Summary
우리는 원뿔 판 점도를 사용 하 여 혈소판 표면 수용 체에 균일 한 전단을 적용 하는 인 솔루션 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 다른 세포 유형 및 세포 단편에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍을 표적으로 할 필요가 없는 더 광범위 하 게 사용 될 수 있다.
Abstract
많은 생물학 세포/조직은 기계 수용 체를 통해 그들의 현지 환경의 기계적인 속성을, 압력 또는 기계적인 섭 동 같은 힘에 반응할 수 있는 단백질을 감지 합니다. 기계 수용 체는 자극을 감지 하 고 다양 한 메커니즘을 통해 신호를 전송 합니다. 기계 수용 체에 대 한 가장 일반적인 역할 중 일부는 신경 반응에, 터치와 통증 같은, 또는 균형 및 청각에서 기능 하는 머리 세포. 기계 감각은 또한 정기적으로 혈관 내 피 세포와 같은 전단 응력에 노출 되는 세포 종류에 대 한 중요 한, 어떤 라인 혈액 혈관, 또는 정상적인 순환에 전단을 경험 하는 혈액 세포. 점도 계는 유체의 점도를 감지 하는 장치입니다. 회전 점도 계는 또한 유체에 공지 된 전단 력을 적용 하기 위해 사용 될 수 있다. 유체에 균일 한 전단을 소개 하는이 계기의 능력은 혈액과 플라스마를 포함 하 여 많은 생물학 액체를 연구 하기 위하여 착취 되었습니다. 점도는 또한 용액 내의 세포에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍에 전단의 영향을 시험 하기 위해 사용 될 수 있다. 여기에서, 우리는 콘 플레이트 점도 혈소판 기계 감각 수용 체 복잡 한 GPIb에 대하여 항 체로 처리 한 혈소판에 전단 응력의 내 인 성 수준의 효력을 시험 하기 위하여 이용 합니다.
Introduction
기계 수용 체는 압력 또는 기계적인 섭 동/변형과 같은 기계적인 자극에 반응 하는 단백질입니다. 일부 기계 수용 체의 경우, 이러한 기계적 섭 동을 감지 하는 것은 그들이 발현 되는 세포 유형의 기능에 명시 적 이다. 복용, 예를 들어, baroreceptor 뉴런의 스트레칭 수용 체; 이러한 기계 과민 이온 채널은 혈관 "스트레칭"1,2를 감지 하 여 혈압을 조절 합니다. 내이에서 머리카락 세포의 이온 채널은 음파3으로 인 한 기계적 변형을 감지 하 고 피부 낮은 임계 기계 수용 체 (ltmrs)는 촉각 정보4의 전달을 용이 하 게 합니다. 다른 경우에, 기계 수용 체는 접착 또는 성장의 설치를 위해 세포에 중요 한 정보를 제공 합니다. 세포는 그들의 국부 환경의 강성을 감지할 수 있고, 성장 또는5확산을 지시 하는 액 틴 세포 골격 및 인 테 그린을 통해 수축 힘에 의존할 수 있다.
세포 또는 조직 기반 모델에서 수용 체-리간드 상호 작용을 연구 할 때, 온도, pH, 리간드 농도, 음조, 막 전위 및 기타 여러 매개 변수를 변경 하는 효과를 신속 하 고 정확 하 게 보고할 수 있는 일반적인 분석 법이 존재 합니다. 생체 내에서 다를 수 있습니다. 그러나,이 같은 분석은 수용 체 활성화에 기계적인 힘의 기여를 검출 하는 관해서 짧은 떨어질 수 있습니다. 세포가 그들의 미세 환경을 감지 하 고, 음파를 감지 하거나, 스트레칭에 반응 하 든, 앞서 언급 한 기계 수 용기가 공통적으로가지고 있는 것은 리간드, 수용 체 또는 둘 모두가 상호 작용에 참여 한다는 것입니다. 표면. 수용 체 상호 작용에 기계적인 힘의 효력을 시험 하기 위하여 개발 된 분석은 수시로이 패러다임을 반영 합니다. 미세 유체 및 유량 챔버는 세포 및 수용 체7,8에 대 한 전단 흐름의 효과를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이러한 유형의 실험은 확립 된 흐름 속도를 통해 전단 속도를 미세 조정할 수 있는 이점이 있습니다. 다른 기술은 형광 분자 프로브를 사용 하 여 리간드가 풍부한 표면에 세포가가 해지는 힘을 감지 하 고 상호 작용9,10에 관련 된 힘의 크기와 방향을 정확 하 게 판독 합니다.
하나 또는 두 파트너가 표면에 고정 되는 경우 발생 하는 기계 감각 외에도 전단 응력은 용액의 단백질과 세포에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 수시로 순환에서 지속적으로 혈액 세포/단백질에서 관찰 되 고, 일반적으로 표면 앵커 링 되는 기계 수용 체의 활성화를 통해 나타날 수 있다11, 또는 아래 폐색 되는 대상 시퀀스의 노출을 통해 정적 조건12. 그러나 상대적으로 적은 기법은 용액 내 입자에 대 한 전단 력의 영향을 분석 합니다. 일부 인-솔루션 접근법은 다양 한 속도와 기간으로 유체 현 탁 액의 볼 텍 싱 세포를 통해 전단을 도입 하지만, 이러한 접근법은 생성 된 전단 응력의 매우 정밀한 결정을 허용 하지 않을 수 있다. 회전 점도 계 유체에 특정 전단 력을 적용 하 여 점도를 측정 합니다. 본 명세서에서는 용액 중의 세포 또는 세포 단편에 대 한 특정 층 류 전단 율의 효과를 결정 하기 위한 적용 방법을 설명 한다.
혈소판 표면에 가장 높게 발현 된 단백질 중 하나는 당단백질 (GP) Ib-IX 복합체 이다. GPIb-IX는 본 플라즈마 단백질에 대 한 1 차 수용 체 폰 빌 레 브란트 팩터 (VWF) 이다. 함께,이 수용 체-리간드 쌍은 전단 응력 (13)에 대 한 혈소판 반응의 기초로 서 오랫동안 인식 되 고 있다. 혈관 손상이 발생 하는 경우, VWF는 부 내 피 매트릭스14의 노출 된 콜라겐에 결합 하 여 Vwf-GPIB-IX 상호작용을 통해 부상 부위를 혈소판으로 모집 합니다. VWF는 GPIbα 서브 유닛에서의 결합 부 위에 참여 하 여 생리 적 전단 응력 하에서 GPIb-IX는 멤브레인 근 위부 (MSD) 도메인의 전개를 유도 하 고이는 GPIb-IX15를 차례로 활성화 시킨다. 최근의 연구에서, 우리는 많은 면역 혈소판 감소 증 (ITP) 환자에서 생성 된 것과 같은 GPIbα에 대 한 항 체가 또한 전단 응력11하에서 MSD를 통해 서 발생 하는 혈소판 신호를 유도할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 그러나 일반적인 순환 하에서 복합체를 고 정화 함으로써 전단 유도 된 GPIb-IX 활성화를 용이 하 게 하는 VWF와는 달리,이가 항 체는 GPIb-IX를 통해 혈소판을 가교 결합 하 고, 순환 하 여 MSD를 펼칠 수 있습니다. 이러한 방식으로, 일반적으로 전단 하에서 표면 고 정화에 의해 활성화 되는 기계 수용 체는 용액에서 활성화 될 수 있다. 본 보고서에서는 용액에서의 수용 체 활성화에 대 한 특정 수준의 전단 응력의 영향을 검출 하기 위해 점도 계 기반 균일 전단 분석을 활용 하는 방법을 설명 합니다.
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Protocol
본 원에 기재 된 기증자 유래 인간 혈소판을 사용 하는 모든 방법은에 모리 대학교/아 틀 란 타의 어린이 건강 관리 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 혈액 채취 및 혈소판 분리
- 실험 당일에에 동의 건강 한 성인 기증자를 통해 인간의 혈액을 그립니다 3.8% 트리 구 연산 나트륨. 혈액의 1 개의 4.5 mL 관은 혈소판이 1 μ l 당 250 x 10에 가까운 기증자에 있는 20-25 조건에 대 한 충분 한 혈소판 풍부 혈장 (PRP)를 산출 하기 위하여 충분 합니다.
참고: 좁은 게이지 바늘 (21G 보다 작음)을 통해 혈액을 채취 하지 마십시오. - 22 ° c에서의 원심 분리를 통해 PRP를 준비 하 고, 긴 브레이크로 12 분 동안 140 x g . 이것은 두 개의 별개의 층으로 이어질 것입니다, 아래에 적혈구와 상단에 밝은 색깔의 PRP.
- 45 ° 각도로 절단 된 피 펫 팁을 통해 신중한 파이 펫 팅을 통해 PRP의 위, 흐린, 노란 층을 분리 하 고 완전 한 혈 수 (CBC)를 통해 혈소판 수를 얻습니다.
- 필요한 경우에는 파이프에서 혈소판을 세척 하 고, 2.9 0.34 134 Tyrode의 프로 스타 글란 딘 E1 (PGE1)과 소생의 존재 하에 완충 식 염 분 (150 mM의 염화 나트륨, 20mm 파이프)에,1mmmgcl 2, 5mm 포도 당,12mm 3, 20 MM 헵 스, pH 7.35) 5 mm 글루코스를 사용 하는 경우, 1.5 단계로 진행 합니다. 다음 단계는 간단한 세척을 설명 합니다.
- PRP 볼륨을 10 mL의 파이프 완충 식 염 수로 조정 하 고 0.6 μ m PGE1를 추가 합니다.
- 1900 x g에서 8 분 동안 원심 분리 한 다음 상층 액을 버리고 5 분 동안 Tyrode 및 글루코스 용액의 400 μ l에 혈소판 펠 렛을 둡니다.
- 혈소판 펠 렛을 부드럽게 소생 시켜 30 분 동안 그대로 유지 합니다.
- 혈소판 계수를 풀링 된 인간 혈소판-불 쌍 한 혈장 (PPP)과 함께 μ l 당 10 ~ 250 x 103으로 조절 하 고 방해 받지 않는 또는 완만 한 회전 하에서 22 ° c에서 현 탁 액을 유지 한다.
2. 리간드 및 균일 한 전단 처리
참고: 파이 펫 팅을 필요로 하는 섹션 2의 모든 단계는 어떤 전단도 도입 하지 않도록 천천히 이루어져야 합니다.
- PRP 또는 세척 된 혈소판에 원하는 항 체 또는 리간드를 추가 하 고 피 펫 팁으로 위아래로 피 펫 팅 하 여 부드럽게 섞 습니다. 5-10 분 동안 실 온에서 그대로 두십시오. 동등한 양의 PPP 또는 Tyrode의 버퍼를 음수 컨트롤에 추가 합니다.
- 콘 플레이트 점도 계의 전원을 켜고, 플레이트 온도를 22 ° c로 설정 하 고, 플레이트가이 온도에 도달 하 게 할 시간을 허용 합니다.
- 처리 된 PRP 또는 세척 된 혈소판을 플레이트의 중앙에 직접 온도 조절 된 원추 판 점도 계에 피 펫 한다. 모든 샘플이 콘과 플레이트 사이에 접촉 지점에 침착 되 고 원뿔의 림의 바깥쪽이 아니라는 것을 확인 합니다.
- 적절 한 속도와 지속 시간에 전단.
- 점도 계 설명서에 표시 된 대로 또는 앞에서15,16으로 표시 된 대로 전단을 계산 합니다.
- 뉴턴의 점도 법칙을 통해 점도 및 원하는 전단 응력에서 전단 속도를 결정 합니다.
; 플라즈마 점도는 1.5 ~ 1.6 센 포 이즈 (cP)17입니다. 예를 들어, 인간의 순환에 대 한 일반적인 전단 범위는 5-30 dyn/cm2 이 고 전단은 단일 자릿수 분 시간 척도에 적용 되어야 합니다.
- 샘플이 플레이트와 콘 모두와 접촉 하 게 유지 되도록 플레이트 약간 (~ 2mm)의 콘을 들어올려, 샘플 부피의 중심에서 5-10 μ l를 수집 하기 위해 겔 로딩 또는 다른 긴 피 펫 팁을 사용 한다.
- 실 온에서 20 분 동안 원하는 마커로 전단 된 시료를 배양 합니다. 포스 파티 딜 세 린, β-갈 락 토즈 및 P-셀 렉 틴 (LactC2)을 0.08 μ m에서 C2 도메인에사용 하 고, 6.25 μ g/m l에서, 그리고 안티 피-셀 리 틴 항 체 (20 µ를 각각)에 노출 시켰다.
