Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

אנו מתארים שיטה בפתרון כדי להחיל להטות אחיד כדי קולטני משטח טסיות באמצעות קונוס-צלחת ויסבנסה. ניתן להשתמש בשיטה זו גם באופן כללי יותר כדי להחיל הטיה על סוגי תאים אחרים ושברי תאים, ואין צורך לייעד זוג מסוים של ליגולי-קולטן.

Abstract

תאים ביולוגיים רבים לחוש את התכונות המכאניות של הסביבה המקומית שלהם באמצעות מכנינים, חלבונים שיכולים להגיב לכוחות כמו לחץ או רטבאליות מכני. מכניקנים מזהים את הגירויים שלהם ומעבירים אותות באמצעות מגוון גדול של מנגנונים. חלק מן התפקידים השכיחים ביותר עבור מכניטורים הם בתגובות נוירואליות, כמו מגע וכאב, או תאי שיער הפועלים בשיווי משקל ושמיעה. המכונה גם חשובה עבור סוגי תאים אשר נחשפים באופן קבוע למתח הטיה כגון תאים אנדותל, אשר קו כלי דם, או תאי דם אשר חווים את ההטיה במחזור הרגיל. ויסברוטרס הם מכשירים המזהים את צמיגות הנוזלים. בנוסף, ניתן להשתמש בגומדי הסיבוב להחלת כוח הטיה ידוע על נוזלים. היכולת של מכשירים אלה כדי להחדיר הטיה אחיד לנוזלים נוצל ללמוד נוזלים ביולוגיים רבים, כולל דם פלזמה. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ויסבנסה להחלת הטיה על התאים בפתרון, ולבדיקת השפעות ההטיה בזוגות מסוימים של ליגטיים ולקולטן. כאן, אנו מנצלים חרוט-צלחת ומנסה לבחון את ההשפעות של רמות אנדודוגני של לחץ הטיה על טסיות שטופלו עם נוגדנים נגד טסיות הדם מכונאי קולטן המכונה GPIb-IX.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מכניטורים הם חלבונים המגיבים לגירויים מכניים, כגון לחץ או עיוות מכני/דפורמציה. עבור חלק מהמכבשים, חישת הרטבאליות המכני הללו מפורשת לתפקוד סוגי התאים בהם הם מבוטאים. לקחת, למשל, קולטני למתוח ב baroreceptor נוירונים; אלה תעלות יון מכניתיים רגישות להסדיר לחץ דם על ידי חישת כלי דם "מתיחה"1,2. באוזן הפנימית, ערוצי יון על תאי השיער לזהות דפורמציות מכניות הנגרמת על ידי גלי קול3, ו מכני הסף נמוך המכונה מכונות (ltmrs) להקל על העברת מידע מישוש4. במקרים אחרים מספקים מכניקנים מידע חשוב לתא להקמת הדבקה או התפתחות. תאים יכולים לחוש קשיחות של הסביבה המקומית שלהם, והוא יכול להסתמך על כוחות הקונאקטאליה דרך שלד ציטוטין ואינטגרציה להכתיב צמיחה או התפשטות5,6.

כאשר לומדים קולטן-ליגונים ואינטראקציות בתא או רקמות מבוססי מודלים, שכיחות משותף קיים אשר יכול במהירות ובדייקנות לדווח את ההשפעות של שינוי טמפרטורה, pH, ליג, ריכוז, טונגניות, פוטנציאל הממברנה, ופרמטרים רבים אחרים שיכול להשתנות בvivo. עם זאת, אלה מספר שאומר עלול ליפול קצר כשמדובר לזהות את התרומה של כוח מכני כדי הפעלת הקולטן. אם התאים מחישה את הסביבה המיקרוקומבית שלהם, מזהה גלי קול או מגיבים למתיחה, דבר אחד שמשותף למכונה הזאת הוא שהם משתתפים באינטראקציות שבהן הליקטור, הקולטן או שניהם, מעוגנים ל שטח. Assays שפותחה כדי לבדוק את ההשפעות של כוחות מכניים על אינטראקציות הקולטן לעתים קרובות משקפים פרדיגמה זו. מיקרופלואידיקה ותאי הזרימה משמשים לחקר ההשפעות של הטיית זרימה על תאים וקולטנים7,8. סוגים אלה של ניסויים יש את היתרון של המאפשר כוונון עדין של שיעורי הטיה באמצעות מהירויות זרימה הוקמה. טכניקות אחרות להעסיק בדיקה מולקולרית פלורסנט כדי לזהות כוחות החלים על ידי תאים על משטחים ligand-עשיר, מניב בדיקה מדויקת של סדר הגודל והכיוונים של כוחות המעורבים באינטראקציה9,10.

