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Biology

एक वर्दी कतरनी परख के लिए मानव प्लेटलेट और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के माध्यम से शंकु प्लेट Viscometry

Published: June 5, 2019 doi: 10.3791/59704
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Aflac Cancer and Blood Disorders Center, Children's Healthcare of Atlanta, 2Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine

Summary

हम एक में समाधान विधि का वर्णन करने के लिए समान कतरनी को लागू करने के लिए प्लेटलेट सतह रिसेप्टर्स शंकु प्लेट viscometry का उपयोग कर । इस विधि भी अधिक मोटे तौर पर अन्य कोशिका प्रकार और सेल-टुकड़े करने के लिए कतरनी लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और एक विशिष्ट ligand रिसेप्टर जोड़ी लक्ष्य की जरूरत नहीं.

Abstract

अनेक जैविक कोशिकाएं/ऊतक यंत्राग्राही, प्रोटीनों के द्वारा अपने स्थानीय वातावरणों के यांत्रिक गुणों को व्यक्त करते हैं, जो दाब या यांत्रिक क्षोभ जैसी ताकतों को प्रतिसाद दे सकते हैं । यंत्राग्राही अपने उद्दीनों का पता लगाता है और तंत्रों की एक महान विविधता के द्वारा संकेतों को संचारित करते हैं । यंत्राग्राही के लिए सबसे आम भूमिकाओं में से कुछ न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं में हैं, जैसे स्पर्श और दर्द, या बाल कोशिकाओं जो संतुलन और सुनवाई में कार्य करते हैं । यंत्रसंवेदना कोशिका प्रकारों के लिए भी महत्त्वपूर्ण है जो नियमित रूप से अपरूपण प्रतिबल के संपर्क में आते हैं जैसे एंडोथीलियल कोशिकाएं, जो रेखा रक्त वाहिकाएं या रक्त कोशिकाएं जो सामान्य परिसंचरण में अपरूपण का अनुभव करते हैं । Viscometers उपकरणों है कि तरल पदार्थ का चिपचिपापन का पता लगाने रहे हैं । घूर्णन viscometers भी तरल पदार्थ के लिए एक ज्ञात कतरनी बल लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । रक्त और प्लाज्मा सहित कई जैविक तरल पदार्थों का अध्ययन करने के लिए तरल पदार्थ के समान कतरनों को लागू करने के लिए इन उपकरणों की क्षमता का दोहन किया गया है । श्यानताप्रयास भी एक समाधान में कोशिकाओं को कतरनी लागू करते हैं, और विशिष्ट ligand रिसेप्टर जोड़े पर कतरनी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहां, हम शंकु प्लेट viscometry प्लेटलेट मैकेनोसंवेदी रिसेप्टर जटिल GPIb-IX के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इलाज प्लेटलेट्स पर कतरनी तनाव के अंतर्जात स्तर के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए उपयोग ।

Introduction

यंत्रग्राही वे प्रोटीन होते हैं जो यांत्रिक उद्दीनों, जैसे-दाब या यांत्रिक क्षोभ/विकृति का प्रत्युत्तर देते हैं । कुछ यंत्रकारों के लिए, इन यांत्रिक परिचरों को संवेदन उस कोशिका प्रकार के प्रकार्य के लिए स्पष्ट है जिसमें वे अभिव्यक्त होते हैं । , उदाहरण के लिए ले लो, दाबग्राही ंयूरॉंस में खिंचाव रिसेप्टर्स; ये यंत्रासंवेदी आयन चैनल संवहनी "खिंचाव"1,2संवेदन द्वारा रक्तचाप को विनियमित । भीतरी कान में, बाल कोशिकाओं पर आयन चैनलों ध्वनि तरंगों3की वजह से यांत्रिक विकृति का पता लगाने, और त्वचीय कम दहलीज यांत्रिक oreceptors (ltmrs) स्पर्श जानकारी के संचरण की सुविधा4. अन्य मामलों में, यंत्राग्राही, आसंजन या वृद्धि की स्थापना के लिए कोशिका को महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं । कोशिकाओं को अपने स्थानीय पर्यावरण की कठोरता समझ सकते हैं, और actin साइटोपंजर और integrins के माध्यम से सिकुड़ा बलों पर निर्भर वृद्धि हुक्म चलाना या5,6फैल सकता है ।

