Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

فحص القص الموحد للصفيحات البشرية ومستقبلات سطح الخلية عبر اللوحة المخروطية

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

نحن وصف طريقه في الحل لتطبيق القص موحده لمستقبلات سطح الصفائح الدموية باستخدام مخروط لوحه الرؤية. ويمكن أيضا استخدام هذه الطريقة علي نطاق أوسع لتطبيق القص علي أنواع الخلايا الأخرى وشظايا الخلايا ولا تحتاج إلى استهداف زوج محدد للمستقبلات.

Abstract

العديد من الخلايا البيولوجية/الانسجه الشعور الخواص الميكانيكية للبيئات المحلية عن طريق المستقبلات اليه ، والبروتينات التي يمكن ان تستجيب لقوي مثل الضغط أو الاضطرابات الميكانيكية. المستقبلات الميكانيكية الكشف عن المحفزات ونقل الإشارات عبر تنوع كبير من أليات. بعض الأدوار الأكثر شيوعا للمستقبلات الميكانيكية هي في الاستجابات العصبية ، مثل اللمس والم ، أو خلايا الشعر التي تعمل في التوازن والسمع. الميكانيكية هي أيضا مهمة لأنواع الخلايا التي تتعرض بانتظام للإجهاد القص مثل الخلايا البطانية ، التي الاوعيه الدموية الخط ، أو خلايا الدم التي تواجه القص في الدورة الدموية العادية. عدادات الرؤية هي الاجهزه التي تكتشف لزوجه السوائل. كما يمكن استخدام مقاييس الرؤية التناوبية لتطبيق قوه قص معروفه علي السوائل. وقد استغلت قدره هذه الاداات علي إدخال القص الموحد علي السوائل لدراسة العديد من السوائل البيولوجية بما في ذلك الدم والبلازما. كما يمكن استخدام القياس البصري لتطبيق القص علي الخلايا في المحلول ، ولاختبار تاثيرات القص علي أزواج محدده من الحروف والمستقبلات. هنا ، ونحن نستخدم مخروط لوحه الرؤية لاختبار اثار المستويات المحلية من الإجهاد القص علي الصفائح الدموية التعامل مع الأجسام المضادة ضد الصفائح الدموية الميكانيكية مجمع مستقبلات GPIb التاسع.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

المستقبلات اليه هي البروتينات التي تستجيب للمؤثرات الميكانيكية ، مثل الضغط أو الاضطراب الميكانيكي/التشوه. بالنسبة لبعض المستقبلات اليه ، فان استشعار هذه الاضطرابات الميكانيكية واضح لوظيفة أنواع الخلايا التي يتم التعبير عنها. تاخذ ، علي سبيل المثال ، مستقبلات تمتد في الخلايا العصبية مستقبلات البارونات. هذه القناات أيون الميكانيكية تنظيم ضغط الدم عن طريق استشعار الاوعيه الدموية "تمتد"1,2. في الاذن الداخلية ، وقناات أيون علي خلايا الشعر الكشف عن تشوات الميكانيكية الناجمة عن الموجات الصوتية3، والجلدية عتبه منخفضه الميكانيكية المستقبلات (ltmrs) تسهيل نقل المعلومات عن طريق اللمس4. وفي حالات أخرى ، توفر المستقبلات الميكانيكية معلومات هامه للخلية لإنشاء التصاق أو النمو. خلايا يستطيع تحسست الصلابة من بيئتهم محليه, ويمكن اعتمدت علي مقلص قوات عن طريق ال [اكتيتن] [سيتوكلتون] وتكامل ان يملي نمو أو [سبردينغ]5,6.