בנוסף לתחושה המכונה היכן אחד או שניהם מעוגנים על פני השטח, הטיה לחץ עשוי להשפיע על חלבונים ותאים בתמיסה. זה נצפה לעתים קרובות בתאי הדם/חלבונים אשר כל הזמן במחזור, ועשוי להתבטא באמצעות הפעלה של מכונות מכונות כי הם בדרך כלל מעוגן משטח11, או באמצעות חשיפה של רצפי היעד אשר יהיה לחסימה תחת תנאים סטטיים12. עם זאת, טכניקות מעטות יחסית מאפשרות את ההשפעות של כוח ההטיה על חלקיקים בתמיסה. כמה גישות ב-פתרון להציג את ההטיה באמצעות תאים vortexing בהשעיה נוזל עם מהירויות שונות ומשכים, למרות גישות אלה לא יאפשר קביעה מדויקת מאוד של לחץ ההטיה שנוצר. מדידת צמיגות ברוטציה מדידה על ידי החלת כוח מסוים בהטיה לנוזלים. כאן אנו מתארים שיטה מיושמת לקביעת ההשפעה של שיעורי הטיה ספציפיים בתאים או שברי תאים בתמיסה.

אחד החלבונים המבוזרים ביותר על משטח הטסיות הוא מתחם גליקופרוטאין (GP) ליברות-IX. GPIb-IX הוא הקולטן העיקרי עבור חלבון הפלזמה פון Willebrand פקטור (VWF). יחד, זה קולטן-ליגניים וזוג כבר מוכר כבסיס של תגובת טסיות כדי להטות את הלחץ13. במקרה של נזק כלי דם, VWF נקשר קולגן חשוף במטריקס sub-אנדותל14, ובכך לגייס טסיות לאתר של פציעה באמצעות אינטראקציה Vwf-GPIb-IX. VWF מחויבות לאתר הכריכה שלה ביחידת המשנה GPIbα אם GPIb-IX תחת הלחץ הפיזיולוגי הטיה גורם התגלגלות של התחום המכונה המאובחושי הממברנה (MSD) אשר בתורו מפעיל GPIb-IX15. במחקר שנערך לאחרונה, הראינו כי נוגדנים נגד GPIbα, כמו אלה שנוצרו תרומבוציטופניה חיסונית רבים (ITP) חולים, הם גם מסוגלים לגרימת איתות טסיות באמצעות MSD התגלגלות תחת לחץ הטיה11. עם זאת, בניגוד VWF, אשר מקלה על גזירה המושרה GPIb-IX הפעלה על ידי ששתק את הקומפלקס תחת מחזור רגיל, הנוגדנים הדו בעלי היכולת להצליב טסיות באמצעות GPIb-IX ולהתפתח MSD במחזור הדם. בדרך זו, מתקן המופעל בדרך כלל על ידי הטיית פני השטח תחת הטיה ניתן להפעיל בתמיסה. בדוח הנוכחי, ניתן להדגים כיצד מבוסס על מדים מבוססי ומוח להטות את שיטת העבודה היה ממונפת כדי לזהות את ההשפעות של רמות ספציפיות של מתח הטיה על הפעלת הקולטן בפתרון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל השיטות באמצעות טסיות האדם הנגזר התורם המתואר בזאת אושרו על ידי הלוח סקירה מוסדית של אוניברסיטת אמורי/הבריאות של הילדים של אטלנטה.