- 희석 또는 냉장 보관 전에 RT에서 20 분 동안 2% 파라 포 름 알 데히드로 샘플을 고정 하 고, 3.1 단계까지 진행 하거나 4°c에서 12 시간 이상 동안 시료를 보관 하십시오.
; 플라즈마 점도는 1.5 ~ 1.6 센 포 이즈 (cP)17입니다. 예를 들어, 인간의 순환에 대 한 일반적인 전단 범위는 5-30 dyn/cm2 이 고 전단은 단일 자릿수 분 시간 척도에 적용 되어야 합니다.3. 유 세포 분석을 통한 표면 마커 및 가교의 검출
- 유 세포 분석기를 통해 샘플을 분석 하 고 각 조건에 대해 최소 2만 이벤트를 수집 합니다.
- 각 형광 물질의 세기에 대 한 높이 값 또는 기하학적 평균 형광 강도 (MFI)를 사용 하는 형광체 마커의 정량 신호 강도.
- 전단 처리 후에 혈소판 가교 결합을 검출 하는 것을 목표로 하는 경우, 이미징 가능한 유 세포 계와 수량자로 면적 및 종횡비 매개 변수로 샘플을 분석 합니다.
- 면적 및/또는 종횡비의 히스토그램을 플로팅합니다.
- 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 또는 차량이 대부분의 완전 원형 이벤트를 제외 하 고 게이트를 그리는 네거티브 컨트롤을 사용 하 여 (이 게이트는 일반적으로 종횡비 ~ 0.819에서 그려진,20)이 게이트의 내부 이벤트의 비율을 정량화. 종횡비가 낮은 이벤트는 가교 화 될 가능성이 더 높습니다.
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Representative Results
도 1 은 상기 혈관 벽에 앵커 되었을 때 전단 의존적 수용 체 활성화를 설명 하기 위해 처음 도입 된 GPIB-IX 활성화의 트리거 모델을 개략적으로 설명 하 고, 또한 다가 리간드에 의해 가교 된 혈소판의 활성화를 지원할 수 있다. 도 2 는 GPIB-IX (6B4 및 11A8)의 N-말단 도메인을 표적화 하 고 전단 및 정적 조건 하에서 하나의 대조 항 체 (정상 IgG)를 대상으로 하는 2 개의 항 체에 의해 처리 된 인간 혈소판 활성화의 판독을 보여준다. 도 3에서, 혈소판은 6b4 및 비 결합 력이 지나치게 낮은 항 체로 처리 하 여 GPIB-IX 활성화를 AK2. 그림 4 에는 시간 코스가 나와 있습니다. 혈소판 활성화의 마커는 11A8 또는 AK2로 전단 처리 시 진보적인 시점에서 프로브 및 검출 되었다. 도 5에는, GPIb-IX N-말단 도메인으로 데코 레이트 된 항 체 가교 결합 혈소판 크기 비드가 통상적인 유 세포 분석기를 통해 분석 되었다. 그림 5 b 는 이미징 유 세포 분석을 통해 이미지화 된 혈소판의 6b4 매개 가교 결합을 보여준다. 도 6에서, 면역 혈소판 감소 증을 가진 환자 로부터 혈 청의 임상 샘플은 이전 도면에서 사용 된 GPIB-IX에 대 한 2가의 단일 클론 항 체 대신에 사용 되었다. Gpib-ix에 대항하는 환자 혈장 함유 항 체는 GPIb-IX를 표적으로 하는 항 체가 없는 ITP 환자의 혈장과는 대조적으로 전단 의존적 반응을 촉발 시켰다.