सेल या ऊतक आधारित मॉडल में रिसेप्टर-लिगामेंट बातचीत का अध्ययन करते समय, आम assays हैं जो जल्दी और सही में फेरबदल तापमान, पीएच, लिगामेंट एकाग्रता, tonicity, झिल्ली क्षमता के प्रभाव की रिपोर्ट कर सकते हैं, और कई अन्य मापदंडों जो विवो में भिन्न हो सकते हैं । हालांकि, ये वही assays हैं, कम गिर सकता है जब यह करने के लिए यांत्रिक बल के योगदान का पता लगाने की बात आती है रिसेप्टर सक्रियण. चाहे कोशिकाओं को अपने microenvironment संवेदन कर रहे हैं, ध्वनि तरंगों का पता लगाने, या खिंचाव का जवाब, एक बात aforementioned मैकेनिसेप्टर आम में है कि वे बातचीत में भाग ले रहे हैं, जहां ligand, रिसेप्टर, या दोनों, एक के लिए लंगर डाले है सतह. Assays हैं, रिसेप्टर बातचीत पर यांत्रिक बलों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए विकसित अक्सर इस प्रतिमान को प्रतिबिंबित । Microfluidics और प्रवाह कक्षों कोशिकाओं और रिसेप्टर्स पर कतरनी प्रवाह के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है7,8. प्रयोगों के इन प्रकार की अनुमति के ठीक-स्थापित प्रवाह गति के माध्यम से कतरनी दरों के ट्यूनिंग का लाभ है । अन्य तकनीकों के लिए फ्लोरोसेंट आणविक जांच को रोजगार बलों के ligand-रिच सतहों पर लागू का पता लगाने, परिमाण और बलों के झुकाव का एक सटीक readout उपज9,10बातचीत में शामिल है ।

जहां एक या दोनों भागीदारों एक सतह के लिए लंगर डाले हुए है यंत्राबोध के अलावा, कतरनी तनाव प्रोटीन और कोशिकाओं के समाधान में प्रभावित हो सकता है । यह प्राय: रक्त कोशिकाओं/प्रोटीनों में पाया जाता है जो लगातार परिसंचरण में होते हैं, और यंत्राग्राही के सक्रियण के माध्यम से प्रकट हो सकते हैं जो सामान्य रूप से सतह-11anchored होते हैं, या लक्ष्य अनुक्रम के जोखिम के माध्यम से जो स्थैतिक शर्तें12। हालांकि, अपेक्षाकृत कम तकनीकों समाधान में कणों पर कतरनी बल के प्रभाव परख । कुछ में समाधान दृष्टिकोण अलग गति और durations के साथ द्रव निलंबन में vortexing कोशिकाओं के माध्यम से कतरनी परिचय, हालांकि इन तरीकों कतरनी उत्पंन तनाव का एक बहुत ही सटीक दृढ़ संकल्प की अनुमति नहीं हो सकता है । आवर्ती viscometers तरल पदार्थ के लिए एक विशिष्ट कतरनी बल लागू करने से माप चिपचिपापन । यहाँ हम समाधान में कक्षों या कोशिका अंशों पर विशिष्ट पटलीय अपरूपण दरों के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए एक अनुप्रयुक्त विधि का वर्णन करते हैं ।

प्लेटलेट सतह पर अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन में से एक ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) आईबी-IX परिसर है । GPIb-IX प्लाज्मा प्रोटीन वॉन Willebrand फैक्टर (VWF) के लिए प्राथमिक रिसेप्टर है । एक साथ, इस रिसेप्टर ligand जोड़ी लंबे समय से कतरनी तनाव13के लिए प्लेटलेट प्रतिक्रिया की नींव के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है । संवहनी क्षति की स्थिति में, वीडब्ल्यूएफ बांध उप-endothelial मैट्रिक्स14में कोलेजन उजागर करने के लिए, इस प्रकार vwf के माध्यम से चोट की साइट के लिए प्लेटलेट्स की भर्ती-GPIB-IX बातचीत । यदि शारीरिक कतरनी तनाव के अंतर्गत जीपीआईबी-IX एक झिल्ली-समीपस्थ यांत्रिकीय संवेदी प्रक्षेत्र (एमएसडी) का खुलासा करता है जो इसके परिणामस्वरूप जीपीआईबी-IX15को सक्रिय कर देते हैं । हाल ही में किए गए एक अध्ययन में हमने यह दर्शाया है कि जीपीबीα के विरुद्ध एंटीबॉडी, जैसे कि कई प्रतिरक्षा थ्रोम्बोसाइटोपीनिया (आईटीपी) रोगियों में उत्पन्न होते हैं, यह भी अपरूपण तनाव11के तहत खुलासा msd के माध्यम से प्लेटलेट संकेतन उत्प्रेरण करने में सक्षम हैं । तथापि, वीडब्ल्यूएफ के विपरीत, जो सामान्य परिसंचरण के अंतर्गत जटिल को निष्क्रिय करके अपरूपण-पे्ररित जीपीआईबी-IX सक्रियण की सुविधा प्रदान करता है, बाईवेलेंट एंटीबॉडी, जीपीआईबी-IX के माध्यम से प्लेटलेट्स को crosslink करने और परिचालन में एमएसडी को प्रकट करने में सक्षम होते हैं । इस तरह, एक यंत्राग्राही जो सामान्य रूप से अपरूपण के अंतर्गत सतह स्थिरीकरण द्वारा सक्रिय होता है, समाधान में सक्रिय किया जा सकता है । वर्तमान रिपोर्ट में, हम प्रदर्शन करेंगे कैसे एक viscometer आधारित वर्दी कतरनी परख के लिए समाधान में रिसेप्टर सक्रियण पर कतरें तनाव के विशिष्ट स्तर के प्रभाव का पता लगाने leveraged था ।

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Protocol

सभी दाता का उपयोग कर तरीके व्युत्पंन मानव प्लेटलेट्स इस के साथ साथ वर्णित Emory विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया/

1. रक्त आकर्षित और प्लेटलेट अलगाव

  1. ३.८% trisodium साइट्रेट में प्रयोग के दिन शिरावेधन के द्वारा स्वस्थ वयस्क दाताओं सहमति से मानव रक्त ड्रा । एक ४.५ मिलीलीटर रक्त की नली पर्याप्त प्लेटलेट रिच प्लाज्मा उपज के लिए पर्याप्त है (पीआरपी) दाताओं में 20-25 की स्थिति के लिए जिनकी प्लेटलेट काउंट २५० x 103 प्रति μl के करीब हैं ।
    नोट: संकीर्ण गेज सुई (21 ग्राम से छोटी) के माध्यम से रक्त ड्राइंग से बचें ।
  2. 22 डिग्री सेल्सियस और १४० एक्स जी पर एक लंबे ब्रेक के साथ 12 मिनट के लिए अपकेंद्रण के माध्यम से prp तैयार करते हैं । यह दो अलग परतों में परिणाम होगा, नीचे लाल रक्त कोशिकाओं और शीर्ष पर हल्के रंग PRP के साथ ।
  3. एक ४५ ° कोण पर कटौती और एक पूर्ण रक्त गणना (सीबीसी) के माध्यम से प्लेटलेट गिनती प्राप्त एक pipetting टिप के माध्यम से सावधान pipetting के माध्यम से शीर्ष, बादल छाए हुए, पीआरपी की पीली परत को अलग करें ।
  4. यदि आवश्यक हो, पाइप में प्लेटलेट्स धोने-buffered खारा (१५० mm nacl, 20 mM पाइप) प्रोस्टाग्लैंडीन E1 (PGE1) की उपस्थिति में और resuspend में टाइरोडे बफर (१३४ mm nacl, ०.३४ mm ना2hpo4, २.९ mm kcl, 1 मिमी mgcl2, 5 मिमी ग्लूकोज, 12 मिमी nahco 3, 20 मिमी Hepes, पीएच ७.३५) 5 मिमी ग्लूकोज के साथ, अन्यथा, १.५ कदम के लिए आगे बढ़ें. निंन चरणों का पालन संक्षेप में धोने का वर्णन ।
    1. पीआरपी वॉल्यूम पाइप buffered खारा के साथ 10 मिलीलीटर के लिए समायोजित करें और ०.६ μM PGE1 जोड़ें ।
    2. १,९०० एक्स जीमें 8 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, तो supernatant त्यागें और प्लेटलेट गोली 5 मिनट के लिए है tyrode और ग्लूकोज समाधान के ४०० μl में बैठते हैं ।
    3. प्लेटलेट पेलेट को धीरे से फिर से लटकाना और 30 मिनट तक अविचलित रखें ।
  5. प्लेटलेट काउंट ~ २५० x 103 प्लेटलेट्स प्रति μl के साथ पूल्ड मानव प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) के लिए समायोजित करें और 22 डिग्री सेल्सियस बाधित या कोमल रोटेशन के तहत निलंबन को बनाए रखने ।

2. ligand और वर्दी कतरनी उपचार

नोट: pipetting की आवश्यकता है कि खंड 2 में सभी कदम धीरे से किया जाना चाहिए, ताकि किसी भी कतरनी परिचय नहीं है ।