1. בידוד דם וטסיות

  1. לצייר דם אנושי מתוך ההסכמה תורמים מבוגרים בריאים באמצעות הניקוב ביום הניסוי לתוך 3.8% trisodium ציטראט. אחד 4.5 mL של דם הוא מספיק כדי להניב מספיק פלזמה עשיר טסיות (PRP) עבור 20-25 תנאים בתורמים אשר ספירות טסיות קרובים ל250 x 103 לכל μl.
    הערה: הימנע מציור דם באמצעות מחטי מד צר (קטן מ -21 G).
  2. הכן PRP באמצעות צנטריפוגה ב 22 ° צ' ו 140 x g עבור 12 דקות עם בלם ארוך. זה יגרום שתי שכבות נפרדות, עם כדוריות הדם האדומות בתחתית האור PRP בצבע בראש.
  3. לבודד את העליון, מעונן, צהוב שכבה של PRP באמצעות ליטוף בזהירות דרך הפיפטה טיפ לחתוך בזווית 45 ° ולקבל את ספירת טסיות באמצעות ספירת דם מלאה (ספירת הדם).
  4. במידת הצורך, לשטוף את טסיות בתוך מלוחים צינורות (150 מ"מ, 20 מ"מ צינורות) בנוכחות של פרוסטגלנדין E1 (PGE1) ו להשעות מחדש במאגר של tyrode (134 mm הנאקל, 0.34 mm Na2hpo4, 2.9 mm kcl, 1 מ"מ mgcl2, 5 מ"מ גלוקוז, 12 mm נחקו 3, 20 מ"מ Hepes, pH 7.35) עם גלוקוז 5 מ"מ, אחרת, המשך לשלב 1.5. הצעדים הבאים מתארים את הכביסה בקצרה.
    1. כוונן את נפח PRP ל 10 mL עם מלוחים צינורות באגירה ולהוסיף 0.6 μM PGE1.
    2. צנטריפוגה עבור 8 דקות ב 1,900 x g, ואז למחוק supernatant ולתת את הגלולה הטסיות לשבת 400 Μl של tyrode של התמיסה ואת הגלוקוז עבור 5 דקות.
    3. ושמור אותו ללא הפרעה. במשך 30 דקות
  5. להתאים את ספירת טסיות כדי ~ 250 x 103 טסיות לכל μl עם ממאגר האדם המסכן טסיות-פלזמה (PPP) ולשמור על ההשעיה ב 22 ° c מופרעת או בסיבוב עדין.

2. ליגניים ומדים להטות את הטיפול

הערה: כל השלבים בסעיף 2 הדורשים ליטוף צריך להתבצע באיטיות, כדי לא להציג כל הטיה.

  1. הוסף את הנוגדן הרצוי או ליגנד כדי prp או שטף טסיות ולערבב בעדינות על ידי ליטוף למעלה ולמטה או זע עם טיפ פיפטה. השאירו אותו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר עבור 5-10 דקות. הוסף אמצעי אחסון שווה ערך של המאגר של PPP או של Tyrode לפקד שלילי.
  2. הפעל את לוחית האצטרובל, הגדר את טמפרטורת הצלחת ל -22 ° c ואפשר לזמן לתת לצלחת להגיע לטמפרטורה זו.
  3. פיפטה התייחס PRP או שטף טסיות על מבוקרת טמפרטורה חרוט הלוחית הזיקוק ישירות במרכז הצלחת. ודא כי כל המדגם מופקד בין החרוט והצלחת בנקודת המגע, ולא על החלק החיצוני של שפת החרוט.
  4. הטיה בקצב ובמשך המתאים.
    1. חשב את ההטיה כפי שמצוין במדריך ההדרכה, או כפי שהוצג בעבר15,16.
    2. קביעת קצב ההטיה מצמיגות ומהמתח הרצוי של ההטיה באמצעות חוק הצמיגות של ניוטון; Equation 1; צמיגות של פלזמה הוא 1.5-1.6 מצלסיוס (cP)17. לדוגמה, טווח הטיה רגיל עבור זרימת האדם הוא 5-30 דינמיקה/cm2 והטיה צריך להיות מוחל על הזמן ספרה אחת דקה.
  5. להרים את החרוט של הצלחת slighlty (~ 2 מ"מ) כך את המדגם נשאר במגע עם הצלחת וגם חרוט, ולהשתמש ג'ל טעינת או מיתר הצינורות הארוך כדי לאסוף 5-10 μL מהמרכז של נפח המדגם.
  6. מודחלת את דגימות המאכלת עם הסמנים הרצויים עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר. עבור סמנים של זרחן, β-גלקטוז, ו P-selectin להשתמש בחשיפה לקטחסיד בתחום C2 (LactC2) ב 0.08 μM18, אריקה קריסטאלי לקטין (ecl) ב 6.25 μg/ml, ו-Anti-P-בלטין נוגדן (20 μg/ml), בהתאמה.
  7. לתקן דגימות 2% פאראפורמלדהיד עבור 20 דקות בשעה RT לפני דילול או אחסון קר, ולהמשיך לשלב 3.1 או לאחסן דגימות ב 4 ° c עבור לא יותר מ 12 h.

3. זיהוי סמנים פני השטח והקישור דרך הזרימה cy, לנסות

  1. לנתח את המדגם באמצעות הזרמת cy, איסוף לפחות 20,000 אירועים עבור כל תנאי.
  2. עוצמת האות של קוונטייט של סמני הפלורסנט באמצעות ערך הגובה של העוצמה של כל fluorophore או את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית הגיאומטרית (MFI).
  3. אם במטרה לזהות מרובי טסיות הקישור בעקבות הטיה הטיפול, לנתח את המדגם על הדמיה-מסוגל זרימה cytometer ו כימות הקשר על ידי אזור הפרמטרים יחס הגובה.
    1. מתווה היסטוגרמה של אזור ו/או יחס גובה-רוחב.
    2. השתמש בפקד שלילי עם אלבומין סרום בקר (bsa) או הרכב כדי לצייר שער ללא האירועים מעגלי באופן מלא (שער זה מצויר בדרך כלל ביחס גובה-רוחב ~ 0.819,20) ו ככמת את אחוז האירועים בתוך השער הזה. אירועים בעלי יחס רוחב-גובה נמוך יותר נוטים יותר להיות מקושרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 1 מתאר כיצד מודל ההדק של הפעלת GPIb-IX, בתחילה הציג כדי להסביר הפעלת הקולטן התלוי הטיה כאשר מעוגן לקיר כלי, יכול גם לתמוך הפעלה של טסיות המקושרות על ידי ליגנטי רב. איור 2 מציג את הקריאות של הפעלת טסיות הדם האנושית שטופלו על ידי שני נוגדנים מיקוד התחום N-מסוף של GPIb-IX (6B4 ו-11A8), ונוגדן שליטה אחד (נורמלי igg) תחת תנאים סטטיים והוא. באיור 3, טסיות טופלו עם 6B4 ונוגדן עם כוח בלתי מחייב נמוך מדי כדי להפעיל את ההפעלה GPIb-IX, AK2. איור 4 מראה קורס זמן. סמנים של הפעלת טסיות דם נחקר וזוהו בנקודות זמן מתקדמות במהלך הטיה הטיפול עם 11A8 או AK2. באיור 5a, נוגדן מרובי קישור חרוזים בגודל בינוני מעוטר בתחום GPIB-IX N-מסוף הייתה באמצעות הזרימה הקונבנציונלית cy, לנסות. איור 5 b מציג את 6B4 בתיווך הקישור של טסיות כמו הדמיה באמצעות זרימת ההדמיה cy, לנסות. באיור 6, דגימות קליניות של סרום מחולים עם תרומבוציטופניה החיסונית שימשו במקום נוגדנים חד שבטיים הדיגונטי נגד GPIb-IX בשימוש בדמויות קודמות. החולה פלזמה המכילים נוגדנים נגד GPIb-IX המופעל התגובות הטיה התלויים, בניגוד עם פלזמה מ ITP חולים ללא נוגדנים מיקוד GPIb-IX.

Figure 1
איור 1 : מתקן טסיות דם GPIb-IX יכול לאגד ליגנטי מסיסים (כגון נוגדן). כאשר שני מתחמי GPIb-IX על טסיות דם מנוגדות לאגד לאותו ליגנטי זהה, מתרחשת הקשר הצלב. תחת ההטיה הפיסיולוגית, טסיות הדם המקושרות יכול ליצור כוח מושך לפעול על GPIb-IX ולהתפתח MSD בו. כתוצאה של MSD התגלגלות, GPIb-IX מופעל, והוא מעורר מאותת טסיות והרשאה לטסיות דם במורד הזרם, כפי שמודגם. הדמות הותאמה מ-Quach ואח '21אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : הביטוי של סמנים של הפעלה טסיות ב PRP האדם טיפל עם IgG בקרת או anti-GPIb-IX נוגדנים 11A8 ו 6B4 תחת סטטי או שליטה (30 דינמיקה/cm2) תנאים. בתוצאות הנציגים הללו, חשיפת משטח הטסיות של פוספולידיסרין (PS), β-גלקטוז, ו-P-Selectin בטחו על ידי חלבון פלורסנט ירוק (GFP)-מעלה מעלה-C2, FITC-מצומדת כקריסטאלי ליטין (ECL) ו APC-מצוקים . נוגדן נגד פי-סלטין, בהתאמה קרינה פלואורסצנטית זוהה דרך הזרימה cy, לנסות. נתונים מבוטאים כאחוזי אירועים בעלי קרינה פלואורסצנטית מעל שליטה שלילית. p ≤ 0.001, * * * * p ≤ 0.0001; משמעות הנקבעת באמצעות ה- t-test של הסטודנט. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : PRP האדם טיפל שני נוגדנים אנטי GPIb-IX. Prp האדם טיפל שני אנטי gpib-IX נוגדנים, אחד עם כוח בלתי מחייב גבוה (6b4) ואחד עם כוח להתיר נמוך (AK2) תחת סטטי (0 דינמיקה/cm2), הטיה נמוכה (5 דינמיקה/cm2), והטיה גבוהה (30 דינמיקה/cm2) תנאים. גרפים מציגים אחוז מהאירועים החיוביים לביטוי פני-השטח של β-גלקטוז, PS ו-P-Selectin. * p ≤ 0.05, * * * p ≤ 0.001. המשמעות נקבעה באמצעות ANOVA חד כיוון עם Tukey מבחן. קווי שגיאה מייצגים את SD. הדמות הותאמה מ-Quach ואח '11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : מהלך הזמן של חשיפה הטיה (20 דינמיקה/cm2) עבור prp האדם טיפל בבקרת Igg, 11a8, או AK2. חשיפה משטח טסיות של PS ו-P-Selectin זוהה באמצעות cy, הזרמת דגימות עבור דוגמיות של 0, 0.5, 1, 3, ו 5 דקות. * * * p ≤ 0.001, * * * * p ≤ 0.0001. המשמעות נקבעה באמצעות ANOVA חד כיוון עם Tukey מבחן. קווי שגיאה מייצגים את SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : כימות הקישור לפי פרמטרים של אזור ויחס גובה-רוחב. (a) טסיות בגודל (4 μm) חרוזים היו מצובטים עם התחום N-מסוף של GPIbα ו-הדגירה עם igg (אפור), AK2 (אדום), או 6B4 (כחול) תחת שירואד (20 דינמיקה/cm2) תנאים. המוצג כאן הם חלקות מתאר של פיזור קדימה (FSC-A) לעומת האנטי-ומניעת הלחץ של נוגדנים. (ב) היסטוגרמה ליחס הרוחב של טסיות ב-prp מודריב עם 6B4 ו מתויג במהירות ANTI-CD41 (סמן טסיות) נוגדנים תחת הטיה. תמונות מייצגות ביחסי גודל שונים מוצגים. הדמות הותאמה מ-Quach ואח '11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6 : דגימות קליניות של סרום מחולים עם תרומבוציטופניה החיסונית שימשו במקום נוגדנים חד שבטיים הדיגונטי נגד GPIb-IX. (א) כושר מאגד gpib-IX של פלזמה מחולים עם itp, מאסף באמצעות האנזים מקושר אנזימים מקושרים (אליסה). (ב) שטף טסיות האדם מחדש ב-itp פלזמה החולה תחת סטטי ושטף (30 דינמיקה/cm2) תנאים. גרפים מציגים אחוזי התרחשויות חיוביים עבור ביטוי פני השטח של P-Selectin או PS. * * * * P ≤ 0.0001. המשמעות נקבעה באמצעות ANOVA חד כיוון עם Tukey מבחן. קווי שגיאה מייצגים את SD. הדמות הותאמה מ-Quach ואח '11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר הערכה מהירה ומגוונת של ההשפעה של הטיית למינאר על טסיות דם וקולטני משטח התא. תוצאות הנציג הספציפיות המוצגות כאן מדגישים כיצד ההשפעות של מולטימאריק או ביונטי ליגנדס יכולות להיות מושפעות מזרימת הטיה. בנוסף ליישום זה, שיטת גזירה אחידה כוללת יישומים רחבים בהתבוננות באפקטים התלויים בהטיה. בהעדר זוג מוכר של ליגולי-קולטן, מערכת ההטיה של מדים יכולה גם לזהות את ההשפעות של הטיה על גורמים כגון הצורה והאיתות של התאים, במיוחד כאשר הם משויכים לניתוחי זרימה. מרמזת בחלקו על-ידי איור 5b, שיטת הטיה אחידה מלווה את עצמה למגוון רחב של שיטות זיהוי שונות מאשר או בהשלמה לניתוחים הסטנדרטיים של הסייטוטומטתים המתוארים בפרוטוקול זה, כולל דימות, ביוכימיים ומבוססי-תא. בחני.

איור 2 מסמל את היישום הבסיסי של הבקשה, במיוחד כדי להפלות בין אינטראקציה התלויה בהטיה והקולטן לבין שליטה שלילית. 6b4, נוגדן אשר מסוגל מרובי קישור טסיות באמצעות קשירה לקולטנים gpib-IX ולקיים מספיק כוח כדי להפעיל את הקולטן11, מפעיל טסיות כאשר הם חשופים להטיה (מתוארת במודל באיור 1), בניגוד ל IgG control שליטה שאינה מאגד טסיות דם GPIb-IX. יישום זה מספק בו הוכחה לכך שהאפקט הוא ספציפי לקולטן-ליגניים שנבחרו והוא תלוי בהטיה. שיטת ההטיה האחידה יכולה גם להבחין בין ההשפעות של ליגנדס אשר יכולים ולא יכולים לקיים את איגרות החוב שלהם לקולטן תחת רמות הטיה ספציפיות. באיור 3, אנו רואים חוסר איתות מתוך הנוגדן Anti-GPIb-IX AK2, אשר מאגד את האפירופה שלה עם כוח חלש במיוחד בלתי מחייב11. איור זה גם מדגים את ההשפעות של שונות את רמת מאמץ הטיה מוחל על ידי החרוט-צלחת ומתח נמוך להטות גבוה.

איור 4 ממחיש שניתן להשתמש באפשרות זו כדי לווסת את אורך החשיפה הטיה ומציע אסטרטגיה להצגת נתונים אלה. באיור 5, שני זרימה חלופית-cy, לנסות מבוסס הקריאות לצורך שימוש, שניהם לא להסתמך על סמנים פלורסנט של הפעלת הקולטן, אך במקום זאת ניתן להשתמש כדי לתאר את הקישור והגודל/צורה שינוי. איור 5 b מציג את אופן הפיזור הקדמי, המגביר בפרופורציה לגודל האירוע, יכול להבחין בין אוכלוסיות שונות של בלתי מקושרות (סינגתן), הבחנה, שלישיה, או הרמות גבוהות יותר של אירועים מקושרים. כמו באיור 5b, ניתן ליישם את השיטה על חרוזים מבוונים לקולטן של עניין, אשר מבטלת את האפשרות של קולטנים אחרים המשתתפים באירועים המקשרים לראות דרך שיטות אחרות. באיור 6, פלזמה, נוזל ביולוגי המכיל ליגניות פוטנציאליים עבור קולטן העניין שלנו משמש במקום נוגדנים חד שבטיים מטוהרים. הדבר ממחיש יישום שבו לא יהיה צורך לקבל שותף ידוע או איגוד מסוים עבור קולטן של עניין.

למרות שהטיפול הינו נגיש למדי ככתוב, ישנם כמה צעדי מפתח שצריך לבצע בזהירות. בראש ובראשונה הוא להיזהר לא להציג את ההטיה ממקורות חיצוניים חוץ מאשר את הטיפול ההטיה בפועל עצמו. כאשר מציירים דם, כפי שהוזכר בשלב 1.1 של פרוטוקול זה, חשוב לצייר אותו דרך מחטים הנכון למדוד. עבור איסוף דם אנושי באמצעות הננקב מתוך ההסכמה תורמים מבוגרים, זה יכול להתבצע עם 21 מערכת איסוף דם G (המפורטים בטבלה של חומרים). לאחר דם נמשכים PRP מבודד, זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר עד 6 h על הספסל או על הג האיטית.

אם הצנטריפוגה השתמשו כדי לבודד PRP יכול לבלום במהירויות שונות הוא הטוב ביותר לבחור בלימה איטית כדי למזער את ההפרעה של שכבת PRP ויישום של כוח מיותרים. לאחר PRP מבודד או סוג תא של עניין הוא השעיית נוזל, להימנע מללטף את התערובות מהר מדי. במקום זאת, לשאוב ולגרש דגימות בצורה איטית ויציבה במיוחד במהלך שלב 2.5, שבו המדגם מצויר באמצעות קצה הצינורות הצר במיוחד. מומלץ להשתמש באמצעי האחסון לדוגמה הניתנים לשימוש באמצעות קצות פיפטה בגדלים שונים, כדאי לנצל את הגדול ביניהם. לדוגמאות רגישות במיוחד או צמיגה, ניתן לחתוך את קצה הפיפטה בזווית כדי להרחיב את הפתח שדרכו הדגימה מצוירת.

מספר רב של מבחנים שיבדקו את השפעת ההטיה על המכונה התאית מסתמכים על אינטראקציה בין ליגנים מעוגן לבין הקולטן שלו. מיקרופלואידיקה ותאי הזרימה הם דוגמה אחת, כאשר האינטראקציה בין ליגאן מעוגן לבין קולטן, בדרך כלל בתא בתמיסה, ניתן להבחין בזמן אמת7,8. טכניקות אחרות להשתמש מיקרוסקופ כדי לזהות אירועים המתרחשים בממשק בין שכבת התא ואת המצע הבסיסי או לחקור9. טכניקות אלה שימשו במיוחד השפעה גדולה בלימוד כדוריות הדם במחזור הדם. מצד שני, טכניקות המאפשרות חקירת אירועים המתרחשים כולו בתמיסה תחת זרימה מוגבלות יותר. עבור יישום כללי של כוח בפתרון, vortexing מדגם עשוי לשמש כשיטה "מהירה ומלוכלכת". עם זאת, קשה לקבוע את הכוח המדויק שהוחל, וההטיה אינה בטוחה כתוצאה מזרימה שכבתית. זהו אחד היתרונות של האחיד להטות את שיטת ההטיה. לעומת זאת, ממדים להטות את החיסרון העיקרי של המילוי הוא פער זמן בין היישום להטות והתבוננות בתאים עצמם. הטיה מוחלת, ולאחר מכן התאים מוכתמים וקבועים, אך טכניקות דימות אינן יכולות להתבונן בתאים במהלך תהליך ההטיה עצמו. עיבוד אחד של שיטה זו יהיה כרוך בהוספת התאים ישירות לסמנים הרצויים ולהטיה עם הסמנים הקיימים. הדבר יאפשר גילוי מיידי של כל השפעות זמניות.

עד כה התחלנו ליישם את הבחינה הזאת כדי לזהות את האפקט התלוי בהטיה התלויה בפתרון הנוגדנים המכוון לקומפלקס GPIb-IX. בעוד הנוגדנים מספקים שותף מחייב נוח, פשוט, מחייבת, זה הגיוני להניח כי באמצעות הקישור של מכונות מנוגדות על תאים מנוגדים במחזור ניתן להשיג באמצעות מספר רב של ליגניות מרובת-הידיים עם מספיק גבוה בלתי מחייב כוחות. טכניקה זו עשויה להועיל בעתיד בזיהוי ההשפעות המסוימות של ליגניות כאלה. בנוסף, ניתן להשתמש ביכולות ההטיה האחידה בשילוב עם טכניקות הדמיה שאינן מתוארות להלן כגון מיקרוסקופ קרינה מסוג רגיל. בסופו של דבר, שיטת ההטיה האחידה מספקת שיטה זולה, כמותית וספציפית להחלת הטיה למינארי על תאים וקטעי תאים בתמיסה, וניתן להשתמש במעלה הזרם של שיטות זיהוי רבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

העבודה הרלוונטית למחקר זה נתמכת בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות, ריאות ומכון הדם מענקים HL082808, HL123984 (ר), F31HL134241 (M.E.Q.). מימון שסופק גם על ידי NIH המכון הלאומי של מדעי הרפואה הכללית גרנט T32GM008367 (M.E.Q.); והטייס מענק כספים משירותי הבריאות של הילדים של אטלנטה ואוניברסיטת אמורי הזרמת ילדים ליבה. המחברים רוצים להודות ד ר הנס מורן על שיתוף הנוגדן 6B4, ואת הילדים אמורי המרכז לחקר הילד זרימת Cy, ליבת ליבה לתמיכה טכנית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
מדים להטות שיטת של טסיות האדם וקולטני פני שטח התא דרך קונוס-וזיקוק הלוח
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter