コーンプレート Viscometry を介したヒト血小板および細胞表面レセプターに対する均一なせん断アッセイ
Summary
コーンプレート viscometry を用いて血小板表面受容体に均一な剪断力を加える溶液法について述べる.この方法は、他の細胞型および細胞断片に剪断を適用するためにより広範に使用されてもよく、特定のリガンド受容体対を標的とする必要はない。
Abstract
多くの生物学的細胞/組織は、mechanoreceptors を介してそれらの局所環境の機械的特性を感知し、圧力または機械的摂動のような力に応答することができるタンパク質。Mechanoreceptors は、彼らの刺激を検出し、メカニズムの偉大な多様性を介して信号を送信します。Mechanoreceptors の最も一般的な役割のいくつかは、接触や痛みのようなニューロン応答、またはバランスと聴覚で機能する有毛細胞です。Mechanosensation は、血管をラインにする内皮細胞、または正常な循環でせん断を経験する血球細胞などのせん断応力に定期的に曝露される細胞タイプにとっても重要です。粘度計は、流体の粘度を検出するデバイスです。回転粘度計はまた、流体に既知の剪断力を適用するために使用することができる。これらの器具が均一なせん断力を液体に導入する能力は、血液および血漿を含む多くの生物学的流体を研究するために利用されてきた。Viscometry は、溶液中の細胞に剪断を適用し、特定のリガンド-受容体対に対するせん断の効果を試験するためにも使用することができる。ここでは、コーンプレート viscometry を利用して、血小板 mechanosensory レセプター複合体 GPIb-IX に対する抗体で処理された血小板に対する内因性レベルのせん断応力の影響を試験します。
Introduction
Mechanoreceptors は、圧力や機械的な摂動/変形などの機械的刺激に反応するタンパク質です。いくつかの mechanoreceptors では、これらの機械的摂動を感知することは、それらが発現される細胞型の機能に明示的である。例えば、圧受容器ニューロンにおける伸張受容体をとる。これらの mechanosensitive イオンチャネルは、血管を感知することによって血圧を調節する “ストレッチ”1,2.内耳において、有毛細胞上のイオンチャネルは、音波3によって引き起こされる機械的変形を検出し、そして皮膚下限閾値 Mechanoreceptors (LTMRs) は、触覚情報4の伝達を促進する。他の場合には、mechanoreceptors は、接着または成長の確立のための細胞に重要な情報を提供します。細胞は、それらの局所環境の剛性を感知することができ、成長または広がりを指示するためにアクチン細胞骨格およびインテグリンを介して収縮力に頼ることができる5,6.
細胞または組織ベースのモデルで受容体-リガンド相互作用を研究する場合、温度、pH、リガンド濃度、張度、膜電位、および他の多くのパラメータの変化の影響を迅速かつ正確に報告することができる一般的なアッセイが存在するインビボで変化し得る。しかし、これらの同じアッセイは、受容体活性化に対する機械的な力の寄与を検出することになると、短くなる可能性があります。細胞がその微小環境を感知するか、音波を検出するか、または伸張に反応するかにかかわらず、前述の mechanoreceptors が共通して持っている1つのことは、リガンド、受容体、またはその両方が、a に固定されている相互作用に参加していることである。表面。受容体相互作用に対する機械的力の影響を試験するために開発されたアッセイは、しばしばこのパラダイムを反映する。マイクロ流体およびフローチャンバは、細胞およびレセプター7、8に対するせん断流の影響を研究するために使用される。これらのタイプの実験には、確立された流速によるせん断速度の微調整が可能であるという利点があります。他の技術は、リガンドが豊富な表面上の細胞によって適用される力を検出するために蛍光分子プローブを用いて、相互作用9,10に関与する力の大きさおよび向きの正確な読み出しをもたらす。
一方または両方のパートナーが表面に固定されている mechanosensation に加えて、せん断応力は溶液中のタンパク質および細胞に影響を与える可能性があります。これは、循環中に常にある血液細胞/タンパク質でしばしば観察され、通常表面固定された11の mechanoreceptors の活性化を介して、または下に閉塞する標的配列の暴露を介して現れることがある。静的条件12.しかし、溶液中での粒子に対する剪断力の影響を検定する技術は比較的少ない。いくつかのソリューション内アプローチでは、流体懸濁液中のボルテックスセルを介したせん断をさまざまな速度と持続時間で導入しますが、これらのアプローチでは生成されるせん断応力を非常に正確に決定することはできません。回転粘度計は、流体に特定のせん断力を加えることによって粘度を測定します。ここでは、溶液中の細胞または細胞断片に対する特定の層流せん断速度の効果を決定するための適用された方法について説明する。
血小板表面で最も発現の高いタンパク質の1つは、糖タンパク質 (GP) Ib-IX 複合体です。GPIb-IX は、血漿タンパク質フォンビルブラント因子 (VWF) の一次受容体です。一緒に、この受容体−リガンド対は、せん断応力13に対する血小板応答の基礎として長く認識されてきた。血管損傷の場合、VWF は、サブ内皮マトリックス14内の露出したコラーゲンに結合し、したがって、Vwf − GPIB − IX 相互作用を介して損傷部位に血小板をリクルートする。、生理的せん断応力下での GPIb-IX が膜近位 mechanosensory ドメイン (MSD) の展開を誘導し、GPIb-IX15を活性化する場合、おいサブユニットの結合部位への VWF の関与。最近の研究では、多くの免疫性血小板減少症 (ITP) 患者で発生したもののようなおいに対する抗体が、せん断ストレス11の下で展開される MSD を介して血小板シグナリングを誘導することもできることを示しました。しかし、この複合体を正常な循環で固定化することでせん断誘起の GPIb-IX 活性化を促進する VWF とは異なり、二価抗体は GPIb-IX を介して血小板を架橋し、MSD を循環させることができます。このようにして、せん断下での表面固定化によって通常活性化される mechanoreceptor を溶液中で活性化させることができる。本報告では、粘度計ベースの均一せん断アッセイがどのように活用され、溶液中での受容体活性化に対するせん断応力の特定のレベルの影響を検出する方法を示す。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿に記載されているプロトコールは、血小板および細胞表面受容体に対する層間せん断の効果を迅速かつ多目的に評価することを可能にする。ここに示す具体的な代表結果は、多量体または二価リガンドの効果がせん断流によってどのように影響を受けるかを強調しています。この適用に加えて、均一せん断の試金はせん断依存の効果を観察することの広い適用を有する。既知のリガ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究に関連する作業は、国立衛生研究所 (NIH) 国立心臓、肺、および血液研究所助成 HL082808、HL123984 (R.L.)、および F31HL134241 (M.E.Q.) の一部によってサポートされていました。また、NIH 国立医学総合研究所助成 T32GM008367 (M.E.Q.) によって提供された資金。そして、アトランタとエモリー大学小児科フローサイトメトリーコアの子供のヘルスケアからのパイロット助成金。著者は、6B4 抗体を共有するためのハンス・ Deckmyn 博士、およびエモリー小児研究センターのテクニカルサポートのフローサイトメトリーコアに感謝したいと思います。
Materials
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | – | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
References
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. . Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