그림 1 : 혈소판 표면 기계 리셉터 GPIb-IX는 가용성 2가 리간드 (예컨대 항 체)를 결합할 수 있다. 반대 혈소판에 두 개의 GPIb-IX 복합체가 동일한 2가 리간드에 결합할 때, 가교 결합이 일어난다. 생리 적 전단 하에서, 가교 된 혈소판은 GPIb-IX에 작용 하 고 그 안에 MSD를 펼쳐 당기는 힘을 생성할 수 있다. MSD의 결과로 서, GPIb-IX는 예시 된 바와 같이 활성화 되 고 혈소판 신호 전달 및 하류 혈소판 클리어런스를 유도 합니다. 그림은 Quach et al에서 적응 되었다.21이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대조 IgG 또는 안티 GPIb-IX 항 체 11A8 및 6B4를 정적 또는 전단 하에 처리 한 인간 PRP에서 혈소판 활성화 마커의 발현. 이러한 대표적인 결과에 있어서, 포스 파티 딜 세 린 (PS), β-갈 락 토즈 및 P-셀 렉 틴에의 한 혈소판 표면 노출은 녹색 형광 단백질 (GFP) 공액에 의해 양성자 화 되었고, FITC에 컨 쥬 게이 트 된 리 티 나 크리스 티 리 렌 (ECL) 및 APC 공액 항-P-Selectin 항 체 각각. 형광은 유 세포 분석을 통해 검출 되었다. 데이터는 네거티브 컨트롤 위의 형광 이벤트의 백분율로 표현 된다. p ≤ 0.001, ≤ 0.0001; 학생의 t-검정을 통해 결정 되는 의미. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 인간 PRP는 두 항-GPIb-IX 항 체로 처리. 인간 PRP는 2 개의 안티 GPIb-IX 항 체로 처리 하 고, 하나는 고 결합 력이 높은 (6B4)이 고 하나는 정적 (0dyn/2cm 2),낮은 전단 력 (AK2) 및 고 전단 (30dyn/2cm)의 조건입니다. 그래프는 β-갈 락 토즈, PS 및 P-Selectin의 표면 발현을 위해 양성 된 이벤트의 퍼센트를 보여준다. * p ≤ 0.001 0.05. 유의 성은 Tukey 테스트와 함께 단방향 ANOVA를 통해 결정 되었다. 오차 막대는 SD를 나타냅니다. 그림은 Quach et al에서 조정 되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 제어 IgG, 11A8 또는 AK2로 처리 된 인간 PRP를 위한 전단 노출 시간 과정 (20dyn/2cm2). PS 및 P-Selectin의 혈소판 표면 노출은 0, 0.5, 1, 3 및 5 분에 대 한 샘플에 대 한 유 세포 분석을 통해 검출 되었다 0.0001 0.001. 유의 성은 Tukey 테스트와 함께 단방향 ANOVA를 통해 결정 되었다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 면적 및 종횡비 매개 변수에의 한 양자화 교차. (a) 혈소판 크기 (4 µm) 비드의 N-말단 도메인과 함께 컨 쥬 게이 트 된 GPIbα 및 IgG (20dyn/2cm) 조건 하에서 AK2 (적색) 또는 6b4(청색)로 인큐베이션 하였다. 다음은 전방 산포 (FSC-A) 대 항 항 체 형광에 대 한 등고선 도표입니다. (b) PRP에서 혈소판의 종횡비에 대 한 히스토그램은 6b4 및 형광 표지 된 안티 CD41 (혈소판 마커) 항 체를 전단 하에 인큐베이션 한다. 다양 한 종횡비의 대표 이미지가 표시 됩니다. 그림은 Quach et al에서 조정 되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 면역 혈소판 감소 증 환자 로부터 혈 청의 임상 샘플을 GPIb-IX에 대 한 2가의 모노 클로 날 항 체 대신 사용 하였다. (a) itp를 갖는 환자 로부터 혈장의 GPIB-IX 결합 용량은, 효소 결합 면역 흡수 분석 법을 통해 서 (ELISA). (b) 정전기 및 전단 하에 itp 환자 혈장에서 재구성 된 인간 혈소판을 세척 (30 dyn/cm2) 조건. 그래프는 P-Selectin 또는 0.0001 PS의 표면 표현식에 대해 양수 인 이벤트의 백분율을 표시 합니다. 유의 성은 Tukey 테스트와 함께 단방향 ANOVA를 통해 결정 되었다. 오차 막대는 SD를 나타냅니다. 그림은 Quach et al에서 조정 되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 원고에 설명 된 프로토콜은 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 층 류 전단 효과의 신속 하 고 다양 한 평가를 할 수 있습니다. 여기에 제시 된 특정 대표적인 결과는 다이 성체 또는이가 리간드의 영향이 전단 흐름에 의해 영향을 받을 수 있는 방법을 강조 한다. 이 응용 분야 외에도 균일 한 전단 분석은 전단 의존적 효과를 관찰 하는 광범위 한 응용 분야를가지고 있습니다. 알려진 리간드-수용 체 쌍의 부재 하에서, 균일 한 전단 분석은 또한 특히 유 세포 분석 분석과 쌍을 이루는 경우 세포 형태 및 신호와 같은 요인에 대 한 전단의 영향을 검출할 수 있습니다. 그림 5b에 의해 부분적으로 언급 되는 균일 한 전단 분석은 이미징, 생화학 및 세포 기반을 포함 하 여이 프로토콜에 설명 된 표준 유 세포 측정 분석을 보완 하는 것 이외의 다양 한 검출 방법에 적합 합니다. 분석.
도 2 는 특히 전단 의존적 리간드-수용 체 상호작용 및 음성 대조 군 사이를 감 별 하는 분석 법의 기본적인 응용을 예증 한다. 6B4는, GPIb-IX 수용 체에 결합을 통해 혈소판을 가교 시키고 수용 체 (11)를 활성화 시키기에 충분 한 힘을 지지 하는 항 체 이며, 달리 ( 도 1에서 모델에 묘사 된) 전단에 노출 될 때 혈소판 활성화 혈소판 GPIb-IX를 결합 하지 않는 제어 IgG. 이 응용 프로그램은 동시에 효과가 선택 된 수용 체-리간드 쌍에 특정 하 고 전단에 의존 한다는 증거를 제공 한다. 균일 한 전단 분석은 또한 특정 전단 수준 하에서 수용 체에 대 한 결합을 유지할 수 있는 리간드의 효과를 구별할 수 있습니다. 도 3에서, 우리는 그의에 피토 프를 특히 약한 결합 력 (11)과 결합 하는 항-GPIb-IX 항 체 AK2 로부터의 시그널링 판독의 결여를 볼 수 있다. 또한이 수치는 원추 판 점도 계에 의해 적용 되는 전단 응력의 수준이 낮은 것에서 높은 전단까지 다양 한 영향을 보여줍니다.
그림 4 는이 분석을 사용 하 여 전단 노출의 길이를 조절 하 고이 데이터를 표시 하는 전략을 제안 한다는 것을 보여줍니다. 도 5에서, 분석을 위한 2 개의 대안적인 유 세포 분석 기반의 리드 아웃이 사용 되며, 둘 다 수용 체 활성화의 형광 마커에 의존 하지 않고 대신에 가교 결합 및 크기/형태 변화를 설명 하기 위해 사용 될 수 있다. 그림 5 b 는 이벤트의 크기에 비례하여 증가 하는 전방 분산을 통해 연결 되지 않은 (일 중), 의심, 삼중 항 또는 더 높은 복합성 가교 이벤트의 고유 인구를 구분할 수 있는 방법을 보여줍니다. 도 5에서와 같이, 분석은 관심 있는 수용 체에 접합 된 비드에 적용 될 수 있으며,이는 다른 방법을 통해 본 가교 결합 사건에 참여 하는 다른 수용 체의 가능성을 제거 한다. 도 6에서, 우리의 관심 수용 체에 대 한 잠재적 리간드를 함유 하는 생물학적 유체는 정제 된 단일 클론 항 체 대신에 사용 된다. 이는 관심 있는 수용 체에 대 한 특정 공지 된 리간드 또는 결합 파트너가 필요 하지 않을 수 있는 응용을 예시 한다.
분석은 기록 된 대로 상당히 접근 가능 하지만, 주의 해 서 수행 해야 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 그 중 가장 중요 한 것은 실제 전단 처리 자체 이외의 외부 소스에서 전단을 도입 하지 않도록 주의 하는 것입니다. 혈액을 그릴 때,이 프로토콜의 1.1 단계에서 언급 한 바와 같이, 적절 한 게이지 바늘을 통해 그것을 그리는 것이 중요 하다. 인간 혈액 수집을 통한 성병에 대 한 동의 로부터 성인 기증자에 게이는 21 G의 혈액 채취 세트 ( 재료 표에나열 됨)로 달성할 수 있습니다. 피가 그려지고 PRP가 분리 되 면, 그것은 벤치 또는 느린 로티 서 스에 최대 6 시간 동안 실 온에서 저장할 수 있습니다.
원심 분리기가 다른 속도로 PRP 수 브레이크를 분리 하는 데 사용 되는 경우는 PRP 층의 교란과 불필요 한 힘의 적용을 최소화 하기 위해 느린 브레이크를 선택 하는 것이 가장 좋습니다. PRP가 분리 되거나 관심 있는 세포 유형이 유체 현 탁 액 인 경우, 혼합물을 너무 빨리 피 펫 팅 하지 마십시오. 대신 특히 좁은 피 펫 팁을 통해 샘플이 그려진 2.5 단계에서 느리고 꾸준한 방식으로 샘플을 흡 인 및 추방 합니다. 다양 한 크기의 파이 펫 팁을 통해 정확 하 게 파이프 될 수 있는 샘플 부피의 경우, 그 중에서 가장 큰 것을 사용 하는 것이 좋습니다. 특히 민감하거나 점성이 있는 시료의 경우, 피 펫 팁의 끝 부분을 각도로 절단 하 여 시료를 그릴 수 있는 개 구 부를 넓힐 수 있습니다.
세포질 기계 감각에 전단의 효과 테스트 많은 분석은 앵커 리간드와 수용 체 사이의 상호 작용에 의존. 마이크로 유체 및 유동 챔버는 하나의 예를 들면, 앵커 된 리간드와 수용 체 사이의 상호작용이 일반적으로 용액의 세포에 있는 경우, 실시간으로 관찰 될 수 있다7,8. 다른 기술은 현미경 검사 법을 사용 하 여 세포 층과 기초 기판 또는 프로브9사이의 계면에서 발생 하는 사건을 검출 한다. 이러한 기술은 혈액 세포를 순환 연구에 특히 큰 영향을 사용 되었습니다. 반면에, 흐름에 따라 솔루션에서 완전히 발생 하는 이벤트의 심문을 허용 하는 기술은 더 제한적입니다. 솔루션에서 힘의 일반적인 응용 프로그램에 대 한, 볼 텍 싱 샘플은 "신속 하 고 더러운" 방법으로 작용할 수 있습니다. 그러나, 정확한 힘이가 해지는 것을 결정 하는 것은 어려우며, 전단은 층 류로 인해 발생 하는 것이 확실 하지 않다. 이것은 균일 한 전단 분석의 장점 중 하나입니다. 반면에, 균일 한 전단 분석의 주된 단점은 애플리케이션 전단과 세포 자체 관찰 사이의 시간 갭 이다. 전단이 적용 되 면 세포가 염색 되 고 고정 되지만 이미징 기술은 전단 공정 자체에서 세포를 관찰할 수 없습니다. 이 방법의 한 가지 적응은 마커가 존재 하는 원하는 마커와 전단에 직접 셀을 추가 하는 것을 포함 한다. 이렇게 하면 일시적인 효과를 즉시 감지할 수 있습니다.
지금까지 우리는 GPIb-IX 복합물을 표적으로 하는 항 체의 전단 의존적 인 용액 효과를 검출 하기 위하여이 분석 법을 적용 했습니다. 항 체가 편리 하 고 단순한 2가 결합 파트너를 제공 하는 반면, 순환 중에 대립 세포에 대 한 기계 수용 체의 가교 결합이 충분히 높은 결합 해제를 가진 무수 한 다가 리간드를 통해 이루어질 수 있다고 가정 하는 것이 논리적입니다 세력. 이러한 기술은 미래에 이러한 리간드의 특이 적 효과를 검출 하는데 유용할 수 있다. 추가적으로, 균일 한 전단 분석은 표준 형광 현미경과 같은 본 원에 기술 되지 않은 이미징 기술과 함께 사용 될 수 있다. 궁극적으로, 균일 한 전단 분석은 용액에서 세포 및 세포 단편에 층 류 전단을 적용 하기 위한 합리적으로 저렴 하 고 정량적 이며 구체적인 방법을 제공 하며, 많은 검출 방법의 업스트림을 사용할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구에 관련 된 작업은 국가 보건 연구소 (NIH) 국립 심장, 폐 및 혈액 학회 보조금 HL082808, HL123984 (R.L.) 및 F31HL134241 (M.E.Q.)에 의해 부분적으로 지원 되었습니다. 자금 조달은 또한 NIH 국립 연구소 일반 의료 과학 교부 금 T32GM008367 (M.E.Q.)에 의해 제공; 애 틀 란 타 및에 모리 대학교 소아과 유 세포 분석 코어의 아동 건강 관리에서 파일럿 보조금을 지급 합니다. 저자는 6B4 항 체를 공유 하는 Dr. Hans Deckmyn과 기술 지원을 위한 Emory 아 이들의 소아과 연구 센터 유 세포 분석 코어를 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | - | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
References
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