عند دراسة مستقبلات-يجند التفاعلات في النماذج القائمة علي الخلايا أو الانسجه ، توجد اختبارات المشتركة التي يمكن الإبلاغ بسرعة ودقه اثار تغيير درجه الحرارة ، والحموضة ، والتركيز ، والنغمات ، والقدرة علي الغشاء ، والعديد من المعلمات الأخرى والتي يمكن ان تختلف في الجسم المجري. ومع ذلك ، فان هذه المقايسات نفسها قد تكون قصيرة عندما يتعلق الأمر بالكشف عن مساهمه القوه الميكانيكية لتنشيط مستقبلات. ما إذا كانت الخلايا الاستشعار عن البيئة الدقيقة ، والكشف عن الموجات الصوتية ، أو الاستجابة لتمتد ، شيء واحد المستقبلات الميكانيكية المذكورة أعلاه مشتركه هو انهم يشاركون في التفاعلات حيث الligand ، مستقبلات ، أو كليهما ، ترتكز علي السطح. وغالبا ما تعكس المقايسات المطورة لاختبار اثار القوي الميكانيكية علي تفاعلات المستقبلات هذا النموذج. وتستخدم ميكروفلويديكس وتدفق الغرف لدراسة اثار تدفق القص علي الخلايا والمستقبلات7,8. وتتمتع هذه الأنواع من التجارب بميزه السماح بضبط معدلات القص عن طريق سرعات التدفق الثابتة. وتستخدم التقنيات الأخرى المسبارات الجزيئية الفلورية للكشف عن القوات التي تطبقها الخلايا علي الأسطح الغنية بالحروف ، مما ينتج عنه قراءات دقيقه لحجم وتوجات القوات المشاركة في التفاعل9و10.

بالاضافه إلى الميكانيكية التي تحدث حيث يتم ربط واحد أو كلا الشريكين إلى السطح ، والإجهاد القص قد تؤثر علي البروتينات والخلايا في الحل. وغالبا ما يلاحظ هذا في خلايا الدم/البروتينات التي هي باستمرار في الدورة الدموية ، ويمكن ان تظهر عن طريق تفعيل المستقبلات الميكانيكية التي هي عاده سطح الراسية11، أو من خلال التعرض للتسلسل الهدف الذي سيكون مسدود تحت شروط ثابته12. ومع ذلك ، اقل نسبيا تقنيات فحص اثار قوه القص علي الجزيئات في الحل. بعض النهج في الحل إدخال القص عن طريق الخلايا الفورتكينغ في تعليق السوائل بسرعات ومدد متفاوتة ، علي الرغم من ان هذه النهج قد لا تسمح بتحديد دقيق جدا من الإجهاد القص المتولدة. يقيس اللزوجة التناوب بتطبيق قوه قص محدده علي السوائل. هنا نقوم بوصف طريقه تطبيقية لتحديد تاثير معدلات القص الرقائقي محدده علي الخلايا أو شظايا الخلية في الحل.

واحد من البروتينات الأكثر تعبيرا علي سطح الصفائح الدموية هو بروتين سكري (GP) مجمع Ib-IX. GPIb-التاسع هو مستقبلات الاساسيه للبروتين البلازما فون Willebrand عامل (VWF). معا, وقد تم منذ فتره طويلة المعترف بها هذا الزوج ومستقبلات كاساس للاستجابة الصفائح الدموية للضغط القص13. في حاله تلف الاوعيه الدموية ، VWF يربط لكشف الكولاجين في مصفوفة البطانة الفرعية14، التالي تجنيد الصفائح الدموية إلى موقع الاصابه عن طريق التفاعل Vwf-GPIb-IX. VWF الاشتباك إلى موقعها ملزمه في الوحدة الفرعية GPIbα إذا GPIb-التاسع تحت الإجهاد القص الفسيولوجية يدفع تتكشف من المجال الميكانيكي القريب الغشاء (MSD) الذي بدوره ينشط GPIb-التاسع15. في دراسة حديثه, وقد أظهرنا ان الأجسام المضادة ضد GPIbα, مثل تلك التي ولدت في العديد من المرضي الصفيحات المناعية (آيب), هي أيضا قادره علي حمل الصفائح الدموية إشارات عبر MSD تتكشف تحت الضغط القص11. ومع ذلك ، علي عكس VWF ، والتي تسهل القص الناجمة عن GPIb-التاسع التنشيط عن طريق التعبئة المعقدة تحت الدورة الدموية العادية ، والأجسام المضادة التكافؤ قادره علي عبور الصفائح الدموية عبر GPIb-التاسع وتتكشف MSD في الدورة الدموية. وبهذه الطريقة ، يمكن تنشيط مستقبلات ميكانيكيه التي يتم تنشيطها عاده عن طريق التجميد السطحي تحت القص في الحل. وفي هذا التقرير ، سنبين كيف تمت الاستفادة من فحص القص الموحد القائم علي الرؤية للكشف عن اثار مستويات معينه من إجهاد القص علي تنشيط المستقبلات في الحل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة علي جميع الطرق التي تستخدم الصفائح الدموية المستمدة من المتبرعين الموصوفة هنا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لجامعه أموري/الرعاية الصحية للأطفال في أتلانتا.

1. سحب الدم وعزل الصفائح الدموية

  1. رسم الدم البشري من المتبرعين الكبار صحية بالتراضي عن طريق بزل في يوم التجربة إلى 3.8 ٪ سيترات الصوديوم. أنبوب واحد 4.5 mL من الدم يكفي لإنتاج ما يكفي من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) لظروف 20-25 في الجهات المانحة التي تهم الصفائح الدموية قريبه من 250 x 103 لكل μl.
    ملاحظه: تجنب رسم الدم عن طريق الابر مقياس ضيق (أصغر من 21 G).
  2. اعداد PRP عن طريق طرد في 22 درجه مئوية و 140 x g لمده 12 دقيقه مع الفرامل الطويلة. وهذا سوف يؤدي إلى طبقتين متميزتين ، مع خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي والضوء PRP الملونة في الجزء العلوي.
  3. عزل الطبقة العلوية والغائمة والصفراء من PRP عن طريق التعبئة الدقيقة من خلال طرف ماصه مقطع بزاوية 45 درجه والحصول علي عدد الصفائح الدموية عن طريق عدد الدم الكامل (CBC).
  4. إذا لزم الأمر ، وغسل الصفائح الدموية في أنابيب المالحة المخزنة (150 mM كلوريد الصوديوم ، أنابيب 20 ملم) في وجود بروستانانفي E1 (PGE1) وأعاده التعليق في العازلة تيرودي (134 mM كلوريد الصوديوم ، 0.34 mM Na2hpo4، 2.9 mm Kcl ، 1 مم mgcl2، 5 مم الجلوكوز ، 12 مم 3، 20 مم Hepes ، pH 7.35) مع الجلوكوز 5 ملم ، والا ، انتقل إلى الخطوة 1.5. تصف الخطوات التالية الغسل باختصار.
    1. ضبط حجم PRP إلى 10 مل مع أنابيب المالحة مخزنه وأضافه 0.6 μM PGE1.
    2. الطرد المركزي لمده 8 دقائق في 1,900 x g، ثم تجاهل ماده طافي والسماح بيليه الصفائح الدموية الجلوس في 400 μl من محلول تيرودي والجلوكوز لمده 5 دقائق.
    3. أعاده التعليق برفق بيليه الصفائح الدموية والحفاظ عليه دون عائق لمده 30 دقيقه.
  5. ضبط عدد الصفائح الدموية إلى ~ 250 × 103 الصفائح الدموية لكل μl مع البلازما الفقراء الصفيحات البشرية المجمعة (PPP) والحفاظ علي تعليق عند 22 درجه مئوية دون عائق أو تحت دوران لطيف.

2. ligand العلاج القص موحده

ملاحظه: يجب القيام بكل الخطوات في القسم 2 التي تتطلب التنضيد ببطء ، حتى لا لإدخال اي القص.

  1. أضف الأجسام المضادة أو الاربطه المطلوبة إلى PRP أو الصفائح الدموية المغسولة واخلطها برفق عن طريق التحريك للأعلى والأسفل أو التقليب بطرف ماصه. اتركه دون عائق في درجه حرارة الغرفة لمده 5-10 دقيقه. أضافه وحده تخزين مكافئه من PPP أو المخزن المؤقت تيرودي إلى عنصر تحكم سالب.
  2. قم بتشغيل لوحه العدادات المخروطية ، اضبط درجه حرارة اللوحة إلى 22 درجه مئوية واترك الوقت للسماح للوحه بالوصول إلى درجه الحرارة هذه.
  3. الماصة المعالجة بالبلازما أو الصفائح الدموية المغسولة علي لوحه العدادات المخروطية التي يتم التحكم في درجه حرارتها مباشره في مركز الصفيحة. تاكد من ان يتم إيداع جميع العينات بين المخروط ولوحه في نقطه الاتصال ، وليس علي الخارج من حافه المخروط.
  4. قص بسعر مناسب ومده مناسبه.
    1. حساب القص كما هو مبين من قبل دليل لزوجه ، أو كما هو مبين سابقا15،16.
    2. تحديد معدل القص من اللزوجة والإجهاد القص المطلوب عن طريق قانون نيوتن من اللزوجة. Equation 1; البلازما اللزوجة هو 1.5-1.6 مئوية الاتزان (cP)17. علي سبيل المثال ، نطاق القص العادي للتداول البشري هو 5-30 داين/سم2 وينبغي تطبيق القص علي مقياس الوقت دقيقه واحده الرقم.
  5. رفع مخروط الخروج من لوحه سلايلتي (~ 2 مم) بحيث تبقي العينة في اتصال مع كل لوحه ومخروط ، واستخدام هلام التحميل أو غيرها من طرف ماصه طويلة لجمع 5-10 μl من مركز حجم العينة.
  6. احتضان عينات منفصم مع علامات المطلوب لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. لعلامات فوسفاتيديلسيسيرين ، β-galactose ، و P-سيلكتين التعرض استخدام لاكتاديرين C2 المجال (LactC2) في 0.08 μM18، اريثرينا cristagalli يكتين (ecl) في 6.25 ميكروغرام/مل ، ومكافحه-P-سيلكتين الأجسام المضادة (20 ميكروغرام/مل) ، علي التوالي.
  7. إصلاح العينات في 2 ٪ بارافورمالدهيد لمده 20 دقيقه في RT قبل التخفيف أو التخزين البارد ، والمضي قدما إلى الخطوة 3.1 أو تخزين عينات في 4 درجه مئوية لمده لا تزيد عن 12 ساعة.

3. الكشف عن علامات السطح والربط عبر التدفق الخلوي

  1. تحليل العينة عن طريق التدفق الخلوي ، وجمع ما لا يقل عن 20,000 الاحداث لكل شرط.
  2. قوه اشاره الكمية من علامات الفلورسنت باستخدام قيمه الارتفاع لكثافة كل فلوكوفيري ، أو متوسطه الكثافة الهندسية الفلورية (مؤسسه مونتانيار).
  3. إذا تهدف إلى الكشف عن الصفائح الدموية المتقاطعة التالية العلاج القص ، وتحليل العينة علي التصوير-قادره علي تدفق المضخم والربط بالكميات المتداخلة حسب المنطقة ونسبه الجانب المعلمات.
    1. ارسم رسما بيانيا للمنطقة و/أو نسبه العرض إلى الارتفاع.
    2. استخدام السيطرة السلبية مع الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسني) أو السيارة لرسم بوابه باستثناء معظم الاحداث الدائرية بشكل كامل (وعاده ما يتم رسم هذه البوابة في نسبه العرض إلى الارتفاع ~ 0.819،20) وقيمه النسبة المئوية للاحداث داخل هذه البوابة. ومن المرجح ان تكون الاحداث ذات النسبة المنخفضة من الارتفاع أكثر ارتباطا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يوضح الشكل 1 كيف يمكن للنموذج المشغل لتنشيط GPIb-IX ، الذي تم إدخاله في البداية لشرح تنشيط المستقبلات التي تعتمد علي القص عند الارتكاز علي جدار الوعاء ، ان يدعم أيضا تنشيط الصفائح الدموية التي يتم ربطها بواسطة الاربطه متعددة التكافؤ. ويبين الشكل 2 عمليات القراءة لتنشيط الصفائح الدموية البشرية التي يعالجها جهازان من الأجسام المضادة التي تستهدف مجال N-Terminal من gpib-IX (6B4 و 11A8) ، والأجسام المضادة للتحكم (المفتش العادي) تحت ظروف الشبع والثابتة. في الشكل 3، تم التعامل مع الصفائح الدموية مع 6b4 والأجسام المضادة مع قوه غير ملزمه منخفضه جدا لتحريك GPIb-التاسع التنشيط ، AK2. ويبين الشكل 4 دوره زمنيه. تم سبر علامات تنشيط الصفائح الدموية والكشف عنها في نقاط زمنيه تقدميه اثناء العلاج بالقص مع 11A8 أو AK2. في الشكل 5ا، تم التخفيف من الأجسام المضادة التي تربط الخرز بحجم الصفائح الدموية والمزينة بنطاق N-المحطة الطرفية GPIB-IX عبر قياس التدفق الخلوي التقليدي. الشكل 5 يظهر b الربط المتداخل بين الصفائح الدموية بوساطة 6b4 من خلال التصوير الخلوي لتدفق الصور. في الشكل 6، استخدمت عينات سريريه من المصل من المرضي الذين يعانون من قله الصفيحات المناعية بدلا من الأجسام المضادة أحاديه التكافؤ ضد GPIb-IX المستخدمة في الأرقام السابقة. أثارت الأجسام المضادة التي تحتوي علي البلازما ضد GPIb-IX استجابات تعتمد علي القص ، علي النقيض من البلازما من المرضي الذين ليس لديهم أجسام مضاده تستهدف GPIb-IX.

Figure 1
الشكل 1 : الصفائح الدموية الميكانيكية سطح الصفيحات GPIb-التاسع يمكن ربط القابلة للذوبان الرابطة الثنائية التكافؤ (مثل الأجسام المضادة). عندما يرتبط اثنين من المجمعات gpib-IX علي الصفائح الدموية المتعارضة إلى نفس الربط ثنائي التكافؤ ، يحدث تشابك. تحت القص الفسيولوجية ، يمكن ان تولد الصفائح الدموية المترابطة قوه سحب للعمل علي GPIb-التاسع وتتكشف MSD فيها. نتيجة لتتكشف MSD ، يتم تنشيط GPIb-التاسع ، ويدفع الصفائح الدموية الإشارات وأزاله الصفائح الدموية المصب ، كما هو موضح. تم تكييف الشكل من Quach et al.21الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 : التعبير عن علامات تنشيط الصفائح الدموية في الإنسان PRP التعامل مع مفتش السيطرة أو المضادة-gpib التاسع الأضداد 11a8 و 6b4 تحت الثابتة أو منفصم (30 داين/سم2) الظروف. في هذه النتائج التمثيلية, التعرض سطح الصفائح الدموية من فوسفاتيديلسيرين (PS), β-Galactose, و P-سيلكتين وبحثت من قبل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)-مترافق Lact-C2, FITC-مترافق اريثرينا cristagalli لكتين (ECL) و APC-مترافق المضادة--ف-سيلكتين الجسم ، علي التوالي. تم الكشف عن الفلوري عن طريق تدفق الخلوي. يتم التعبير عن البيانات كنسبه مئوية من الاحداث مع الفلوري فوق السيطرة السلبية. p ≤ 0.001 ، * * * * p ≤ 0.0001 ؛ تحديد اهميه عن طريق اختبار tالطالب. تمثل أشرطه الخطا الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 : الإنسان PRP التعامل مع اثنين من الأجسام المضادة-GPIb-التاسع. الإنسان المعالج بالبلازما مع اثنين من الأجسام المضادة GPIb-IX ، واحد مع قوه غير ملزمه عاليه (6B4) واحد مع انخفاض قوه غير ملزمه (AK2) تحت ساكنه (0 داين/سم2) ، وانخفاض القص (5 داين/سم2) ، وارتفاع القص (30 داين/سم2) الظروف. تظهر الرسوم البيانية النسبة المئوية للاحداث الايجابيه للتعبير السطحي من β-غالاكتوز ، PS ، و P-سيلكتين. * p ≤ 0.05 ، * * * p ≤ 0.001. تم تحديد اهميه عن طريق ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار Tukey. تمثل أشرطه الخطا SD. وقد تم تكييف الشكل من Quach et al.11الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 الدورة الزمنيه للتعرض للقص (20 داين/سم2) لعلاج PRP البشرية مع مفتش التحكم ، 11a8 ، أو AK2. تم الكشف عن التعرض سطح الصفائح الدموية من PS و P-سيلكتين عن طريق تدفق الخلوية للعينات التي تم العثور عليها ل 0, 0.5, 1, 3, و 5 دقيقه. * * * p ≤ 0.001, * * * * p ≤ 0.0001. تم تحديد اهميه عن طريق ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار Tukey. تمثل أشرطه الخطا SD. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 : الربط بالقيمة المتقاطعة حسب المنطقة ومعلمات نسبه الارتفاع. (ا) كانت الصفائح الدموية الحجم (4 μm) الخرز مترافق مع المجال N-الطرفية من gpibα وحضن مع مفتش (الرمادي) ، AK2 (الأحمر) ، أو 6b4 (الأزرق) تحت منفصم (20 داين/سم2) الظروف. تظهر هنا المؤامرات كفاف من مبعثر إلى الامام (FSC-A) مقابل المضادة للماوس الجسم فلوري. (b) الرسم البياني لنسبه الجانب من الصفائح الدموية في حضن PRP مع 6B4 و فلوريسسينتلي المسمي المضادة لCD41 (علامة الصفائح الدموية) الأجسام المضادة تحت القص. يتم عرض الصور التمثيلية بنسب الابعاد المختلفة. تم تعديل الرقم من Quach et al.11الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 تم استخدام العينات السريرية من المصل من المرضي الذين يعانون من قله الصفيحات المناعية بدلا من الأجسام المضادة أحاديه التكافؤ ضد GPIb-IX. (ا) القدرة الملزمة gpib-IX من البلازما من المرضي الذين يعانون من متلازمة الشراكة الثانية ، والتي تمت بواسطة الانزيم المناعي (ELISA). (ب) غسل الصفائح الدموية البشرية التي أعيد تشكيلها في بلازما المريض الساكنة تحت ظروف ثابته ومغلفه (30 داين/سم2). تظهر الرسوم البيانية النسبة المئوية للاحداث الايجابيه للتعبير السطحي ل P-سيلكتين أو PS. * * * * p ≤ 0.0001. تم تحديد الاهميه عن طريق ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار Tukey. تمثل أشرطه الخطا SD. وقد تم تكييف الشكل من Quach et al.11الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يسمح البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة باجراء تقييم سريع ومتعدد الاستعمالات لتاثير القص الصفي علي مستقبلات الصفائح الدموية وسطح الخلية. وتبرز النتائج التمثيلية المحددة المقدمة هنا كيف يمكن ان تتاثر اثار اللزوجة الثنائية أو الثنائية التكافؤ بتدفق القص. بالاضافه إلى هذا التطبيق ، والفحص القص موحده لديها تطبيقات واسعه في مراقبه الآثار التي تعتمد علي القص. في حاله عدم وجود زوج من الاربطه والمستقبلات المعروفة ، يمكن لفحص القص الموحد أيضا الكشف عن تاثيرات القص علي عوامل مثل شكل الخلية والإشارات ، خاصه عند اقترانها بتحليلات التدفق الخلوي. وقد المح إلى ذلك جزئيا الشكل 5ب، فان الفحص الموحد للقص يفسح الطريق لطائفه واسعه من أساليب الكشف بخلاف أو تكمله التحاليل القياسية لقياس التدفق الخلوي المبينة في هذا البروتوكول ، بما في ذلك التصوير والكيمياء الحيوية والمستندة إلى الخلايا فحوصات.

ويجسد الشكل 2 التطبيق الأساسي لهذا الفحص ، وتحديدا للتمييز بين التفاعل المرتبط بالقص والمستقبل والسيطرة السلبية. 6B4 ، وهو الأجسام المضادة التي هي قادره علي عبور الصفائح الدموية عن طريق ربط مستقبلات GPIb-التاسع والحفاظ علي ما يكفي من القوه لتنشيط مستقبلات11، ينشط الصفائح الدموية عندما تتعرض للقص (يصور في النموذج في الشكل 1) ، علي عكس مفتش التحكم الذي لا يربط الصفائح الدموية GPIb-IX. يوفر هذا التطبيق في نفس الوقت دليلا علي ان التاثير محدد للمستقبلات المختارة-ligand الزوج ويعتمد علي القص. ويمكن لمقايسة القص الموحدة أيضا ان تميز بين اثار الليغانز التي يمكن ولا يمكنها الحفاظ علي روابطها بمستقبلات تحت مستويات قص محدده. في الشكل 3، ونحن نري نقصا في قراءات الإشارات من المضادة-GPIb-التاسع الأضداد AK2 ، الذي يربط مربه لها مع قوه غير ملزمه بشكل خاص ضعيفه11. ويوضح هذا الرقم أيضا الآثار المترتبة علي اختلاف مستوي الإجهاد القص التي تطبقها اللوحة المخروطية من القص منخفضه إلى عاليه.

ويبين الشكل 4 ان هذا الفحص يمكن استخدامه لتعديل طول التعرض للقص ويقترح استراتيجية لعرض هذه البيانات. في الشكل 5، يتم استخدام اثنين من البديل التدفق الخلوي القائم علي القراءة لمقايسة ، وكلاهما لا تعتمد علي علامات الفلورسنت من تنشيط مستقبلات ولكن بدلا من ذلك يمكن استخدامها لوصف الربط المتقاطع وتغيير حجم/الشكل. الشكل 5 يظهر b كيف يمكن ان يميز التشتت الامامي ، الذي يزيد متناسبا مع حجم الحدث ، بين المجموعات المتميزة من المجموعات غير المرتبطة (المفردة) أو الثلاثية أو الثلاثية أو الاحداث المتداخلة المضاعفة. كما هو الحال في الشكل 5ب، يمكن تطبيق الفحص علي الخرز مترافق إلى مستقبلات الفائدة ، والذي يلغي امكانيه المستقبلات الأخرى المشاركة في الاحداث المتقاطعة التي ينظر اليها عبر طرق أخرى. في الشكل 6، والبلازما ، ويستخدم السائل البيولوجي الذي يحتوي علي يغاندس المحتملة لمستقبلاتنا من الفائدة بدلا من الأجسام المضادة الاحاديه المنقية. وهذا يوضح التطبيق الذي قد لا يكون من الضروري وجود شريك محدد أو ربط معروف لمستقبلات الفائدة.

علي الرغم من ان الفحص هو الوصول إلى حد ما كما هو مكتوب ، وهناك عدد قليل من الخطوات الرئيسية التي ينبغي ان يؤديها مع الرعاية. ومن أهم هذه الأمور الحرص علي عدم إدخال القص من مصادر خارجيه غير المعالجة الفعلية للقص نفسها. عند رسم الدم ، كما ذكر في الخطوة 1.1 من هذا البروتوكول ، من المهم لرسمه من خلال الابر قياس السليم. لجمع الدم البشري عبر venipture من المتبرعين الكبار بالتراضي ، وهذا يمكن ان يتحقق مع مجموعه جمع الدم 21 G (المدرجة في جدول المواد). مره واحده يتم رسم الدم ويتم عزل PRP ، فانه يمكن تخزينها في درجه حرارة الغرفة لمده تصل إلى 6 ساعة علي مقاعد البدلاء أو علي الشواية بطيئه.

إذا كان جهاز الطرد المركزي المستخدمة لعزل PRP يمكن الفرامل بسرعات مختلفه فمن الأفضل لاختيار الفرامل بطيئه وذلك للحد من اضطراب طبقه PRP وتطبيق القوه لا لزوم لها. مره واحده يتم عزل PRP أو نوع الخلية من الفائدة في تعليق السوائل ، وتجنب الأنابيب المخلوطة بسرعة جدا. بدلا من ذلك ، يستنشق ويطرد عينات بطريقه بطيئه وثابته وخاصه خلال الخطوة 2.5 ، حيث يتم رسم العينة من خلال غيض ماصه ضيقه بشكل خاص. لوحدات التخزين العينة التي يمكن بدقه ان تكون الأنابيب عن طريق نصائح ماصه من احجام مختلفه ، فانه من المستحسن استخدام أكبر من بينها. النسبة للعينات الحساسة أو اللزجة بشكل خاص ، يمكن قطع نهاية طرف الماصة بزاوية لتوسيع الفتحة التي يتم من خلالها رسم العينة.

العديد من الاختبارات التي تختبر تاثير القص علي الميكانيكية الخلوية تعتمد علي التفاعل بين الربط الراسي ومستقبلاته. ميكروفلويديكس وتدفق الدوائر هي واحده مثل هذا المثال ، حيث يمكن ملاحظه التفاعل بين الربط الراسي ومستقبلات ، وعاده علي خليه في الحل ، في الوقت الحقيقي7،8. تستخدم تقنيات أخرى المجهر للكشف عن الاحداث التي تحدث في الواجهة بين طبقه الخلية والركيزة الاساسيه أو المسبار9. وقد استخدمت هذه التقنيات لتاثير كبير بشكل خاص في دراسة خلايا الدم في الدورة الدموية. ومن ناحية أخرى ، فان التقنيات التي تسمح بالتحقيق في الاحداث التي تحدث بالبالكامل في الحل تحت التدفق محدوده أكثر. النسبة للتطبيق العام للقوه في الحل ، فان الأخذ بعينه قد يكون بمثابه طريقه "سريعة وقذره". ومع ذلك ، فانه من الصعب تحديد القوه الدقيقة المطبقة ، والقص ليس من المؤكد ان ينتج عن تدفق الصفار. هذا هو واحد من مزايا الفحص القص موحده. من ناحية أخرى ، فان العيب الأساسي لفحص القص الموحد هو فجوه زمنيه بين القص التطبيق ومراقبه الخلايا نفسها. يتم تطبيق القص ، ثم الخلايا ملطخه وثابته ، ولكن تقنيات التصوير لا يمكن مراقبه الخلايا اثناء عمليه القص نفسها. واحده تكييف من هذا أسلوب سيتضمن يضيف الخلايا مباشره إلى العلامات مرغوبة ويقص مع العلامات حاضره. وهذا من شانه ان يسمح بالكشف الفوري عن اي اثار عابره.

وقد قمنا حتى الآن بتطبيق هذا الفحص للكشف عن تاثير الأجسام المضادة الذي يعتمد علي القص والذي يستهدف مجمع GPIb-IX. في حين ان الأجسام المضادة توفر شريكا مريحا وبسيطا وثنائي التكافؤ ، فمن المنطقي ان نفترض انه يمكن إنجاز الربط المتقاطع للمستقبلات اليه علي الخلايا المتعارضة في الدورة الدموية عبر العديد من الروابط المتعددة التكافؤ مع عدم الربط العالي بما فيه الكفاية القوات. قد تكون هذه التقنية مفيده في المستقبل في الكشف عن الآثار المحددة لمثل هذه الحشرات. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام فحص القص الموحد بالاقتران مع تقنيات التصوير غير الموصوفة هنا مثل المجهر القياسي الفلوري. وفي نهاية المطاف ، يوفر فحص القص الموحد طريقه رخيصه وكميه ومحدده بشكل معقول لتطبيق القص الرقائقي علي الخلايا وشظايا الخلايا في الحل ، ويمكن استخدامه في المراحل التمهيدية للعديد من طرق الكشف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم العمل المتعلق بهذه الدراسة جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة والقلب والرئة ومعهد الدم منح HL082808 ، HL123984 (ار ال) ، و F31HL134241 (M.E.Q.). التمويل المقدم أيضا من المعهد الوطني للصحة القومية للعلوم الطبية العامة منحه T32GM008367 (M.E.Q.) ؛ وصناديق المنح التجريبية من الرعاية الصحية للأطفال من أتلانتا وأموري جامعه تدفق الأطفال الخلوية الاساسيه. ويود المؤلفون ان يشكروا الدكتور هانز ديميون لمشاركتهم الأجسام المضادة 6B4 ، ومركز بحوث الأطفال الخاص بالطفل الذي يقوم بالتدفق الخلوي الأساسي للدعم التقني.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
فحص القص الموحد للصفيحات البشرية ومستقبلات سطح الخلية عبر اللوحة المخروطية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter