Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En ensartet Forskydningsanalyse for humant trombocyttal og celleoverflade receptorer via kegle-plade Viscometry

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

Vi beskriver en in-Solution metode til at anvende ensartet forskydning til blodplade overflade receptorer ved hjælp af kegle-plade viscometri. Denne metode kan også bruges mere bredt til at anvende shear til andre celletyper og celle-fragmenter og behøver ikke at målrette en specifik ligand-receptor par.

Abstract

Mange biologiske celler/væv fornemmer de mekaniske egenskaber i deres lokale miljøer via mekanisoreceptorer, proteiner, der kan reagere på kræfter som tryk eller mekaniske forstyrrelser. Mechanoreceptors opdager deres stimuli og sender signaler via en stor mangfoldighed af mekanismer. Nogle af de mest almindelige roller for mechanoreceptors er i neuronal svar, som touch og smerte, eller hårceller, der fungerer i balance og hørelse. Mechanosensation er også vigtigt for celletyper, der jævnligt udsættes for forskydnings stress såsom endotelceller, hvilke linje blodkar eller blodlegemer, der oplever forskydning i normal cirkulation. Viscometers er enheder, der detekterer viskositeten af væsker. Rotational viskosimetre kan også anvendes til at anvende en kendt forskydningskraft på væsker. Evnen af disse instrumenter til at indføre en ensartet forskydning til væsker er blevet udnyttet til at studere mange biologiske væsker, herunder blod og plasma. Viscometry kan også anvendes til at anvende shear til cellerne i en opløsning, og til at teste virkningerne af shear på specifikke ligand-receptor-par. Her udnytter vi kegle-plade viskometri til at teste virkningerne af endogene niveauer af forskydnings stress på blodplader behandlet med antistoffer mod trombocytsensorisk receptor kompleks gpib-IX.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mechanoreceptors er proteiner, der reagerer på mekaniske stimuli, såsom tryk eller mekanisk perturbation/deformation. For nogle mechanoreceptorer, sensing disse mekaniske forstyrrelser er eksplicit til funktionen af de celletyper, som de er udtrykt. Tag for eksempel de stræk receptorer i baroreceptor neuroner; disse mekanisofølsomme Ionkanaler regulerer blodtrykket ved at registrere vaskulær "stretch"1,2. I det indre øre, ionkanaler på hårceller detekterer mekaniske deformationer forårsaget af lydbølger3, og kutane lav tærskel mekanisoreceptorer (ltmrs) lette overførslen af taktile information4. I andre tilfælde, mekanioreceptors give vigtige oplysninger til cellen for etablering af vedhæftning eller vækst. Celler kan fornemme stivheden i deres lokale miljø, og kan stole på kontraktile kræfter via actin cytoskelet og integrins at diktere vækst eller sprede6,5.

Når man studerer receptor-ligand interaktioner i celle-eller vævsbaserede modeller, findes der fælles analyser, som hurtigt og præcist kan rapportere virkningerne af at ændre temperatur, ph, ligand koncentration, tonicitet, membran potentiale, og mange andre parametre der kan variere in vivo. Men, disse samme analyser kan falde kort, når det kommer til at afsløre bidrag af mekanisk kraft til receptor aktivering. Uanset om cellerne registrerer deres mikromiljø, detekterer lydbølger eller reagerer på stretch, er en ting, som førnævnte mekanisoreceptorer har til fælles, at de deltager i interaktioner, hvor ligand, receptoren eller begge er forankret til en Overflade. Assays udviklet til at teste virkningerne af mekaniske kræfter på receptor interaktioner ofte afspejler dette paradigme. Mikrofluidics og flow kamre bruges til at studere virkningerne af forskydnings strøm på celler og receptorer7,8. Disse typer af eksperimenter har den fordel at tillade finjustering af forskydnings hastigheder via etablerede strømningshastigheder. Andre teknikker anvender fluorescerende molekylære sonder til at detektere kræfter, der påføres af celler på ligand-rige overflader, hvilket giver en nøjagtig aflæsning af omfanget og orienteringen af kræfter, der er involveret i interaktionen9,10.

Ud over mekanisk sensation, hvor den ene eller begge parter er forankret til en overflade, kan forskydnings stress påvirke proteiner og celler i opløsning. Dette observeres ofte i blodceller/proteiner, der konstant er i omløb, og kan manifestere sig via aktivering af mekanisoreceptorer, der normalt er overflade forankrede11, eller ved eksponering af målsekvenser, som ville blive tilstoppet under statiske forhold12. Men relativt færre teknikker assay virkningerne af forskydningskraft på partikler i opløsning. Nogle in-Solution tilgange introducere shear via vortexning celler i flydende suspension med varierende hastigheder og varighed, selv om disse tilgange kan ikke tillade en meget præcis bestemmelse af forskydningen stress genereret. Roterende viskosimetre måler viskositet ved at anvende en specifik forskydningskraft på væsker. Heri beskriver vi en anvendt metode til bestemmelse af effekten af specifikke laminar forskydnings rater på celler eller celle fragmenter i opløsning.

Et af de mest højt udtrykte proteiner på trombocytoverfladen er glykoprotein (GP) Ib-IX-komplekset. GPIb-IX er den primære receptor for plasmaprotein von Willebrand Factor (VWF). Sammen, denne receptor-ligand par har længe været anerkendt som grundlaget for trombocyttal respons til shear stress13. I tilfælde af vaskulære skader binder VWF sig til eksponeret kollagen i sub-Endothelial matrix14, hvorved der rekrutteres blodplader til skadestedet via vWF-GPIb-IX-interaktionen. VWF engagement i dets bindingssted i GPIbα-under enheden, hvis GPIb-IX under fysiologisk forskydnings stress inducerer udtrækning af et membran-proximalt mechanosensoriske domæne (MSD), som igen aktiverer GPIb-IX15. I en nylig undersøgelse har vi vist, at antistoffer mod GPIbα, som dem, der dannes hos mange patienter med immun trombocytopeni (ITP), også kan inducere trombocytsignalering via MSD, der udfolder sig under forskydnings stress11. I modsætning til VWF, som letter aktivering af forskydnings induceret GPIb-IX ved at immobilisere komplekset under normal cirkulation, er de bivalente antistoffer i stand til at kryds forbinde trombocytterne via GPIb-IX og udfolde MSD i omløb. På denne måde kan en mekanisoreceptor, som normalt aktiveres ved overflade immobilisering under forskydning, aktiveres i opløsningen. I denne rapport, vil vi demonstrere, hvordan en viscometer-baseret ensartet forskydningsanalyse blev gearede til at påvise virkningerne af specifikke niveauer af forskydnings stress på receptor aktivering i opløsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder ved hjælp af donor-afledte humane trombocytter beskrevet heri blev godkendt af den institutionelle Review Board of Emory University/children's Healthcare i Atlanta.

1. blod trækning og Trombocytisolation

  1. Tegn humant blod fra samtykkende raske voksne donorer via venepunktur på dagen for eksperimentet til 3,8% trinatrium citrat. En 4,5 mL blod slange er tilstrækkelig til at give tilstrækkelig trombocytrig plasma (PRP) til 20-25 forhold hos donorer, hvis trombocyttal er tæt på 250 x 103 pr. μl.
    Bemærk: undgå at trække blod via smalle måle nåle (mindre end 21 G).
  2. Forbered PRP via centrifugering ved 22 °C og 140 x g i 12 min med lang bremse. Dette vil resultere i to forskellige lag, med røde blodlegemer i bunden og den lyse farvede PRP i toppen.
  3. Isoler det øverste, overskyede, gule lag af PRP via omhyggelig pipettering gennem en pipettespids skåret i en 45 ° vinkel og få trombocyttallet via et komplet blodtælling (CBC).
  4. Hvis det er nødvendigt, skal der vaskes blodplader i rør-buffer salt (150 mM NaCl, 20 mM PIPES) ved tilstedeværelse af prostaglandin E1 (PGE1) og gensuspenderes i Tyrode buffer (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCl, 1 mM mgcl2,5mm glucose, 12 mm NaHCO 3, 20 mm Hepes, pH 7,35) med 5 mm glucose, ellers fortsættes til trin 1,5. De følgende trin beskriver vask i korte træk.
    1. Justér PRP-volumen til 10 mL med PIPES-Buffered saltvand og tilsæt 0,6 μM PGE1.
    2. Der centrifugeres i 8 min ved 1.900 x g, hvorefter supernatanten kasseres, og trombocytpillen sættes i 400 ΜL af tyrode og glucoseopløsning i 5 minutter.
    3. Resuspender forsigtigt trombocytpellet og hold den uforstyrret i 30 minutter.
  5. Trombocyttallet justeres til ~ 250 x 103 blodplader pr. μl med samlet humant trombocyttal-fattigt plasma (PPP), og suspensionen opretholdes ved 22 °c uforstyrret eller under forsigtig rotation.

2. ligand og ensartet forskydnings behandling

Bemærk: alle trin i afsnit 2, der kræver pipettering bør ske langsomt, for ikke at indføre nogen forskydning.

  1. Tilsæt det ønskede antistof eller ligand til PRP eller vaskede blodplader, og bland forsigtigt ved at pipettere op og ned eller omrøring med en pipettespids. Lad det uforstyrret ved stuetemperatur i 5-10 min. Tilføj en tilsvarende volumen af PPP eller Tyrode buffer til en negativ kontrol.
  2. Tænd for kegle pladens viscometer, Indstil plade temperaturen til 22 °C og lad pladen nå denne temperatur.
  3. Afpipettér de behandlede PrP eller vaskede blodplader på den temperaturstyrede kegle-viskometer direkte i midten af pladen. Sørg for, at hele prøven deponeres mellem keglen og pladen på kontaktpunktet og ikke på ydersiden af keglens rand.
  4. Vrid med en passende hastighed og varighed.
    1. Beregn shear som angivet med viskometer manualen, eller som tidligere vist15,16.
    2. Bestem forskydnings hastigheden fra viskositet og ønsket forskydnings spænding via Newtons viskositets lovgivning; Equation 1; plasma viskositet er 1,5-1,6 centipoise (cP)17. For eksempel, en normal forskydnings område for menneskelig cirkulation er 5-30 dyn/cm2 og shear bør anvendes på det enkelte ciffer minut tid skala.
  5. Løft keglen af pladen med en smule (~ 2 mm), så prøven forbliver i kontakt med både pladen og keglen, og brug en gel-loading eller en anden lang pipettespids til at samle 5-10 μL fra midten af prøvevolumenet.
  6. De skrumpede prøver inkupereres med de ønskede markører i 20 minutter ved stuetemperatur. For markører for phosphatidylserin, β-galactose, og P-selectin eksponering brug lactadherin C2 domæne (LactC2) på 0,08 μM18, Erythrina cristagalli lektin (ECL) på 6,25 μg/ml, og anti-P-selectin antistof (20 μg/ml), hhv.
  7. Prøverne fastsættes i 2% PARAFORMALDEHYD i 20 min ved RT før fortynding eller kold opbevaring, og der fortsættes til trin 3,1 eller opbevares prøver ved 4 °C i højst 12 timer.

3. påvisning af overflade markører og Cross Linking via flow cytometri

  1. Analysér prøven via flow cytometri, og indsamle mindst 20.000 hændelser for hver tilstand.
  2. Kvantitat signalstyrke af fluorescerende markører ved hjælp af højden værdi for intensiteten af hver fluorophore, eller den geometriske gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI).
  3. Hvis der sigtes mod at detektere trombocytcrosslinking efter forskydnings behandling, skal prøven analyseres på et billedbehandlings kompatibelt flow-flowcytometer og kvantitat tværbinding efter område og størrelsesforhold parametre.
    1. Afbilde et histogram af område og/eller størrelsesforhold.
    2. Brug en negativ kontrol med bovint serumalbumin (BSA) eller køretøj til at trække en port eksklusive mest fuldt cirkulære begivenheder (denne Gate er normalt tegnet i et formatforhold ~ 0,819,20) og kvantificere procentdelen af hændelser inde i denne Gate. Hændelser med et lavere billedformat er mere tilbøjelige til at være kryds forbundne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 skitserer, hvordan Trigger-modellen for aktivering af GPIb-IX, der oprindeligt blev introduceret for at forklare forskydnings afhængig receptor aktivering, når den forankres til fartøjs væggen, også kan understøtte aktivering af trombocytter, der krydses af et multivalente ligand. Figur 2 viser udlæsninger af human trombocytaktivering behandlet med to antistoffer rettet mod N-terminal domænet for GPIb-IX (6B4 og 11A8) og et kontrol-antistof (normal IgG) under klipning og statiske forhold. I figur 3blev trombocytterne behandlet med 6B4 og et antistof med en ikke bindende kraft for lavt til at udløse GPIb-IX-aktivering, ak2. Figur 4 viser et tidsforløb. Markører for trombocytaktivering blev undersøgt og detekteret ved progressive tidspunkter under forskydnings behandlingen med 11A8 eller AK2. I figur 5a, antistof tværbinding trombocytstørrelse perler dekoreret med gpib-IX N-terminal domæne blev analyseret via konventionelle flow cytometri. Figur 5 b viser 6B4-medieret Cross Linking af trombocytter som afbildes via billedbehandlings flow cytometri. I figur 6blev der anvendt kliniske prøver af serum fra patienter med immun trombocytopeni i stedet for de Divalente monoklonale antistoffer mod GPIb-IX, der blev anvendt i tidligere tal. Patient plasma-holdige antistoffer mod GPIb-IX udløste forskydnings afhængige reaktioner, i kontrast til plasma fra ITP-patienter uden antistoffer mod GPIb-IX.

Figure 1
Figur 1 : Trombocytoverfladens mekanisoreceptor GPIb-IX kan binde et opløseligt divalent ligand (f. eks. et antistof). Når to GPIb-IX-komplekser på modstående blodplader binder sig til det samme Divalente ligand, opstår kryds sammenkædning. Under fysiologisk forskydning kan de kryds forbundne trombocytter generere en trækkraft til at handle på GPIb-IX og udfolde MSD deri. Som følge af, at MSD udfolder sig, aktiveres GPIb-IX, og inducerer trombocytsignalering og downstream-trombocytclearance som illustreret. Figur blev tilpasset fra Quach et al.21venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Udtryk for markører for trombocytaktivering i humant PrP, der er behandlet med kontrol IgG eller anti-gpib-IX-antistoffer 11a8 og 6b4 under statiske eller vrides (30 dyn/cm2) betingelser. I disse repræsentative resultater blev trombocyttal på overfladen af Phosphatidylserin (PS), β-galactose og P-selectin probet med grønt fluorescerende protein (gfp)-konjugeret lact-C2, FITC-konjugeret Erythrina cristagalli lektin (ECL) og APC-konjugeret anti-P-selectin-antistoffer. Fluorescens blev detekteret via flow cytometri. Data udtrykkes i procent af hændelser med fluorescens over negativ kontrol. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; betydning, der bestemmes via elevens t-test. Fejllinjer repræsenterer standardafvigelse (SD). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Humant PRP behandlet med to anti-GPIb-IX-antistoffer. Human PRP behandlet med to anti-GPIb-IX antistoffer, en med høj uforbindende kraft (6B4) og en med lav uforbindende kraft (AK2) under statisk (0 dyn/cm2), lav forskydning (5 dyn/cm2), og høj forskydning (30 dyn/cm2) betingelser. Grafer viser procentdelen af hændelser, der er positive for overflade ekspression af β-galactose, PS og P-selectin. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. Signifikansen blev bestemt via en envejs-ANOVA med Tukey-test. Fejllinjer repræsenterer SD. figur er blevet tilpasset fra Quach et al.11venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Tidsforløb for forskydnings eksponering (20 dyn/cm2) for humant PrP, der er behandlet med kontrol IgG, 11a8 eller ak2. Trombocytaggregationen af PS og P-selectin blev detekteret via flow cytometri for prøver, der var skallert for 0, 0,5, 1, 3 og 5 min. * * * p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001. Signifikansen blev bestemt via en envejs-ANOVA med Tukey-test. Fejllinjer repræsenterer SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Kvantiterende Cross Linking efter område og højde-bredde-forhold parametre. (a) trombocytstørrelse (4 μm) perler blev konjugeret med N-terminal domæne af GPIbα og Inkuperet med IgG (grå), ak2 (rød), eller 6B4 (blå) under skaftet (20 dyn/cm2) betingelser. Vist her er kontur plots af Forward scatter (FSC-A) versus anti-muse antistof fluorescens. (b) histogrammet for størrelsesforholdet af trombocytter i PrP inkuperet med 6b4 og optælling mærket anti-CD41 (en trombocytmarkør) antistoffer under forskydning. Der vises repræsentative billeder i forskellige størrelsesforhold. Figur er blevet tilpasset fra Quach et al.11venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Kliniske prøver af serum fra patienter med immun trombocytopeni blev anvendt i stedet for de Divalente monoklonale antistoffer mod GPIb-IX. (a) gpib-IX bindende kapacitet af plasma fra patienter med ITP, analyseret via enzym-linked immunosorbent assay (ELISA). (b) vaskede humane blodplader rekonstitueret i ITP-patient plasma under statiske og vrides (30 dyn/cm2) betingelser. Grafer viser procentdelen af hændelser, der er positive for overflade ekspression af P-selectin eller PS. * * * * P ≤ 0,0001. Signifikansen blev bestemt via en-vejs-ANOVA med Tukey-test. Fejllinjer repræsenterer SD. figur er blevet tilpasset fra Quach et al.11venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript, giver mulighed for hurtig og alsidig vurdering af effekten af laminar forskydning på blodplade-og celleoverflade receptorer. De specifikke repræsentative resultater præsenteret her understreger, hvordan virkningerne af multimeriske eller bivalent ligander kan påvirkes af forskydnings strøm. Ud over denne applikation, en ensartet forskydningsanalyse har brede anvendelsesmuligheder i observation forskydnings afhængige effekter. I mangel af et kendt ligand-receptor pair, kan en ensartet forskydningsanalyse også detektere virkningerne af forskydningen på faktorer som celle form og signalering, især når parret med flow cytometriske analyser. En ensartet forskydningsanalyse, som delvis er omfattet af figur 5b, egner sig til en lang række andre detektionsmetoder end eller som supplement til standard flowcytometriske analyser, der er skitseret i denne protokol, herunder billeddiagnostik, biokemiske og cellebaserede Assays.

Figur 2 eksemplificerer den grundlæggende anvendelse af analysen, specielt til at skelne mellem en forskydnings afhængig ligand-receptor interaktion og en negativ kontrol. 6B4, et antistof, der er i stand til Cross Linking trombocytter via binding til GPIb-IX receptorer og opretholde tilstrækkelig kraft til at aktivere receptoren11, aktiverer blodplader når de udsættes for shear (afbildet i modellen i figur 1), i modsætning til kontrol IgG, som ikke binder trombocyttal-GPIb-IX. Denne applikation samtidig giver bevis for, at effekten er specifik for den valgte receptor-ligand par og er afhængig af shear. Den ensartede forskydningsanalyse kan også skelne mellem virkningerne af ligander, som kan og ikke kan opretholde deres obligationer til en receptor under specifikke forskydnings niveauer. I figur 3ser vi en mangel på signalering fra anti-GPIb-IX-antistof ak2, som binder indbegrebet med en særlig svag uforbindende kraft11. Dette tal viser også virkningerne af varierende niveauet af forskydnings stress påført af kegle-plade viskometer fra en lav til høj forskydning.

Figur 4 viser, at denne analyse kan anvendes til at graduere længden af forskydnings eksponeringen og foreslår en strategi for visning af disse data. I figur 5anvendes to alternative flow-cytometri baserede udlæsninger til analysen, som begge ikke er afhængige af fluorescerende markører for receptor aktivering, men i stedet kan bruges til at beskrive Cross linking og ændring af størrelse/form. Figur 5 b viser, hvordan Forward scatter, som stiger proportionalt med størrelsen af en begivenhed, kan skelne mellem forskellige populationer af ikke-sammenkædede (singlet), Doublet, triplet eller højere multiplet krydslinkede hændelser. Som i figur 5b, kan analysen anvendes på perler konjugeret til en receptor af interesse, som eliminerer muligheden for andre receptorer, der deltager i Cross Linking begivenheder set via andre metoder. I figur 6, plasma, en biologisk væske indeholdende potentielle ligander for vores receptor af interesse anvendes i stedet for renset monoklonale antistoffer. Dette illustrerer en applikation, hvor en specifik kendt ligand eller bindende partner for en receptor af interesse ikke kan være nødvendig.

Selv om analysen er temmelig tilgængelig som skrevet, der er et par vigtige trin, som skal udføres med omhu. Fremmest blandt disse er at være omhyggelig med ikke at indføre forskydning fra eksterne kilder, bortset fra selve forskydningen behandling selv. Når du tegner blod, som nævnt i trin 1,1 i denne protokol, er det vigtigt at trække det gennem korrekt gauge nåle. For humant blodindsamling via venepunktur fra samtykkende voksne donorer, dette kan opnås med en 21 G blod samling sæt (opført i tabellen af materialer). Når blodet er trukket, og PRP er isoleret, kan det opbevares ved stuetemperatur i op til 6 timer på bænken eller på en langsom Rotisserie.

Hvis den centrifuge, der bruges til at isolere PRP, kan bremse ved forskellige hastigheder, er det bedst at vælge en langsom bremse for at minimere forstyrrelsen af PRP-laget og anvendelsen af unødvendig kraft. Når PRP er isoleret, eller hvis celle typen er i væske suspension, skal du undgå at afpipette blandingerne for hurtigt. I stedet Aspirér og Udvis prøver på en langsom og stabil måde, især i trin 2,5, hvor prøven trækkes gennem en særlig smal pipettespids. For prøvevolumener, der præcist kan pipettes via pipettespidser i forskellige størrelser, tilrådes det at bruge den største blandt dem. For særligt følsomme eller viskøse prøver kan selve enden af pipettespidsen skæres i en vinkel for at udvide den åbning, hvorigennem prøven skal udtages.

Mange analyser, der tester effekten af shear på cellulære mekanisme stole på en interaktion mellem en forankret ligand og dens receptor. Microfluidics og flow Chambers er et sådant eksempel, hvor samspillet mellem en forankret ligand og en receptor, normalt på en celle i opløsning, kan observeres i realtid7,8. Andre teknikker bruger mikroskopi til at påvise hændelser, der indtræffer ved grænsefladen mellem et cellelag og det underliggende substrat eller sonde9. Disse teknikker har været anvendt til særlig stor effekt i studiet af blodlegemer i omløb. På den anden side er teknikker, der gør det muligt at forhør hændelser, der udelukkende forekommer i en løsning under gennemstrømning, mere begrænsede. For generisk anvendelse af kraft i opløsning, vortexning en prøve kan tjene som en "hurtig og beskidt" metode. Det er dog vanskeligt at bestemme den præcise kraft, og forskydningen er ikke sikker på at være resultatet af laminar flow. Dette er en af fordelene ved den ensartede forskydningsanalyse. På den anden side, den ensartede forskydnings assay primære ulempe er en tidsforskel mellem ansøgningen shear og observere cellerne selv. Shear anvendes, så cellerne er plettede og faste, men Imaging teknikker kan ikke observere cellerne under forskydningen selve. En tilpasning af denne metode ville indebære at tilføje cellerne direkte til de ønskede markører og klipning med markører til stede. Dette vil give mulighed for øjeblikkelig påvisning af eventuelle forbigående virkninger.

Hidtil har vi anvendt denne analyse til at detektere den forskydnings afhængige in-Solution effekt af antistoffer rettet mod GPIb-IX-komplekset. Mens antistofferne giver en bekvem, enkel, divalent bindende partner, er det logisk at antage, at Cross Linking af mechanoreceptors på modstående celler i omløb kan opnås via myriader af multivalente ligander med tilstrækkelig høj uforbindende Styrker. Denne teknik kan være nyttige i fremtiden i påvisning af de specifikke virkninger af sådanne ligander. Derudover kan den ensartede forskydningsanalyse anvendes sammen med billedbehandlings teknikker, der ikke er beskrevet heri, såsom standard Fluorescens mikroskopi. I sidste ende, den ensartede forskydningsanalyse giver en rimelig billig, kvantitativ og specifik metode til at anvende laminar forskydning til celler og celle fragmenter i opløsning, og kan bruges opstrøms for mange detekteringsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Arbejde, der er relevant for denne undersøgelse, blev delvist støttet af National Institutes of Health (NIH) national Heart, Lung og Blood Institute giver HL082808, HL123984 (R.L.), og F31HL134241 (M.E.Q.). Støtte ydet af NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); og pilot tilskud midler fra children's Healthcare af Atlanta og Emory University Pediatric flow cytometry Core. Forfatterne vil gerne takke Dr. hans Deckmyn for at dele 6B4 antistof, og Emory children's Pediatric Research Center flow cytometry Core for teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
En ensartet Forskydningsanalyse for humant trombocyttal og celleoverflade receptorer via kegle-plade Viscometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter