-mycobakterier-modellen vil føre til en reduktion af det betydelige antal dyr, der i øjeblikket anvendes til tuberkulose forskning.
Introduction
Tuberkulose (TB) er en stor trussel mod den globale folkesundhed med 9.000.000 nye tilfælde om året og 1.500.000 dødsfald1. Desuden skønnes det, at en fjerdedel af verdens befolkning er inficeret med sygdommens sygdomsfremkaldende agens, Mycobacterium tuberkulose (MTB). Blandt den inficerede population vil 5 − 10% udvikle aktiv TB-sygdom i løbet af deres levetid. Desuden udgør fremkomsten og spredningen af multi-drug resistente (MDR) og ekstensivt-Drug (XDR) resistent MTB en alvorlig trussel mod sygdomsbekæmpelse, med 123 lande, der rapporterer mindst én XDR sag1. Behandling af TB kræver en cocktail af mindst fire anti-mykobakterielle lægemidler, hvoraf isoniazid og rifampicin ordineres i en periode på mindst seks måneder; behandling er ofte forbundet med komplekse bivirkninger og toksiciteter. Beskyttelse mod den eneste licenserede vaccine mod TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), er variabel2. En ufuldstændig forståelse af patogenesen af TB hæmmer i væsentlig grad udviklingen af nye terapeutiske og vaccinationsstrategier.
I årtier har dyre infektions modeller været afgørende for TB-forskning for at forstå den grundlæggende patogenese og vært respons på infektion, og for at vurdere nye anti-mykobakterielle midler, immuno-Therapeutics og nye vaccinekandidater3, 4. men, forskning ved hjælp af dyre infektion modeller af TB er notorisk svært som patogenesen og progression af TB-infektion er komplekse, og der er ingen enkelt dyr model, der efterligner det fulde spektrum og vigtige træk ved sygdommen5 ,6. Desuden er dyreforsøg dyre, tidskrævende at gennemføre og kræver fuld etisk begrundelse. Ikke desto mindre er dyre infektions modeller af TB blevet beskrevet i ikke-humane primater (f. eks. makakaber), marsvin, kaniner, kvæg, grise, mus og zebrafisk, idet hver af dem har deres begrænsninger på3,4. Den murine model er den mest almindeligt anvendte model på grund af omkostningerne, tilgængeligheden af indavlede linjer, reproducerbarhed af infektion og overflod af immunologiske reagenser. Men, de ikke typisk danner granulomer forbundet med områder af hypoxi, der er karakteristiske for latent tuberkuloseinfektion (LTBI)6. Marsvin er meget modtagelige for MTB infektion, med patologi og tidlig granuloma dannelse svarende til dem i mennesker, og er meget udbredt i vaccine test; men manglen på immunologiske reagenser hæmmer deres anvendelse som en infektion model7. Zebrafish er velegnet til storstilet screening i tidlige stadie prækliniske studier på grund af deres lille størrelse, hurtige reproduktion og avancerede genetiske værktøjer, men er anatomisk og fysiologisk forskellige for mennesker og er kun modtagelige for Mycobacterium Marinum infektion3. De dyremodeller, der mest ligner humane MTB -infektioner, er ikke-menneskelige primater (f. eks. makakkerne), men de er dyre og har væsentlige etiske og praktiske overvejelser, som begrænser deres anvendelse betydeligt8.
Den insekt larve af de større voks møl eller Honeycomb møl, Galleria mellonella, er blevet stadig mere populære som en infektion model for en bred vifte af bakterielle og svampe patogener9, og som en skærm for nye antimikrobielle stof kandidater 10. G. mellonella er en succesfuld Invertebrat model på grund af sit sofistikerede medfødte immunsystem (bestående af cellulære og humorale forsvar), der deler en høj grad af strukturel og funktionel lighed med, at hvirveldyr11 . Dette omfatter immun mekanismer såsom fagocytose af patogener af hæocytter (funktionelt svarer til pattedyrs makrofag og neutrofiler)12,13, produktion og cirkulation af antimikrobielle peptider (ampere) og komplement lignende proteiner i hæmolymph (analogt med pattedyr blod) af G. mellonella11. Andre fordele9,14,15 af G. mellonella larver som model omfatter 1) deres store størrelse (20 − 30 mm), som giver mulighed for nem manipulation og infektion, samt indsamling af væv og hæmolymph til analyser, 2) nem vedligeholdelse ved 37 °C, kompatibel til at studere humane patogener, 3) præcis infektion ved injektion uden behov for anæstesi, 4) effekten af antimikrobielle stoffer kan vurderes udnytte mindre lægemiddel til evaluering, 5) manglende etiske begrænsninger sammenlignet med brug af pattedyr, 6) store gruppestørrelser kan anvendes sammenlignet med dyremodeller, der giver større reproducerbarhed, og 7) kortere tid for infektions forsøg er påkrævet.
I en nylig undersøgelse, viste vi, at G. mellonella kan bruges som en ny infektion model for at studere patogenesen af infektion med bioluminescent M. bovis BCG Lux, en genetisk modificeret version af vaccinestammen og medlems af MTB Complex (mtbc)16. Mens G. mellonella tidligere har været anvendt som infektions model for ikke-tuberkuløse mykobakterier (NTM), hovedsagelig M. Marinum og Mycobacterium abscessus17,18, er studier med mtbc begrænset til af Li et al.16. Bioluminescerende ikke-patogene mykobakterielle stammer, som kan anvendes på indeslutningsniveau (CL) 2 som et surrogat for MTB, tilbyder fordelene ved sikkerhed og funktionalitet over patogene mykobakterier. Efter infektion med BCG Luxbegynder larverne at udvikle tidlige granuloma-lignende strukturer, som kan give værdifuld indsigt i den medfødte Immunitets rolle ved etablering af TB-infektion16. Desuden, denne enkle hvirvelløse infektion model har potentiale til at give en hurtig, billig, og pålidelig evaluering af TB patogenesen indarbejde kontrolleret udfordring og flere replikater for reproducerbarhed. Desuden har modellen potentialet til at blive brugt til at screene nye anti-TB-lægemidler og vaccinekandidater i den tidlige udvikling, hvilket reducerer det samlede antal dyr i eksperimenter. Evnen til at måle ændringer i Host og patogen struktur, transkriptomer og proteom til at bestemme narkotika mål og vurdere virkningsmekanismer af nye lægemidler og terapeutiske vacciner, er også fordelagtige.
Her beskriver vi forsøgsprotokollerne til forberedelse af en bioluminescent M. bovis BCG Lux inokulum og G. mellonella larver til mykobakteriel infektion, samt bestemmelse af både larve og mykobakterielle overlevelse som reaktion på infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: alt arbejde, der er beskrevet nedenfor, skal udføres i et CL2-laboratorium i et mikrobiologisk sikkerhedskabinet i klasse 2 (MSC) efter lokale sundheds-og sikkerhedsretningslinjer.
1. klargøring af M. bovis BCG Lux for infektion
- Optøning af en frossen 1,2 mL glycerol (15%) lager af M. bovis BCG Lux, blev Montreal vaccinestammen omdannet med shuttle plasmid pSMT1 transporterer Luxab gener fra Vibrio harveyi kodning af luciferase enzym19.
- Der inokuleres 15 ml Middlebrook 7h9 bouillon indeholdende 0,2% glycerol, 10% albumin, dextrose, katalase (ADC) berigelse og 50 μg/ml hygromycin med optøet 1,2 ml alikvot BCG Luxi en mærket 250 ml Erlenmeyer kolbe.
- Kolben anbringes i en forseglet beholder til biosikkerhed og inkuberes ved 37 °C i en orbitalshaker-inkubator ved 220 rpm for 72 h (eller indtil kulturen når midten af log vækstfasen).
- Kontrollér væksten af BCG Lux -kulturen ved at tilberede 1:10 fortyndinger af kulturen i luminometerrør ved hjælp af fosfat bufferet saltvand (PBS, pH 7,4, 0,01 m fosfatbuffer, 0,0027 m kaliumchlorid og 0,137 m natriumklorid) i to eksemplarer. Vortex, og læg luminometerrør i luminometeret og mål bioluminescens (relativ lys enhed [RLU]/mL) ved hjælp af n-Decyl aldehyd som substrat (1% v/v i absolut ethanol)20.
Bemærk: Forholdet mellem RLU/kolonidannende enheder (CFU) blev tidligere bestemt til at være 3:1, da BCG Lux blev dyrket in vitro i Middlebrook 7H9 bouillon20. - Der centrifugeres i kulturen ved 2.175 x g i 10 min ved stuetemperatur for at pille cellerne og kassere supernatanten i et passende desinfektionsmiddel med kendt mykobaktericid aktivitet. Alt kultur affald skal bortskaffes med desinfektionsmidler, der er passende for mykobakterier efter lokale retningslinjer.
- Celle pillen vaskes to gange i PBS, der indeholder 0,05% Polysorbat 80 (PBS-T) for at forhindre bakterie sammenklumpning.
- Efter den endelige vask, dekanteres affald supernatant, resuspension af mycobakterielle celle pellet i PBS-T og fortynde den mykobakterielle suspension til den ønskede celletæthed ved hjælp af RLU målinger.
- Der fremstilles 10-dobbelte serielle fortyndinger af inokulum i 24-brønd plader med PBS-T. Der fremføres 10 μl på Middlebrook 7h11 agar-plader (0,5% glycerol, 50 μg/ml hygromycin, 10% oliesyre, albumin, dextrose, katalase [oadc]) i to eksemplarer til optælling af inokulum-CFU-tællinger.
2. klargøring af G. mellonella larver
- Køb sidste INSTAR larver fra passende kilder og Oprethold larverne i mørke ved 18 °C ved ankomsten og brug inden for 1 uge efter købet. Alternativt kan larverne selv opdrættes efter protokol af Jojāo et al.21. For købte larver kasseres eventuelle døde, misfarvede eller dukke larver før opbevaring.
Bemærk: De, der dukker op, er morfologisk adskilte med de sidste INSTAR larver. - Identificer og vælg sunde larver til eksperimenter, baseret på ensartet creme farve med lidt at ingen misfarvning (melanisering), størrelse (2 − 3 cm i længden), vægt (ca. 250 mg), viser en høj grad af motilitet, og besidder evnen til at højre sig selv, når de vendes.
- Tæl omhyggeligt de raske larver (mindst 20 − 30 pr. gruppe) i en Petri skål (94/15 mm) foret med et lag filtrerpapir (94/15 mm) ved hjælp af stumpe-end-pincet for at minimere kontaminering og opbevares ved stuetemperatur i mørke indtil brug.
3. inficering af G. mellonella med BCG Lux
- Minimer rodet inden for MSC for at reducere risikoen for kontaminering og nålestikskade.
- Forbered injektions platformen ved at tape et cirkulært filtrerpapir (94 mm) til en flad, hævet overflade. Bløde eller hårde overflader kan bruges og er helt afhængig af brugerpræferencer, fx pipette dæksler eller en nylon skuresvamp.
- Steriliser en 25 μL mikrosprøjte (25 G) ved at aspirere 3 volumener med 70% ethanol og yderligere skylle med 3 volumener af steril PBS-T.
- Der aspireres 10 μL BCG Lux inokulum (fremstillet i punkt 1) eller PBS-T i den steriliserede 25 μl mikrosprøjte. Brug en separat sprøjte til PBS-T negativ kontrol.
Bemærk: BCG Lux inokulum resuspenderes efter 10 injektioner for at sikre ensartet cellesuspension. - Brug pincet til at afhente en larve og placere på injektions platformen.
- På platformen, flip larve på ryggen og immobilisere ved at sikre hoved og hale med pincet. Find det sidste venstre proben, der tæller ned fra spidsen af Larven, og Indsæt forsigtigt spidsen af nålen (5 − 6 mm) ved en vinkel på 10 − 20 ° til det vandrette plan.
Bemærk: Korte og smalle pincetter giver mulighed for nem immobilisering med minimal larve stress. Vær opmærksom på ikke at trænge igennem, som kan punktere tarmen og forårsage ikke-BCG Lux specifik melanization eller død. - Tæl de inficerede larver i en petriskål foret med et lag filtrerpapir, en enkelt 90 mm Petri skål kan rumme op til 30 larver.
- Den Petri skål, der indeholder larverne, opbevares i en udluget eller ikke-forseglet mørk kasse i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
4. overvågning af G. mellonellas overlevelse efter infektion
- Over tid kurset, overvåge overlevelsen af larverne hver 24 h. larverne betragtes som døde, når de ikke bevæger sig som reaktion på berøring.
5. måling af BCG Lux ' in vivo-byrde i G. mellonella
- På hvert tidspunkt, tilfældigt vælge fem inficerede larver tidligere fremstillet i punkt 3 og forsigtigt sterilisere larve overflader ved hjælp af bomuld knop svaber dyppet i 70% ethanol.
Bemærk: Dette trin er vigtigt, når plating larve homogenatet for mykobakterielle CFU-optælling som ikke-steriliseret larver kan føre til kontaminering. - Larverne anbringes enkeltvis i 2 mL lyserende matrix rør, der indeholder 800 μL steril PBS.
- Larverne homogeniseres ved hjælp af en homogenisator til 60 s ved 6,0 m/s.
- De lyserende rør centrifugeres ved 3.500 x g i 5 s, så homogenatet fjernes fra lågene, og homogeniseres forsigtigt i sterile luminometerrør enkeltvis.
Bemærk: For CFU-optælling (trin 5,7) skal du sørge for at reservere 100 μL homogenat i et sterilt 1,5 mL reagensglas. - Den resterende homogeni skal genbehandles ved at skylle de lyserende matrix rør med 1 mL PBS-T og pipettere i de tilsvarende luminometerrør.
- Vortex luminometerrør og måle bioluminescens af de homogenater, der tidligere er beskrevet i trin 1,4.
- Der fremstilles ti gange serielle fortyndinger af homogenatet i 24-brønd kultur plader ved hjælp af PBS-T. Der frembringes 10 μL af fortyndingen på Middlebrook 7H11 agar-plader indeholdende 0,5% glycerol, 50 μg/mL hygromycin, 10% OADC og 20 μg/mL piperacillin til bestemmelse af RLU/CFU-forholdet af BCG Lux efter in vivo-infektion.
Bemærk: Piperacillin eliminerer Native G. mellonella mikrobiota med minimal væksthæmning af BCG Lux16.
6. statistisk analyse
- Plot Kaplan-Meier overlevelses kurven ved hjælp af indsamlede data og gennemføre Mantel-Cox (log-Rank) test for at bestemme signifikansen af resultatet, hvor * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, og * * * * p < 0,0001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi repræsentative data, der kan opnås ved hjælp af g. mellonella -BCG Lux infektion model og fremhæve fordelene ved g. mellonella som en infektion model for medlemmer af mtbc (figur 1). Eksperimentelle procedurer med vigtige tekniske punkter er skitseret i figur 2.
Figur 1: fordelene ved G. mellonella som en infektions model. Dette tal er blevet tilpasset fra Kavanagh og Sheehan22. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skitse af eksperimentelle procedurer. A) vedligeholdelse og klargøring af G. mellonella ved infektion med M. bovis BCG Lux. B) tilberedning af BCG Lux -kultur og inokulum til infektion. C) infektion af G. mellonella med BCG Lux. D) måling af virulens og in vivo-byrden af BCG Lux i G. mellonella larver. Klik her for at se en større version af dette tal.
BCG Lux dosisafhængig virulens blev observeret i G. mellonella larver over en 96 h inkubationsperiode (figur 3), og den dødelige dosis for 50% larve dødelighed (LD50) blev fastlagt til at være 1 x 107 CFU. Overlevelses fordelingen, der afspejler virulens af de testede BCG Lux -doser, var signifikant anderledes (p < 0,0001). Kontrolgrupper injiceret med en dosis på 10 μL PBS-T eller dem, der blot var prikket med simulerede nåleskader, påvirkede ikke larve sundheden eller førte til en stigning i dødeligheden som bestemt ved observations kontrol af motilitet og melanisering på forskellige tidspunkter.
Figur 3: Kaplan-Meir overlevelse kurve af G. mellonella som reaktion på varierende podestoffer af M. bovis BCG Lux. Raske larver (n ≥ 10 pr. gruppe), blev inficeret med varierende doser af BCG Lux. Larverne blev inkueret ved 37 °C og overvåget for overlevelse hver 24 timer i op til 96 timer. Den ikke-inficerede gruppe blev injiceret med PBS, og en prikket gruppe (indsættelse af nål kun) viste effekten af nåle skade på larve sundhed. Midlerne til to uafhængige eksperimenter er vist, med 95% konfidensinterval, repræsenteret som punkterede linjer i tilsvarende farve til inokulum. Dette tal er blevet tilpasset fra Li et al.16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Alle larver, der er inficeret med BCG Lux , udviste fysiologiske forandringer over tid, og for larver inficeret med en 2 x 107 CFU-dosis af BCG Luxblev der observeret melanisering af larve ryglinjen fra 48 h efter infektion (PI) og systematisk der blev observeret melanisering fra 96 t (figur 4). Desuden blev larvernes motilitet reduceret med sværhedsgraden af melanisering, og larvernes evne til at dukke dukker blev tabt ved infektion sammenlignet med ikke-inficerede kontroller.
Figur 4: Melanisering af G. mellonella som reaktion på infektion med M. bovis BCG Lux. Raske larver ved 0 timer blev inficeret med en 2 x 107 CFU-dosis af BCG Lux. Ved 48 h og 96 h pi blev der observeret melanisering langs larve ryglinjen og systematisk melanisering.
BCG Lux ' overlevelse inden for G. mellonella larverne blev fastlagt i løbet af 2 uger gennem bioluminescens måling af larve homogenater. Infektion med en dosis BCG Lux på 1 x 107 CFU resulterede i et Initial fald i BCG Lux bioluminescens fra 0 − 72 timer pi. Men fra 72 − 144 timer pi var bioluminescens af BCG Lux plateaued, hvilket indikerer, at der er etableret vedvarende infektion (figur 5).
Figur 5: in vivo-byrden af M. bovis BCG Lux i G. mellonella kvantificeret ved hjælp af bioluminescens (relativ lysenhed, RLU/ml) over et to ugers tidsforløb. Raske larver (n = 30) blev inficeret med 1 x 107 CFU-dosis af BCG Lux. In vivo-byrden blev kvantificeret ved homogenisering af fem larver på hvert tidspunkt (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h) og måling af homogenidens bioluminescens. Midlerne til tre uafhængige eksperimenter vises, og fejllinjerne repræsenterer middelværdien som standardafvigelse. Dette tal er blevet genoptrykt fra Li et al.16. Klik her for at se en større version af dette tal.
Da den hurtige og reproducerbare kvantificering af in vivo-mykobakteriel vækst i disse undersøgelser blev bestemt ved måling af bioluminescens, bør forholdet mellem RLU og CFU også bestemmes in vivo. I vores særlige infektions system varierede in vivo-forholdet mellem RLU og CFU fra 2:1-5:1, med et gennemsnit på 4:1 over 168-h-tidsforløbet (figur 6).
Figur 6: bestemmelse af in vivo-forholdet mellem RLU og CFU af M. bovis BCG Lux i G. mellonella. Raske larver (n = 30) blev inficeret med 1 x 107 CFU-dosis af BCG Lux. På hvert tidspunkt (0, 24, 96 og 168 h) blev fire inficerede/Control (PBS-T) larver homogeniseret, og homogenaterne blev målt for bioluminescens og belagt med 7h11 agar til optælle CFU-tællinger. Metoderne til to uafhængige eksperimenter vises, og fejllinjerne repræsenterer middelværdien som standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af G. mellonella som en infektions model er blevet fastlagt for en række bakterielle og svampe patogener til studiet af virulens, Host-pathogen interaktion, og som en skærm for ny terapeutisk medicin10,22. Følgende diskussion er baseret på den eksperimentelle procedure for anvendelse af G. mellonella som en infektion model for mtbc.
Sundhedstilstanden hos de naive larver før eksperimenteren kan have en betydelig indvirkning på resultatet af forsøget. Derfor er det vigtigt, at alle misfarvede og/eller skadede larver fjernes ved ankomsten og ikke anvendes til forsøg. Hvis et stort antal larver er fundet døde i samme beholder ved ankomsten, er det tilrådeligt at kassere partiet som præ-eksisterende infektioner kan være årsag til døden. Når det er muligt udføre eksperimenter ved hjælp af larverne så tæt på dagen for køb/ankomst. Før brug skal larverne opbevares ved 18 °c for at forhindre forpupningen og for at maksimere antallet af larver til forsøg. Sunde larver kan bruges i op til 7 dage efterleve ring/køb. Efter infektion skal det sikres, at døde larver fjernes fra Petri skålen, da tilstedeværelsen af døde larver af ukendte årsager synes at øge dødeligheden i prøve populationen. For brugere af selv opdrættede larver er det vigtigt at være opmærksom på biologisk variation i forhold til købte larver, da variansen i kost og vækstbetingelser kan have indflydelse på larve immunitet21,23. Intereksperimenterende variabilitet kan begrænses ved at holde kilden, hvis den købes, eller foder-og vækstbetingelserne for de opdrættede larver sammenhængende mellem eksperimenter. I alle forsøg er det vigtigt at medtage "blind" og "prikket" negativ kontrol. den tomme kontrol er en indikator for kontaminering eller toksicitet af suspensions matrixen (PBS-T eller medie bouillon), og den prikkede kontrol efterligner virkningen af nåle skaden på larve sundhed. Desuden normaliserer disse kontroller enhver biologisk variation mellem batcher af larver, hvilket sikrer reproducerbarhed og nøjagtighed mellem forsøgene.
Til injektion af G. mellonella larver anbefales det at anvende en 25 G nål, da større nåle kan forårsage overdreven blødning og skarpere mindre måle nåle kan let punktere larvernes tarm, hvilket fører til larve dødelighed og falsk positiv Resultater. Konventionelle metoder til nåle injektion typisk imimmobilize larverne i hånden, hvilket øger risikoen for nåle skade. Ved at bruge pincet til at imimmobiliere larverne, risikoen for nålestikskade reduceres betydeligt, da hånden ikke er i umiddelbar nærhed af nålen på noget tidspunkt under infektion. Alternativt kan larverne blive immobiliseret ved afkøling. Men, kold chok ved 12 °C i 15 minutter før infektion er blevet dokumenteret for at øge den medfødte immunrespons på infektion. Derfor bør analysen af de resultater, der opnås via køling, nøje overveje dens virkning24. Ved hjælp af vores teknik kan medium gennemløb af injektion (2 − 3 larver pr. minut) opnås med bruger praksis; Dette kan sammenlignes med hastigheden af konventionel injektion fra vores erfaring (3 − 4 larver pr. min.). Desuden kan vores metode tilpasses til højere dataoverførselshastighed ved at anvende en pedal drevet injektions platform bestående af en infusionspumpe med en engangssprøjte forbundet til en 25 G sommerfuglkanyle.
Forberedelsen af BCG Lux inokulum er baseret på den hurtige vurdering af CFU ved hjælp af RLU af mykobakteriel kultur20. I vores erfaring med bouillon kultur, forholdet mellem RLU til CFU er 3:120, kontrasterende med BCG Lux dyrkning i G. mellonella hvor rlu til CFU ratio er 5:120. Mykobakterielle celle aggregering eller "klumpning", der almindeligvis ses i tætte kulturer, kan have indflydelse på RLU-målingerne, da sammenklumpning kan resultere i upålidelige bioluminescens målinger. Som sådan anbefales brugen af klumpet mykobakterielle kultur til inokulum præparat ikke. Tilsætning af Polysorbat 80 til vækstmediet minimerer imidlertid celle sammenklumpning uden at ændre BCG Lux' vækst. 16 enhver mindre celle sammenklumpning kan løses ved at vaske kulturen med PBS-T og er afgørende for at forberede en nøjagtig inokulum ved hjælp af RLU som udlæser. Desuden er PBS-T vask afgørende for at fjerne enhver ekstracellulær virulens faktor udskilles under vækst. Mykobakteriel stamme og passage nummer bør også tages i betragtning, da dette kan påvirke sværhedsgraden af mykobakterielle sammenlægning25. I alle tilfælde skal inokulum optælles af CFU på 7H11 agar-plader for at sikre, at den korrekte CFU er fremstillet ved bioluminescens måling. Desuden bør RLU/CFU-forholdet in vivo bestemmes med nye bioluminescent-reporter eller-aktier, da forholdet sandsynligvis vil variere.
G. mellonella har flere fordele i forhold til konventionelle modeller af TB-smitte, herunder billigere anskaffelses-og vedligeholdelsesomkostninger, let infektions-og forskningskapacitet, især i kombination med bioluminescent-stammer16. Manglen på etiske begrænsninger giver mulighed for større stikprøvestørrelse (mindst 20 − 30 larver pr. gruppe) i forhold til pattedyrs modeller, hvilket giver større tillid og pålidelighed i de opnåede resultater26,27. Men, der er en række begrænsninger i brugen af G. mellonella som en infektion model. Som en hvirvelløse, de naturligt mangler adaptiv immunitet gør dem uegnede til antigenicitet eller immunologiske undersøgelser10. Cellulære medfødte immunrespons af G. mellonella består af en række hemocyte typer, og plasmatocytter og granulocytter er blevet rapporteret til at fungere på samme måde som pattedyrs fagocytter (neutrofiler og makrofager)12. Disse celle typers rolle og mekanismer er imidlertid stadig under karakteriseret, og der er endnu ikke foretaget direkte sammenlignende undersøgelser mellem pattedyrs-og insekt-fagocytter. Desuden hindrer manglen på et kommenteret G. mellonella genom analysen af værts reaktionen på infektionen, og dette er i øjeblikket afhængig af genontologi analyse mod transkriptomic biblioteker af andre invertebrater, såsom Drosophila melanogaster og Bombyx Mori28.
Som en TB-infektion model, G. mellonella har en lovende fremtid med sin evne til at udvikle granuloma-lignende strukturer som reaktion på BCG Lux infektion16, som er vitale patofysiologiske kendetegn for TB-infektion og er en nøgle funktion i udviklingen af LTBI. Det fremtidige arbejde vil have til formål at karakterisere denne model med en særlig interesse i dannelsen af granuloma-lignende strukturer ved hjælp af reference, kliniske og mutante MTB isolater under CL3 betingelser. Derudover forventer vi, at det også kan være nyttigt for nye anti-mycobakterielle agent screening, som en lignende G. mellonella model blev brugt til NTMS18, men dette er endnu ikke fastlagt. Vedtagelsen af denne model har evnen til at reducere antallet af dyr, der anvendes inden for TB-forskningsmiljøet, og samtidig fremskynde in vivo TB-forskningsresultater under etisk mere acceptable forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af tilskud fra Forskningsrådet for bioteknologi og biologisk videnskab (BBSRC), der blev tildelt PRL og YL (BB/P001262/1), og det nationale center for erstatning, forbedring og reduktion af dyr i forskning (NC3Rs), der blev tildelt PRL, SMN, BDR og YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
