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Immunology and Infection

結核複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物ガレリアメロネラの使用

doi: 10.3791/59703 Published: June 30, 2019
* These authors contributed equally

Summary

ガレリアメロネラは最近、結核複合体の再現性、安価、倫理的に許容可能な感染モデルとして設立されました。ここでは、生物発光マイコバクテリウム・ボビスBCGルクスを用いたG.メロネラの正常な感染を確立するためのステップを説明し、実証する。

Abstract

結核は感染症死亡率の主要な世界的原因であり、世界の人口のおよそ4分の1が結核菌に感染していると考えられています。何十年もの研究にもかかわらず、病原性生物としての結核の成功の背後にあるメカニズムの多くは調査されるべきであり、より安全で効果的な抗マイコバクテリア薬の開発は、その上昇に取り組むために緊急に必要とされ、薬剤耐性結核の広がり。しかし、結核研究の進行は、高価で時間がかかり、倫理的に困難な伝統的な哺乳類感染モデルによってボトルネックとなっています。以前は、M.結核複合体のメンバーのための新規、再現性、低コスト、高スループットおよび倫理的に許容可能な感染モデルとして、昆虫ガレリアメロネラ(より大きなワックス蛾)の幼虫を確立しました。ここでは、生物発光マイコバクテリウム・ボビスBCGルクスを用いたG.メロネラの維持、調製、および感染について説明する。この感染モデルを用いて、マイコバクテリア用量依存性が観察され、生物発光測定を用いた生体内マイコバクテリア負荷の迅速な読み出しが容易に達成でき、再現可能である。トランスクリプトーミクス分析用に完全にアノテ付きゲノムが欠如するなどの限界は存在するが、遺伝的に類似した昆虫に対するオンロジカルな分析を行うことができる。結核の低コスト、迅速かつ倫理的に許容可能なモデルとして、G.メロネラは、薬剤の有効性と毒性を決定し、従来の哺乳動物の使用前に比較マイコバクテリアウイルス性を決定するために、事前スクリーンとして使用することができますモデル。G.メロネラ-マイコバクテリアモデルの使用は、現在結核研究で使用されている動物の実質的な数の減少につながります。

Introduction

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結核(結核)は、年間900万人の新しい症例と150万人の死亡者1人と世界の公衆衛生に対する主要な脅威です。さらに、世界人口の4分の1が、結核菌(Mtb)の原因原因剤に感染していると推定されている。感染した集団の中で、5−10%が生涯にわたって活動性結核疾患を発症する。さらに、多剤耐性(MDR)および広範囲薬剤(XDR)耐性Mtbの出現と広がりは、疾病管理に深刻な脅威をもたらし、123カ国が少なくとも1つのXDR症例1を報告している。結核の治療は、少なくとも4つの抗マイコバクテリア薬のカクテルを必要とします, イゾニアジドとリファンピシンは、6ヶ月の最小期間のために処方されています;治療は、多くの場合、複雑な副作用や毒性に関連付けられています。結核に対する唯一のライセンスワクチンからの保護,マイコバクテリウムボビスバチルスカルメット-ゲリン (BCG),可変 2.結核の病因の不完全な理解は、新しい治療およびワクチン接種戦略の開発を著しく妨げる。

何十年もの間、動物感染モデルは、結核研究が感染に対する基本的な病因と宿主応答を理解し、新規の抗マイコバクテリア剤、免疫療法および新しいワクチン候補評価するために不可欠であった3、 4.しかし、結核感染の病因と進行が複雑であり、疾患の全スペクトルと重要な特徴を模倣する単一の動物モデルがないため、結核の動物感染モデルを用いた研究は難しいことで知られています5 、6.さらに、動物実験は高価であり、引き受けるには時間がかかり、完全な倫理的正当化が必要です。それにもかかわらず、結核の動物感染モデルは、非ヒト霊長類(例えば、マカク)、モルモット、ウサギ、ウタ、ブタ、マウスおよびゼブラフィッシュに記載されており、それぞれにその制限3、4を有する。マウスモデルは、コスト、交配ラインの利用可能性、感染の再現性および免疫学的試薬の豊富さのために最も一般的に使用されるモデルである。しかし、それらは通常、潜在結核感染(LTBI)6の特徴である低酸素症の領域に関連する肉芽腫を形成しない。モルモットはMtb感染の影響を非常に受けやすく、病理や初期肉芽腫の形成はヒトと同様であり、ワクチン検査で広く使用されています。しかし、免疫学的試薬の欠如は、感染モデル7としての使用を妨げる。ゼブラフィッシュは、小型、迅速な繁殖、高度な遺伝的ツールによる初期前臨床試験における大規模なスクリーニングに適していますが、解剖学的および生理学的に人間とは異なり、ヒトの影響を受けやすくなっています。マイコバクテリウム・マリナム感染症3.ヒトMtb感染に最も近い動物モデルは、非ヒト霊長類(例えば、マカク)であるが、それらは高価であり、その使用をかなり制限する重要な倫理的および実用的な考慮事項を有する8。

より大きなワックス蛾またはハニカム蛾の昆虫幼虫、ガレリアメロネラは、細菌および真菌病原体9の様々な感染モデルとしてますます人気が高まっており、新しい抗菌薬候補のスクリーンとして10. G. メロネラは、脊椎動物のそれと高い程度の構造的および機能的類似性を共有する高度な自然免疫系(細胞および体液防御からなる)による成功した無脊椎動物モデルです11.これには、ヘモサイトによる病原体の食細胞症(哺乳類のマクロファージおよび好中球に機能的に類似)12、13、抗微生物ペプチド(AMP)の産生および循環などの免疫機構が含まれる。G.メロネラ11のヘモリンパ内の補体様タンパク質(哺乳類の血液に類似)。モデルとしてのG.メロネラ幼虫の他の利点9、14、15は、簡単な操作と感染を可能にするその大きなサイズ(20−30ミリメートル)だけでなく、組織のコレクションを含みます分析のためのヘモリンパ、2)37°Cでの容易な維持、ヒト病原体の研究に適した、3)麻酔を必要としない注射による精密な感染、4)抗菌剤の有効性は、評価のためのより少ない薬剤を利用して評価することができ、5)の欠如哺乳類の使用に比べて倫理的な制約は、6)大きなグループサイズは、より大きな再現性を可能にする動物モデルと比較して使用することができ、7)感染実験のためのより短い時間が必要とされる。

最近の研究では、G.メロネラは、生物発光M.ビスBCGルクス、ワクチン株およびメンバーの遺伝子改変バージョンによる感染の病因を研究するための新しい感染モデルとして使用できることを実証しました。Mtb複合体 (MTBC)16の .G.メロネラは、以前は非結核マイコバクテリア(NTM)の感染モデルとして使用されてきましたが、主にM.マリナムおよびマイコバクテリウム膿瘍17、18を用いた研究は、MTBCを用いた研究に限定されています。Li et al.16の.Mtbの代理として封じ込めレベル(CL)2で使用できるバイオルミネッセンス非病原性マイコバクテリア株は、病原性マイコバクテリアに対する安全性と実用性の利点を提供します。BCGルクスに感染した後、幼虫は早期肉芽腫様構造を開発し始め、結核感染16の確立における自然免疫の役割に関する貴重な洞察を提供することができる。さらに、この単純な無脊椎動物感染モデルは、再現性のために制御された課題と複数の反復を組み込んだ結核病因の迅速かつ低コストかつ信頼性の高い評価を提供する可能性を有する。さらに、このモデルは、早期開発における新規な抗結核薬およびワクチン候補のスクリーニングに使用される可能性を有し、実験における動物の総数を減少させる。宿主および病原体構造の変化を測定する能力、転写物およびプロテオームは、薬物標的を決定し、新規薬物および治療ワクチンの作用機序を評価することも有利である。

ここでは、マイコバクテリア感染に対する生物発光M.ボビスBCGルクス接種およびG.メロネラ幼虫の調製のための実験プロトコルと、幼虫とマイコバクテリアの両方の決定について説明します。感染に応じて生存する。

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Protocol

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注:以下に説明するすべての作業は、地域の健康と安全に関するガイドラインに従って、クラス2の微生物学的安全キャビネット(MSC)内のCL2実験室で行われる予定です。

1. 感染に対するM.ボビスBCGルクスの調製

  1. 冷凍1.2 mLグリセロールを解凍する (15%)M.ボビスBCGルクスのストックは、ルシフェラーゼ酵素19をコードするビブリオハーヴェイからルクスAB遺伝子を運ぶシャトルプラスミドpSMT1で形質転換されたモントリオールワクチン株。
  2. 0.2%グリセロールを含むミドルブルック7H9ブロスの15 mLを接種し、10%アルブミン、デキストロース、カタラーゼ(ADC)濃縮および50 μg/mLハイグロマイシンをBCGルクスの解凍1.2 mLアリコートで、ラベル付き250 mLエルレンパスクで表示される。
  3. 密封されたバイオセーフティ容器にフラスコを入れ、72時間(または培養が成長の中間ログ段階に達するまで)220 rpmで軌道シェーカーインキュベーターで37°Cでインキュベートします。
  4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4、0.01 Mリン酸バッファー、0.0027 M塩化カリウムおよび0.137M塩化ナトリウム)を用いてルミノメーターチューブ内の培養物の1:10希釈を複製してBCGルクス培養の成長を確認します。渦は、ルミノメーターチューブをルミノメーターにロードし、n-デシルアルデヒドを基質として用いて生物発光(相対光単位[RLU]/mL)を測定する(絶対エタノール中の1%v/v)20。
    注:RLU/コロニー形成ユニット(CFU)の比率は、BCGルクスがミドルブルック7H9ブロス20でインビトロで成長した場合、以前は3:1と判定されていた。
  5. 室温で2,175 x gで培養を10分間遠心分離し、細胞をペレットし、既知の菌性活性化活性を有する適切な消毒剤に上清を廃棄する。すべての培養廃棄物は、現地のガイドラインに従ってマイコバクテリアに適した消毒剤で廃棄してください。
  6. 0.05%ポリソルベート80(PBS-T)を含むPBSで細胞ペレットを2回洗浄し、細菌の凝集を防ぎます。
  7. 最終的な洗浄に続いて、デカント廃棄物上清を、PBS-T中のマイコバクテリア細胞ペレットを再懸濁し、RLU測定を用いて所望の細胞密度にマイコバクテリア懸濁液を希釈する。
  8. PBS-Tを用いて24ウェルプレートに接種の10倍のシリアル希釈を準備する。ミドルブルック7H11寒天プレートに10μLをプレートアウト(0.5%グリセロール、50μg/mLヒグロマイシン、10%オレイン酸、アルブミン、デキストロース、カタレーゼ[OADC])を複製してイヌキュラムCFUカウントを列挙する。

2. G.メロネラ幼虫の準備

  1. 適切なソースから最後の星幼虫を購入し、到着時に18 °Cで暗闇の中で幼虫を維持し、購入の1週間以内に使用します。あるいは、幼虫は、Jojáoら21のプロトコルに従って自己飼育することができる。購入した幼虫の場合は、保存前に死んだ幼虫、変色した幼虫、または子犬を捨ててください。
    注:子犬の幼虫は、最後の幼虫と形態的に区別できる。
  2. 変色(メラニゼーション)がほとんどない均一なクリーム色、サイズ(長さ2−3cm)、体重(約250mg)、高い運動性を示し、右にする能力を持つ、実験のための健康な幼虫を識別し、選択します。ひっくり返ったとき、自分自身。
  3. 健康な幼虫(1群につき最低20~30)を、ブラントエンドピンセットを使用したフィルターペーパー(94/15mm)の層が並ぶペトリ皿(94/15mm)に注意深く数え、使用するまで暗闇の中で室温で保管してください。

3. BCGルクスでG.メロネラに感染

  1. MSC内の乱雑さを最小限に抑え、汚染や針スティックの損傷のリスクを軽減します。
  2. 円形のフィルターペーパー(94 mm)を平らな上げ面にテーピングして、射出プラットフォームを準備します。柔らかいまたは堅い表面は使用することができ、例えば、ピペット箱のふたかナイロンの磨くスポンジのユーザーの好みに完全に依存する。
  3. 70%エタノールの3巻を吸引することにより25μLマイクロシリンジ(25G)を殺菌し、さらに3巻の無菌PBS-Tですすいで下す。
  4. BCGルクス接種(セクション1で調製)またはPBS-Tの10 μLを殺菌された25 μLマイクロシリンジに吸引する。PBS-T陰性制御には別のシリンジを使用してください。
    注:10の注射に続いてBCGルクス接種を再中断し、均一な細胞懸濁液を確保する。
  5. ピンセットを使用して幼虫を1匹拾い、注射プラットフォームに置きます。
  6. プラットフォームで、幼虫を背中にひっくり返し、ピンセットで頭と尾を固定します。幼虫の頭部からカウントダウンする最後の左のプロレッグを見つけ、針の先端(5−6 mm)を10−20°の角度で水平面に慎重に挿入します。
    注:短く、狭いピンセットは最低の幼虫のストレスの容易な固定化を可能にする。腸を穿刺し、非BCGラックス特異的な憂鬱または死を引き起こす可能性があり、浸透しないように注意してください。
  7. 感染した幼虫をフィルターペーパーの層が並ぶペトリ皿に数え、単一の90ミリメートルペトリ皿は、最大30の幼虫を収容することができます。
  8. 幼虫を含むペトリ皿を、5%CO2で37°Cのインキュベーター内の通気または非密封の暗い箱に保管します。

4. G.メロネラ感染後の生存のモニタリング

  1. 時間の経過とともに、幼虫の生存を24時間ごとに監視し、幼虫は接触に反応して動かすことができないと死んだと考えられる。

5. G.メロネラにおけるBCGルクスのインビボ負担の測定

  1. 各時点で、セクション3で以前に調製した5匹の感染幼虫をランダムに選択し、70%エタノールに浸した綿棒を用いて幼虫表面を静かに殺菌する。
    注:このステップは、非殺菌幼虫が汚染につながる可能性があるとして、マイコバクテリアCFU列挙物の幼虫をめっきする際に重要である。
  2. 幼虫を800μLの無菌PBSを含む2 mLのライシングマトリックスチューブに個別に入れます。
  3. 6.0 m/sで60sのホモジナイザーを使用して幼虫を均質化します。
  4. 3,500 x gの5sでライシングチューブを遠心分離し、蓋から均質化を除去し、ホモジネートを個別に無菌の照明器チューブに慎重にデカントします。
    注:CFU列挙(ステップ5.7)の場合は、無菌の1.5 mL反応管に100μLの均質性を確保してください。
  5. PBS-Tとピペットの1 mLでライシングマトリックスチューブを対応するルミノメーターチューブに洗浄することにより、残りの均質性を回復します。
  6. ルミノメーターチューブを渦にし、ステップ1.4で前述したホモゲネートの生物発光を測定する。
  7. PBS-Tを用いて24ウェル培養プレートに同質剤の10倍のシリアル希釈を調製する。0.5%グリセロール、50μg/mLヒグロマイシン、10%OADCおよび20 μg/mLピペラシリンを含むミドルブルック7H11寒天プレートに希釈の10 μLをプレートアウトし、ビボ感染後のBCGルクスのRLU/CFU比を決定する。
    注:ピペラシリンは、BCGクス16の最小限の増殖阻害で天然G.メロネラ微生物叢を排除する。

6. 統計分析

  1. 収集されたデータを使用してカプラン・マイヤー生存曲線をプロットし、Mantel-Cox(ログランク)検定を実行して結果の有意性を判断し、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、および ****p < 0.0001 を実行します。

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Representative Results

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ここでは、G.メロネラ-BCGルクス感染モデルを用いて得られる代表的なデータを提示し、MTBCのメンバーの感染モデルとしてのG.メロネラの利点を強調する(図1)。重要な技術的なポイントを持つ実験手順を図 2に概説します。

Figure 1
図1:感染モデルとしてのG.メロネラの利点この図は、カバナとシーハン22から適応されています.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:実験手順の概要(A) M.ボビスBCGルクス感染のためのG.メロネラの維持および準備。(B) 感染に対するBCGルクス培養および接種の調製(C) BCGルクスを持つG.メロネラの感染。(D) G.メロネラ幼虫におけるBCGルクスのウイルス性および生体内負担の測定この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

BCGルクス用量依存性は、96時間の潜伏期間(図3)にわたってG.メロネラ幼虫で観察され、50%幼虫死亡率(LD50)に必要な致死量は1 x 107 CFUであると判定された。試験したBCGルクス用量のウイルス性を反映した生存分布は有意に異なっていた(p<0.0001)。PBS-Tの10 μL用量または単に模擬針傷害を刺したコントロール群は、幼虫の健康に影響を与えなかったか、異なる時点での運動性およびメラニゼーションに関する観察チェックによって決定される死亡率の増加に至らなかった。

Figure 3
図3:M.ビスBCGルクスの様々なイノキュラに応答してG.メロネラのカプラン・メイア生存曲線。健康な幼虫(1群当たりn≥10)は、BCGルクスの様々な用量で感染した。幼虫を37°Cでインキュベートし、最大96時間24時間毎に生存を監視した。感染していない群にPBSを注射し、刺された群(針のみの挿入)は幼虫の健康に対する針損傷の影響を示した。2つの独立した実験の手段が示され、95%の信頼区間を用いて、接種に対応する色で点線として表される。この図はLiら16から適応されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

BCGルクスに感染したすべての幼虫は、時間の経過とともに生理的変化を示し、BCGルクスの2 x 107 CFU用量に感染した幼虫については、幼虫背線のメラニゼーションが48時間ポスト感染(pi)から観察され、系統的に観察された96h pi(図4)からメラニゼーションが観察された。さらに、メラニゼーションの重症度と幼虫の運動性は、感染していないコントロールと比較して感染時に失われました。

Figure 4
図4:M.ビスBCGルクスの感染に対するG.メロネラのメラニゼーション。0hで健康な幼虫はBCGルクスの2 x 107 CFU用量に感染した。48時間および96時間のpiでは、幼虫後部線に沿ったメラニゼーションと系統的なメラニゼーションがそれぞれ観察された。

G.メロネラ幼虫中のBCGルクスの生存は、幼虫同質の生物発光測定を通じて2週間にわたって決定された。BCGルクスの1 x 107 CFU用量に感染すると、0−72 h piからBCGルクス生物発光の初期減少をもたらした。しかしながら、72−144h piから、BCGルクスの生物発光が高原化し、持続感染の確立を示す(図5)。

Figure 5
図5:G.メロネラにおけるM.ボビスBCGルクスの生体内負担において、2週間の時間コースにわたって生物発光(相対光単位、RLU/mL)を用いて定量した。健康な幼虫(n=30)はBCGルクスの1 x 107 CFU用量に感染した。生体内の負担は、各時点(0、24、48、72、96、168、336時間)で5つの幼虫を均質化し、同質の生物発光を測定することによって定量した。3つの独立した実験の手段が示され、誤差バーは平均の標準偏差を表します。このフィギュアはLiら16から転載されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

これらの研究における生体内マイコバクテリア増殖の迅速かつ再現性の定量化は、生物発光の測定によって決定されたので、RLUとCFUの比率も生体内で決定されるべきである。我々の特定の感染システムでは、RLUとCFUの生体内比は2:1-5:1の範囲で、168時間の時間コースの平均は4:1でした(図6)。

Figure 6
図6:G.メロネラにおけるM.ボビスBCGルクスの生体内RLU/CFU比決定。健康な幼虫(n=30)はBCGルクスの1 x 107 CFU用量に感染した。各時点(0、24、96および168時間)で、4つの感染/対照(PBS-T)幼虫を均質化し、同種を生物発光のために測定し、CFUカウントを列挙するために7H11寒天にメッキアウトした。2つの独立した実験の手段が示され、誤差バーは平均の標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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感染モデルとしてのG.メロネラの使用は、ウイルス、宿主病原体相互作用の研究のための細菌および真菌病原体の数のために確立され、および新規治療のためのスクリーンとして10,22。以下の議論は、MTBCの感染モデルとしてG.メロネラを使用するための実験的手順に基づいている。

実験前の素朴な幼虫の健康は、実験の結果にかなりの影響を与える可能性があります。したがって、変色した幼虫や傷ついた幼虫は到着時に取り除かれ、実験には使用しないことが重要です。到着時に多数の幼虫が同じ容器内で死んでいるのが見つかった場合は、既存の感染症が死因である可能性があるため、バッチを廃棄することをお勧めします。可能な場合は、購入/到着日に近い幼虫を使用して実験を行う。使用する前に、子犬を防ぎ、実験に利用できる幼虫の数を最大化するために、18 °Cで幼虫を保存することを確認してください。健康な幼虫は、配達/購入後7日間まで使用することができます。感染後、ペトリ皿から死んだ幼虫を確実に取り除くことを確認し、理由はまだ不明であるが、死んだ幼虫の存在は、サンプル集団における死亡率を増加させるように見える。自己飼育幼虫のユーザーにとって、購入した幼虫と比較して生物学的変動を認識することが重要であり、食事および成長条件の差異が幼虫免疫に影響を及ぼす可能性があるとして21,23。実験間の変動は、ソースを購入した場合、または実験間に一貫して飼育幼虫の飼料および成長条件を維持することによって制限することができる。すべての実験において、「空白」と「刺された」負のコントロールを含めることが不可欠です。ブランクコントロールは、懸濁液マトリックス(PBS-Tまたはメディアスープ)の汚染または毒性の指標であり、刺されたコントロールは幼虫の健康に対する針損傷の影響を模倣する。さらに、これらの制御は幼虫のバッチ間の生物学的変動を正規化し、実験間の再現性および正確さを保証する。

G.メロネラ幼虫の注射のために、25G針の使用は、より大きなゲージ針が過度の出血を引き起こし、より鋭い小さなゲージ針が幼虫の腸を容易に穿刺し、幼虫の死亡率と偽陽性につながる可能性があるとして推奨される。結果。針注射の従来の方法は、通常、手で幼虫を固定化し、これは針損傷のリスクを増加させる。ピンセットを使用して幼虫を固定することにより、針スティック損傷のリスクは、感染時の任意の時点で針に近接していないため、大幅に減少します。あるいは、幼虫は冷却によって固定化され得る。しかしながら、感染前15分間12°Cでのコールドショックは、感染に対する自然免疫応答を増強することが文書化されている。したがって、冷却によって得られた結果の分析は、その影響24を慎重に考慮する必要があります。私たちの技術を使用して、注射の中程度のスループット(毎分2-3幼虫)は、ユーザーの練習で達成することができます。これは私達の経験からの慣習的な注入の速度に匹敵する(分あたり3−4幼虫)。さらに、我々の方法は25 G蝶カニューレに接続される使い捨て注射器が付いている注入ポンプから成っているペダル操作された注入のプラットホームを利用することによってより高い効率注入のために合わせることができる。

BCGルクス接種の調製は、マイコバクテリア培養20のRLUを用いたCFUの迅速な推定に基づいている。スープ培養の経験では、RLUとCFUの比率は3:120であり、RLUとCFUの比率が5:120であるG.メロネラで成長するBCGルクスとは対照的である。密な培養物で一般的に見られるマイコバクテリア細胞凝集または「束」は、束が信頼性の低い生物発光測定をもたらす可能性があるため、RLU測定に影響を与える可能性があります。そのため、接種準備のための凝集マイコバクテリア培養の使用は推奨されない。しかしながら、増殖培養培養物にポリソルベート80を添加することで、BCGルクスの増殖を変化させることなく細胞凝集を最小限に抑える。16任意のマイナーな細胞束は、PBS-Tで培養物を洗浄することによって解決することができ、読み出しとしてRLUを使用して正確な接種を準備するために不可欠です。さらに、PBS-T洗浄は、成長中に分泌される細胞外ウイルス因子を除去するために不可欠です。マイコバクテリア株および通過数も考慮されるべきであるが、これはマイコバクテリア凝集の重症度影響を与える可能性がある25.いずれの場合も、生物発光測定によって正しいCFUが調製されたことを確認するために、7H11寒天プレート上のCFUによって接種を列挙する必要があります。さらに、生体内のRLU/CFU比は、比率が異なる可能性が高いため、新しい生物発光レポーターまたは株式で決定する必要があります。

G.メロネラは、安価な取得および維持コスト、感染の容易さおよび研究スループット、特に生物発光株16との組み合わせを含む、結核感染の従来モデルに対していくつかの利点を有する。倫理的制約の欠如は、哺乳類モデルと比較してより大きなサンプルサイズ(1群当たり20−30幼虫の最小)を可能にし、得られた結果に大きな自信と信頼性与える26、27。しかし、感染モデルとしてのG.メロネラの使用には多くの制限がある。無脊椎動物として、彼らは自然に適応免疫を欠いているため、抗原性または免疫学的研究不適当である10.G.メロネラの細胞生来免疫応答は、多くのヘモサイト型から構成され、血漿細胞および顆粒球は哺乳動物食細胞(好中球およびマクロファージ)12と同様に機能することが報告されている。しかし、これらの細胞型の役割とメカニズムは特徴付けられており、哺乳類と昆虫の間の直接的な比較研究はまだ行われていない。さらに、A.メロネラゲノムの欠如は、感染に対する宿主応答の分析を妨げ、これは現在、ショウジョウバエなどの他の無脊椎動物の転写図ライブラリーに対する遺伝子オントロジー分析に依存している。メラノガスターボンビクスモリ28.

結核感染モデルとして、G.メロネラは、結核感染の重要な病態生理学的特徴であり、重要な病態生理学的特徴であるBCGルクス感染16に応答して肉芽腫様構造を開発する能力を有する有望な未来を保持している。LTBIの開発における機能。今後の研究は、CL3条件下での参照、臨床および変異型Mtb単離物を用いた肉芽腫様構造の形成に特に関心を持って、このモデルを特徴付けることを目指す。また、NTM18に同様のG.メロネラモデルが用いられたので、新規抗マイコバクテリア剤スクリーニングにも有用であると予想されるが、これは未定である。このモデルの採用は、TB研究コミュニティ内で使用される動物の数を大幅に減らす能力を有し、同時に倫理的により許容可能な条件下で生体内結核研究出力を加速する。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

このプロジェクトは、PRLとYL(BB/P001262/1)に授与されたバイオテクノロジー・生物科学研究協議会(BBSRC)の助成金と、PRLに授与された国立研究動物の置き換え、精製、還元のための国立センター(NC3R)の助成金によって支援されました。SMN、BDR、および YL (NC/R001596/1)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tube (Eppendorf) Eppendorf 22431021
20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips Any supplier n/a
24 well culture plate Greiner 662160
25 mL pipettes and pipette boy Any supplier n/a
3 compartment Petri dish (94/15 mm) Greiner 637102
Centrifuge Any supplier n/a
Class II saftey cabinet Any supplier n/a
Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) Corning CLS40183
Ethanol (>99.7%) VWR 208221.321
Galleria mellonella (250 per pk) Livefood Direct UK W250
Glycerol Sigma-Aldrich G5150
Homogeniser (FastPrep-24 5G ) MP Biomedicals 116005500
Hygromycin B Corning 30-240CR
Luminometer (Autolumat LB 953) Berthold 34622
Luminometer tubes Corning 352054
Lysing matrix (S, 2.0 mL) MP Biomedicals 116925500
Micro syringe (25 µL, 25 G) SGE 3000
Microcentrifuge Any supplier n/a
Middlebrook 7H11 agar BD Bioscience 283810
Middlebrook 7H9 broth BD Bioscience 271310
Middlebrook ADC enrichment BD Bioscience 212352
Middlebrook OADC enrichment BD Bioscience 212240
Mycobacterium bovis BCG lux Various n/a
n-decyl aldehyde Sigma-Aldrich D7384-100G
Orbital shaking incubator Any supplier n/a
Phosphate buffered saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Polysorbate 80 (Tween-80) Sigma-Aldrich P8074-500ml
Small box Any supplier n/a dark vented or non-sealed box recommended
Tweezer Any supplier n/a Short and narrow tipped/Blunt long tweezers
Winterm (V1.08) Berthold n/a Program LB953.TTB
Petri dish (94/15 mm) Greiner 633181
Filter paper (94 mm) Any supplier n/a Cut to fit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>結核</em>複合体を研究するための感染モデルとしての無脊椎動物<em>ガレリアメロネラ</em>の使用
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Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).More

Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).

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