Summary
A Galleria mellonella foi recentemente estabelecida como um modelo de infecção reprodutível, barato e eticamente aceitável para o complexo Mycobacterium tuberculosis . Aqui nós descrevemos e demonstramos as etapas tomadas para estabelecer a infecção bem sucedida de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG .
Abstract
A tuberculose é a principal causa global de mortalidade por doenças infecciosas e cerca de um quarto da população mundial é acreditado para ser infectado com Mycobacterium tuberculosis. Apesar de décadas de pesquisa, muitos dos mecanismos por trás do sucesso da M. tuberculosis como um organismo patogénico continuam a ser investigados, e o desenvolvimento de drogas antimiccobacterianas mais seguras e eficazes são urgentemente necessários para enfrentar o aumento e disseminação da tuberculose resistente à droga. No entanto, a progressão da investigação da tuberculose é estrangulada por modelos tradicionais de infecção de mamíferos que são dispendiosos, demorados e eticamente desafiadores. Previamente nós estabelecemos as larvas do inseto Galleria mellonella (maior traça de cera) como uma novela, reprodutível, de baixo custo, de alta taxa de transferência e eticamente aceitável modelo de infecção para os membros do complexo M. tuberculosis . Aqui nós descrevemos a manutenção, a preparação, e a infecção de G. mellonella com o Lux bioluminescente do Mycobacterium bovis BCG . Usando este modelo da infecção, a virulência dependente da dose Mycobacterial pode ser observada, e um leitura rápido da carga Mycobacterial in vivo usando medidas do bioluminescência é facilmente alcançável e reprodutível. Embora existam limitações, como a falta de um genoma totalmente anotado para a análise transcriptômica, a análise ontológica contra insetos geneticamente semelhantes pode ser realizada. Como um modelo de baixo custo, rápido e eticamente aceitável para a tuberculose, G. mellonella pode ser usado como uma pré-tela para determinar a eficácia e toxicidade da droga, e para determinar a virulência micobacteriana comparativa antes do uso de mamíferos convencionais Modelos. O uso do modelo de G. mellonella-micobactérias levará a uma redução no número substancial de animais atualmente utilizados na pesquisa em tuberculose.
Introduction
A tuberculose (TB) é uma grande ameaça à saúde pública global com 9 milhões casos novos por ano e 1,5 milhões mortes1. Além disso, estima-se que um quarto da população mundial está infectado com o agente causador da doença, Mycobacterium tuberculosis (MTB). Entre a população infectada, 5 − 10% desenvolverão doença ativa da TB ao longo de sua vida. Além disso, a emergência e a propagação do MTB resistente do multi-droga (MDR) e do extensivamente-droga (XDR) representa uma ameaça séria ao controle da doença, com os 123 países que reportam pelo menos um caso XDR1. O tratamento da TB requer um coquetel de pelo menos quatro medicamentos antimicobacterianos, dos quais isoniazida e rifampicina são prescritos por uma duração mínima de seis meses; o tratamento é associado frequentemente com os efeitos secundários e as toxicidades complexos. A proteção da única vacina licenciada contra a TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), é variável2. Uma compreensão incompleta da patogênese da TB dificulta significativamente o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e de vacinação.
Durante décadas, os modelos de infecção animal têm sido vitais para a pesquisa de TB para compreender a patogênese básica e a resposta do hospedeiro à infecção, e para avaliar novos agentes antimicobacterianos, imuno-terapêutica e novas candidatas à vacina3, 4. no entanto, a pesquisa utilizando modelos de infecção animal da TB é notoriamente difícil, pois a patogênese e a progressão da infecção por TB são complexas, e não há um modelo animal único que imita o espectro completo e as características importantes da doença5 ,6. Além disso, experimentos com animais são caros, demorados a empreender e necessitam de plena justificação ética. No entanto, modelos de infecção animal de TB têm sido descritos em primatas não humanos (por exemplo, macaques), cobaias, coelhos, bovinos, suínos, camundongos e zebrafish, cada um com suas limitações3,4. O modelo murino é o modelo mais comumente utilizado devido ao custo, disponibilidade de linhagens, reprodutibilidade da infecção e abundância de reagentes imunológicos. Entretanto, não formam tipicamente granulomas associados a áreas de hipóxia que são características de infecção latente por tuberculose (LTBI)6. As cobaias são altamente suscetíveis à infecção de MTB , com patologia e formação adiantada do granuloma similar àquelas nos seres humanos, e são amplamente utilizadas no teste da vacina; ainda a falta de reagentes imunológicos dificulta seu uso como modelo de infecção7. Os zebrafish são apropriados para a seleção em grande escala em estudos pré-clínicos do cedo-estágio devido a seu tamanho pequeno, a reprodução rápida e as ferramentas genéticas avançadas, mas são anatomicamente e fisiologicamente diferentes aos seres humanos e são somente suscetíveis a Infecção do marinum do Mycobacterium 3. Os modelos animais mais parecido com a infecção humana MTB são primatas não-humanos (por exemplo, o macaco), mas eles são caros e têm considerações éticas e práticas significativas que limita consideravelmente o seu uso8.
A larva do inseto da traça maior da cera ou da traça do favo de mel, Galleria mellonella, tornou-se cada vez mais popular como um modelo da infecção para uma variedade de micróbios patogénicos bacterianos e fungosos9, e como uma tela para candidatos antimicrobial novos da droga 10. G. mellonella é um modelo de invertebrados de sucesso devido ao seu sofisticado sistema imunológico inato (composto por defesas celulares e humorais) que compartilha um alto grau de semelhança estrutural e funcional com o dos vertebrados11 . Isso inclui mecanismos imunes como a fagocitose de patógenos por hemócitos (funcionalmente semelhantes aos macrófagos de mamíferos e neutrófilos)12,13, a produção e circulação de peptídeos antimicrobianos (AMPS) e proteínas complemento-like dentro da hemolinfa (análoga ao sangue de mamíferos) de G. mellonella11. Outras vantagens9,14,15 de larvas de G. mellonella como um modelo incluem 1) seu tamanho grande (20 − 30 milímetros) que permite a manipulação e a infecção fáceis, assim como a coleção do tecido e hemolinfa para análises, 2) fácil manutenção a 37 ° c, compatível para estudo de patógenos humanos, 3) infecção precisa por injeção sem necessidade de anestesia, 4) a eficácia dos agentes antimicrobianos pode ser avaliada utilizando menos medicamentos para avaliação, 5) falta de restrições éticas em relação ao uso de mamíferos, 6) grandes tamanhos de grupo podem ser usados em comparação com modelos animais permitindo maior reprodutibilidade, e 7) tempos mais curtos para experimentos de infecção são necessários.
Em um estudo recente, Nós demonstramos que G. mellonella pode ser usada como um modelo novo da infecção para estudar a patogénese da infecção pelo Luxbioluminescente de M. bovis BCG, uma versão genetically modificada da tensão da vacina e do membro do complexo MTB (mtbc)16. Enquanto G. mellonella tem sido usada anteriormente como um modelo de infecção para micobactérias não tuberculosas (NTM), principalmente M. marinum e Mycobacterium abscessus17,18, estudos usando mtbc são limitados a de Li et al.16. Cepas micobacterianas não patogênicas bioluminescentes, que podem ser usadas no nível de contenção (CL) 2 como um substituto para MTB, oferecem as vantagens de segurança e praticidade sobre micobactérias patogênicas. Após a infecção pelo BCG Lux, as larvas começam a desenvolver estruturas semelhantes ao Granuloma precoce, o que poderia fornecer uma visão valiosa sobre o papel da imunidade inata no estabelecimento da infecção por TB16. Além disso, este modelo simples de infecção por invertebrados tem o potencial de fornecer uma avaliação rápida, de baixo custo e confiável da patogênese da TB incorporando desafio controlado e múltiplas repetições para reprodutibilidade. Além disso, o modelo tem o potencial para ser usado para a tela de novos candidatos a drogas e vacinas anti-TB no desenvolvimento precoce, reduzindo o número total de animais em experimentação. A capacidade de medir mudanças na estrutura hospedeira e patógeno, transcriptoma e proteoma para determinar alvos de drogas e avaliar mecanismos de ação de novas drogas e vacinas terapêuticas, também são vantajosas.
Aqui nós descrevemos os protocolos experimentais para a preparação de um inocular bioluminescente de M. bovis BCG Lux e de larvas de G. mellonella para a infecção Mycobacterial, assim como a determinação de larval e de Mycobacterial sobrevivência em resposta à infecção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: todo o trabalho descrito abaixo deve ser realizado em um laboratório CL2 dentro de um gabinete de segurança microbiológica classe 2 (MSC) seguindo as diretrizes locais de saúde e segurança.
1. preparação de M. bovis BCG Lux para infeção
- Degelo um 1,2 mL de glicerol congelado (15%) estoque de M. bovis BCG Lux, a cepa vacinal de Montreal transformada com o plasmídeo de transporte PSMT1 carregando os genes luxab de Vibrio harveyi codificando a enzima luciferase19.
- Inocular 15 mL de caldo Middlebrook 7H9 contendo 0,2% de glicerol, 10% de albumina, dextrose, enriquecimento de catalase (ADC) e 50 μg/mL de higromicina com uma alíquota de 1,2 mL descongelada de BCG Lux, em um balão rotulado de 250 ml de Erlenmeyer.
- Coloque o balão em um recipiente de biossegurança selado e incubar a 37 ° c em uma incubadora orbital do abanador em 220 rpm para 72 h (ou até que a cultura alcangue a fase do mid-log do crescimento).
- Verifique o crescimento da cultura do BCG Lux preparando 1:10 diluições da cultura em tubos de luminômetro utilizando soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4, tampão fosfato 0, 1 m, cloreto de potássio de 0, 27 m e cloreto de sódio a 0,137 m) em duplicado. Vórtice, e carregar os tubos de luminômetro no luminômetro e medir a bioluminescência (unidade de luz relativa [RLU]/mL) usando n-DECYL aldeído como o substrato (1% v/v em etanol absoluto)20.
Nota: A proporção de unidades formadoras de RLU/colônia (CFU) foi previamente determinada como sendo 3:1 quando o BCG Lux foi cultivado in vitro em caldo Middlebrook 7H920. - Centrifugue a cultura em 2.175 x g por 10 minutos na temperatura ambiente para pelota as pilhas e descarte o sobrenadante em um desinfetante apropriado com atividade microbactericida conhecida. Descarte todos os resíduos de cultura com desinfetantes apropriados para micobactérias seguindo as diretrizes locais.
- Lave o pellet celular duas vezes em PBS contendo 0, 5% de Polissorbato 80 (PBS-T) para evitar aglutinamento bacteriano.
- Após a lavagem final, o sobrenadante de resíduos decante, ressuscita o pellet de células micobacterianas em PBS-T e dilui a suspensão micobacteriana para a densidade celular desejada usando medidas de RLU.
- Prepare diluições seriadas de dez vezes do insolvente em placas de 24 poços usando PBS-T. Placa para fora 10 μL em placas de agar Middlebrook 7H11 (0,5% glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de ácido oleico, albumina, dextrose, catalase [OADC]) em duplicado para enumerar contagens de CFU de inóculo.
2. preparação de larvas de G. mellonella
- Compre larvas de última instar de fontes apropriadas e mantenha as larvas no escuro a 18 ° c à chegada e use dentro de 1 semana de compra. Alternativamente, as larvas podem ser autorcriadas seguindo o protocolo de Jojāo et al.21. Para larvas compradas, Descarte qualquer larva morta, descolorida ou pupating antes do armazenamento.
Nota: As larvas de pupating são morfològica distinguíveis às últimas larvas do instar. - Identificar e selecionar larvas saudáveis para experimentação, com base na cor creme uniforme, com pouca ou nenhuma descoloração (melanização), tamanho (2 − 3 cm de comprimento), peso (aproximadamente 250 mg), exibindo um alto nível de motilidade, e possuindo a capacidade de direito se quando virou.
- Conte com cuidado as larvas saudáveis (mínimo de 20 − 30 por grupo) em uma placa de Petri (94/15 milímetros) alinhada com uma camada de papel de filtro (94/15 milímetros) usando as pinças Blunt-end para minimizar a contaminação e armazenar na temperatura ambiente no escuro até o uso.
3. infecting G. mellonella com BCG Lux
- Minimize a desordem dentro do MSC para reduzir o risco de contaminação e ferimento da vara da agulha.
- Prepare a plataforma de injeção gravando um papel de filtro circular (94 mm) em uma superfície plana levantada. As superfícies macias ou duras podem ser usadas e são inteiramente dependentes da preferência do usuário, por exemplo, tampas da caixa da pipeta ou uma esponja de limpeza de nylon.
- Esterilizar uma microseringa de 25 μL (25 G) aspirando 3 volumes de 70% de etanol e enxaguar com 3 volumes de PBS-T estéril.
- Aspirar 10 μL de inocular de BCG Lux (preparado na secção 1) ou PBS-T na microseringa esterilizada de 25 μL. Utilize uma seringa separada para o controlo negativo PBS-T.
Nota: Ressuscitem o inocum do BCG Lux após 10 injeções para garantir a suspensão uniforme das células. - Use pinças para pegar uma larva e coloque na plataforma de injeção.
- Na plataforma, vire a larva para as costas e imobilize, fixando a cabeça e a cauda com a pinça. Encontre o último direita esquerdo que conta para baixo da cabeça da larva e insira com cuidado a ponta da agulha (5 − 6 milímetros) em um ângulo 10 − 20 ° ao plano horizontal.
Nota: Os pinças curtos e estreitos permitem a imobilização fácil com esforço larval mínimo. Preste atenção para não penetrar mais que pode perfurar o intestino e causar não-BCG Lux melanização específico ou morte. - Conte as larvas infectadas em uma placa de Petri revestida com uma camada de papel de filtro, um único prato de Petri de 90 mm pode acomodar até 30 larvas.
- Guarde a placa de Petri contendo as larvas em uma caixa escura exalada ou não selada dentro de uma incubadora a 37 ° c com 5% de CO2.
4. monitorando a sobrevivência de G. mellonella depois da infecção
- Durante o curso do tempo, monitore a sobrevivência das larvas cada 24 h. as larvas são consideradas mortas quando não se movem em resposta ao toque.
5. medindo a carga in vivo do BCG Lux em G. mellonella
- Em cada ponto de tempo, selecione aleatoriamente cinco larvas infectadas previamente preparadas na seção 3 e esterilize suavemente as superfícies larvares usando cotonetes de cotonete embebidos em 70% de etanol.
Nota: Esta etapa é importante quando o homogeneizar larval do chapeamento para a enumeração Mycobacterial de CFU como larvas não-sterilized pode conduzir à contaminação. - Coloque as larvas individualmente em 2 mL de tubos de matriz lisando contendo 800 μL de PBS estéril.
- Homogeneizar as larvas usando um homogeneizador para 60 s em 6,0 m/s.
- Centrifugue os tubos lisando em 3.500 x g para 5 s para remover o homogeneizado das tampas, e decantar com cuidado o homogeneate em tubos estéreis do luminómetro individualmente.
Nota: Para enumeração de CFU (etapa 5,7), assegure-se de reservar 100 μL de homogeneate em um tubo de reação estéril de 1,5 mL. - Recupere todo o homogeneate restante lavando os tubos da matriz de Lise com 1 ml de PBS-T e pipeta nos tubos correspondentes do luminómetro.
- Vórtice dos tubos do luminômetro e meça a bioluminescência dos homogeneatos descritos previamente na etapa 1,4.
- Prepare dez vezes diluições seriais do homogeneate em 24 placas da cultura do poço usando PBS-T. Placa para fora 10 μL da diluição para as placas de agar Middlebrook 7H11 contendo 0,5% de glicerol, 50 μg/mL de higromicina, 10% de OADC e 20 μg/mL de piperacilina, para determinar a relação RLU/CFU de BCG Lux após infecção in vivo.
Nota: A piperacilina elimina a microbiota nativa de G. mellonella com inibição mínima de crescimento do BCG Lux16.
6. análise estatística
- Plotar a curva de sobrevida de Kaplan-Meier usando dados coletados e realizar o teste de Mantel-Cox (log-rank) para determinar a significância do resultado, onde * p < 0, 5, * * p < 0, 1, * * * p < 0, 1 e * * * * p < 0, 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aqui apresentamos dados representativos que podem ser obtidos usando o modelo de infecção por g. mellonella — BCG Lux e destacam os benefícios de g. mellonella como um modelo de infecção para os membros do mtbc (Figura 1). Os procedimentos experimentais com pontos técnicos principais estão descritos na Figura 2.
Figura 1: os benefícios do G. mellonella como um modelo de infecção. Este número foi adaptado de Kavanagh e Sheehan22. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: delineamento de procedimentos experimentais. (A) manutenção e preparo de G. mellonella para infecção com M. bovis BCG Lux. (B) preparo da cultura e do inônio do BCG Lux para infecção. (C) infecção por G. mellonella com BCG Lux. (D) mensuração da virulência e da carga in vivo do BCG Lux em larvas de G. mellonella . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A virulência dependente da dose de BCG Lux foi observada em larvas de G. mellonella ao longo de um período de incubação de 96 h (Figura 3), e a dose letal necessária para 50% de mortalidade larval (LD50) foi determinada como sendo 1 x 107 CFU. A distribuição de sobrevida refletindo a virulência das doses de Lux do BCG testadas foi significativamente diferente (p < 0, 1). Os grupos de controle injetados com uma dose de 10 μL de PBS-T ou aqueles simplesmente picado simulando lesões da agulha, não afetaram a saúde larval nem conduzem a um aumento na mortalidade como determinado por verificações observacionais na motilidade e no melanização em pontos diferentes do tempo.
Figura 3: curva de sobrevida de Kaplan-Meir de G. mellonella em resposta a diferentes inóculos de M. bovis BCG Lux. Larvas saudáveis (n ≥ 10 por grupo), foram infectadas com doses variadas de BCG Lux. As larvas foram incubadas a 37 ° c e monitorizadas para sobrevida a cada 24 h para até 96 h. O grupo não infectado foi injetado com PBS, e um grupo picado (inserção da agulha somente) demonstrou o efeito da lesão da agulha na saúde larval. Os meios de dois experimentos independentes são mostrados, com 95% de intervalo de confiança, representados como linhas pontilhadas na cor correspondente ao ininoculado. Este número foi adaptado de Li et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Todas as larvas infectadas com BCG Lux apresentavam alterações fisiológicas ao longo do tempo e, para larvas infectadas com uma dose de 2 x 107 CFU de BCG Lux, a melanização da linha dorsal larval foi observada a partir de 48 h de infecção pós (PI), e sistemática a melanização foi observada de 96 h PI (Figura 4). Além disso, a motilidade das larvas reduziu com a severidade da melanização e a capacidade das larvas para pupate foi perdida em cima da infecção em comparação com controles não contaminados.
Figura 4: melanização de G. mellonella em resposta à infecção por M. bovis BCG Lux. Larvas saudáveis a 0 h foram infectadas com uma dose de 2 x 107 CFU de BCG Lux. Aos 48 h e 96 h PI, observou-se melanização ao longo da linha dorsal larval e melanização sistemática, respectivamente.
A sobrevida do BCG Lux nas larvas de G. mellonella foi determinada ao longo de 2 semanas através da mensuração da bioluminescência de homogeneatos larvares. A infecção com uma dose de 1 x 107 CFU de BCG Lux resultou em um declínio inicial de BCG Lux bioluminescência de 0 − 72 h PI. Entretanto, a partir de 72 − 144 h PI, a bioluminescência do BCG Lux plateada, indicando o estabelecimento de infecção persistente (Figura 5).
Figura 5: carga in vivo de M. bovis BCG Lux em G. mellonella quantificada utilizando bioluminescência (unidade de luz relativa, RLU/ml) durante um curso de duas semanas. Larvas saudáveis (n = 30) foram infectadas com dose de 1 x 107 CFU de BCG Lux. A carga in vivo foi quantificada por homogeneizar cinco larvas em cada ponto temporal (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h) e medindo a bioluminescência do homogeneato. Os meios de três experimentos independentes são mostrados, e as barras de erro representam o desvio padrão da média. Este número foi reimpresso a partir de Li et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Como a quantificação rápida e reprodutível do crescimento Micobacteriano in vivo nesses estudos foi determinada pela mensuração da bioluminescência, a proporção de RLU e CFU também deve ser determinada in vivo. Em nosso sistema de infecção particular, a relação in vivo de RLU e CFU variou de 2:1-5:1, com média de 4:1 no curso de 168-h (Figura 6).
Figura 6: determinação da razão in vivo RLU/CFU de M. bovis BCG Lux em G. mellonella. Larvas saudáveis (n = 30) foram infectadas com dose de 1 x 107 CFU de BCG Lux. Em cada ponto de tempo (0, 24, 96 e 168 h), quatro larvas infectadas/controle (PBS-T) foram homogeneizadas, e os homogeneizados foram medidos para bioluminescência e revestidos em agar 7h 11 para enumerar contagens de CFU. Os meios de dois experimentos independentes são mostrados e as barras de erro representam o desvio padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O uso de G. mellonella como modelo de infecção foi estabelecido para um número de patógenos bacterianos e fúngicos para o estudo da virulência, interação hospedeiro-patógeno e como tela para a nova terapêutica10,22. A discussão a seguir é baseada no procedimento experimental para o uso de G. mellonella como um modelo de infecção para o mtbc.
A saúde das larvas ingênuas antes da experimentação pode ter um impacto considerável no resultado do experimento. Portanto, é vital que quaisquer larvas descoloridas e/ou feridas sejam removidas no momento da chegada e não sejam usadas para qualquer experimentação. Se um grande número de larvas são encontrados mortos dentro do mesmo recipiente no momento da chegada, é aconselhável descartar o lote como infecções pré-existentes pode ser a causa da morte. Quando possível realizar experimentos usando as larvas tão perto do dia da compra/chegada. Antes de usar, assegure-se de armazenar as larvas a 18 ° c para evitar a pupação e maximizar o número de larvas disponíveis para experimentação. Larvas saudáveis podem ser usadas por até 7 dias após a entrega/compra. Após a infecção, certifique-se de remover quaisquer larvas mortas da placa de Petri como, por razões ainda desconhecidas, a presença de larvas mortas parece aumentar a taxa de mortalidade na população da amostra. Para os usuários de larvas autocriadas, é importante estar atento à variabilidade biológica em comparação com as larvas adquiridas, pois a variância na dieta e nas condições de crescimento pode ter impacto na imunidade larval21,23. As variabilidades inter-experimentais podem ser limitadas mantendo a fonte, se comprado, ou as condições da alimentação e de crescimento das larvas criadas consistentes entre a experimentação. Em todos os experimentos, a inclusão de controles negativos ' em branco ' e ' pricked ' é essencial; o controle em branco é um indicador de contaminação ou toxicidade da matriz de suspensão (PBS-T ou caldo de mídia), e o controle picado imita o efeito da lesão da agulha na saúde larval. Além disso, esses controles normalizam qualquer variação biológica entre lotes de larvas, assegurando reprodutibilidade e acurácia entre experimentos.
Para a injeção de larvas de g. mellonella , o uso de uma agulha de 25 g é recomendado como agulhas maiores do calibre pode causar o sangramento excessivo e as agulhas menores mais afiadas do calibre podem facilmente perfurar o intestino das larvas, conduzindo à mortalidade larval e ao falso positivo Resultados. Os métodos convencionais de injeção de agulha tipicamente imobilizam as larvas manualmente, o que aumenta o risco de lesão da agulha. Usando pinças para imobilizar as larvas, o risco de ferimento da vara da agulha é reduzido significativamente porque a mão não está na proximidade próxima à agulha em qualquer ponto durante a infecção. Alternativamente, as larvas podiam ser imobilizadas pelo resfriamento. Entretanto, o choque frio em 12 ° c por 15 minutos antes da infecção foi documentado para realçar a resposta imune inata à infecção. Portanto, a análise dos resultados obtidos por meio de resfriamento deve considerar cuidadosamente seu impacto24. Usando nossa técnica, a taxa de transferência média da injeção (2 − 3 larvas por o minuto) pode ser conseguida com prática do usuário; Isto é comparável à velocidade da injeção convencional de nossa experiência (3 − 4 larvas por o minuto). Além disso, nosso método pode ser adaptado para uma injeção mais elevada da taxa de transferência usando uma plataforma operada pedal da injeção compreendida de uma bomba da infusão com uma seringa descartável conectada a uma cânula da borboleta de 25 G.
A preparação do inuso de BCG Lux é baseada na rápida estimativa da CFU por meio da RLU da cultura micobacteriana20. Em nossa experiência com cultura de caldo, a proporção de RLU para CFU é de 3:120, contrastando com o BCG Lux crescendo em G. mellonella , onde a razão rlu para CFU é de 5:120. A agregação de células micobacterianas ou ' aglutinante ' comumente observada em culturas densas pode ter um impacto nas medições de RLU, pois a aglutinação pode resultar em medições de bioluminescência não confiáveis. Como tal, não se recomenda o uso de cultura micobacteriana aglutinada para preparo de inônio. No entanto, a adição de Polissorbato 80 aos meios de crescimento minimiza a aglutinação celular sem alterar o crescimento do BCG Lux. 16 qualquer aglutinante de células menores pode ser resolvida lavando a cultura com PBS-T e é vital para a preparação de um inuso exato usando RLU como a leitura. Além disso, a lavagem de PBS-T é vital para remover todo o fator extracelular da virulência secretado durante o crescimento. O número de estirpe e de passagem de micobactérias também deve ser tomado em consideração, pois isso pode impactar a severidade da agregação micobacteriana25. Em todos os casos, o inábulo deve ser enumerado por CFU em placas de agar 7h 11 para garantir que o CFU correto foi preparado por meio de medição de bioluminescência. Adicionalmente, a relação RLU/CFU in vivo deve ser determinada com novo repórter ou estoques bioluminescentes, pois a razão provavelmente variará.
G. mellonella detém várias vantagens sobre os modelos convencionais de infecção por TB, incluindo custos de aquisição e manutenção mais baratos, facilidade de infecção e produção de pesquisa, especialmente em combinação com cepas bioluminescentes16. A falta de constrangimentos éticos permite maior tamanho amostral (mínimo de 20 − 30 larvas por grupo) em comparação aos modelos de mamíferos, proporcionando maior confiança e confiabilidade nos resultados obtidos26,27. No entanto, há uma série de limitações no uso de G. mellonella como um modelo de infecção. Como invertebrados, eles naturalmente não têm imunidade adaptativa, tornando-os inadequados para antigenicidade ou estudos imunológicos10. As respostas imunes inatas celulares de G. mellonella são compostas por um número de tipos de hemócitos, e os plasmatócitos e os granulócitos têm sido relatados para funcionarem de forma semelhante aos fagócitos de mamíferos (neutrófilos e macrófagos)12. No entanto, o papel e os mecanismos desses tipos de células permanecem caracterizados, e estudos comparativos diretos entre os fagoócitos de mamíferos e insetos ainda devem ser realizados. Além disso, a falta de um genoma anotado do G. mellonella dificulta a análise da resposta do anfitrião à infecção, e esta é dependente atualmente na análise da ontologia do gene de encontro às bibliotecas transcriptômica de outros invertebrados, tais como a Drosophila melanogaster e Bombyx mori28.
Como modelo de infecção por TB, G. mellonella tem um futuro promissor com sua capacidade de desenvolver estruturas semelhantes a Granuloma em resposta à infecção pelo BCG Lux 16, que são características fisiopatológicas vitais da infecção por TB e são uma chave no desenvolvimento da LTBI. O trabalho futuro visará caracterizar este modelo com um interesse particular na formação de granuloma-como estruturas usando a referência, os isolados clínicos e do mutante de MTB condições de CL3. Adicionalmente, nós prevemos que pode igualmente ser útil para a seleção antimycobacterial nova do agente, como um modelo similar do G. mellonella foi usado para Ntms18, mas este permanece ser determinado. A adoção desse modelo tem a capacidade de reduzir significativamente o número de animais utilizados dentro da comunidade de pesquisa da TB, acelerando simultaneamente a produção de pesquisa de TB in vivo condições eticamente mais aceitáveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este projeto foi apoiado por subsídios do Conselho de pesquisa em biotecnologia e ciências biológicas (BBSRC), concedido a PRL e YL (BB/P001262/1), e ao centro nacional de substituição, refinamento e redução de animais em pesquisa (NC3Rs) concedido ao PRL, SMN, BDR e YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