  1. पीआरपी या धोया प्लेटलेट्स के लिए वांछित एंटीबॉडी या लिगामेंट जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting या एक पिपेट टिप के साथ क्रियाशीलता से धीरे मिश्रण । इसे 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अव्यवस्थित छोड़ दें । एक नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए पीपीपी या टायरोडे के बफर के एक समकक्ष मात्रा जोड़ें.
  2. शंकु प्लेट विस्कोमीटर पर बारी, 22 डिग्री सेल्सियस के लिए थाली तापमान सेट और समय देने के लिए थाली इस तापमान तक पहुँचने की अनुमति दें ।
  3. पिपेट उपचारित पीआरपी या धुली हुई प्लेटलेट्स को सीधे प्लेट के मध्य में तापमान-नियंत्रित शंकु-प्लेट श्यानतामापी पर । सुनिश्चित करें कि नमूना के सभी शंकु और प्लेट के बीच संपर्क के बिंदु पर जमा है, और शंकु रिम के बाहर पर नहीं ।
  4. एक उचित दर और अवधि पर कतरें ।
    1. कतरनी की गणना के रूप में श्यानतामापी मैनुअल द्वारा संकेत दिया, या के रूप में पहले15,16दिखाया ।
    2. चिपचिपापन से कतरनी दर और वांछित कतरनी तनाव न्यूटन के नियम के माध्यम से निर्धारित करें; Equation 1; प्लाज्मा चिपचिपापन 1.5-1.6 सेंटीमीटर (सीपी)17है । उदाहरण के लिए, मानव परिसंचरण के लिए एक सामांय कतरनी सीमा है 5-30 dyn/सेमी2 और कतरें एकल अंक मिनट के समय पैमाने पर लागू किया जाना चाहिए ।
  5. प्लेट slighlty (~ 2 मिमी) का शंकु बंद उठाएं ताकि नमूना दोनों थाली और शंकु के साथ संपर्क में रहता है, और नमूना मात्रा के केंद्र से 5-10 μl इकट्ठा करने के लिए एक जेल-लोडिंग या अन्य लंबे पिपेट टिप का उपयोग करें ।
  6. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए वांछित मार्कर के साथ अपरूपित नमूने सेते । फॉस्फेट के मार्कर के लिए, β-गैलेक्टोज, और P-selectin जोखिम का उपयोग Lactadherin C2 डोमेन (LactC2) पर ०.०८ μM18, एरिथ्रिना cristagalli लेक्टिन (ईसीएल) पर ६.२५ μg/ml, और विरोधी-p-selectin एंटीबॉडी (20 μg/ml), क्रमशः ।
  7. कमजोर पड़ने या ठंडे बस्ते से पहले आरटी में 20 मिनट के लिए 2% paraformaldehyde में नमूनों को ठीक करें, और ३.१ कदम के लिए आगे बढ़ना या 4 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं 12 घंटे के लिए नमूने की दुकान ।

3. सतह मार्करों का पता लगाने और प्रवाह कोशिका मिति के माध्यम से crosslinking

  1. प्रवाह कोशिका मिति के माध्यम से नमूने का विश्लेषण, प्रत्येक शर्त के लिए कम से २०,००० घटनाओं का संग्रह ।
  2. प्रत्येक फ्लोरोफोर की तीव्रता, या ज्यामितीय माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) के लिए ऊंचाई मान का उपयोग करते हुए फ्लोरोसेंट मार्कर की क्वांटेट सिग्नल शक्ति ।
  3. कतरनी उपचार के बाद प्लेटलेट crosslinking का पता लगाने के लिए लक्ष्य, एक इमेजिंग-सक्षम प्रवाह cytometer पर नमूना का विश्लेषण और क्षेत्र और पहलू अनुपात पैरामीटर द्वारा crosslinking परिमाटेट ।
    1. क्षेत्र और/या पक्षानुपात का हिस्टोग्राम प्लॉट करें ।
    2. गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) या वाहन के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग सबसे पूरी तरह से परिपत्र घटनाओं को छोड़कर एक फाटक आकर्षित करने के लिए (इस गेट आमतौर पर एक पहलू अनुपात पर खींचा है ~ ०.८19,20) और इस गेट के अंदर घटनाओं का प्रतिशत quantitate. एक कम पहलू अनुपात के साथ घटनाओं crosslinked होने की संभावना है ।

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Representative Results

चित्रा 1 कैसे gpib के ट्रिगर मॉडल-IX सक्रियण, शुरू में कतरनी पर निर्भर रिसेप्टर सक्रियण समझाने के लिए शुरू पेश जब पोत दीवार के लिए लंगर डाले, भी एक बहुमान ligand द्वारा crosslinked प्लेटलेट्स के सक्रियण का समर्थन कर सकते हैं । चित्र 2 में जीपीआईबी-IX (6B4 और 11A8) के एन-टर्मिनल डोमेन को लक्षित करने वाले दो एंटीबॉडीज द्वारा इलाज किए गए मानव प्लेटलेट सक्रियण के readouts और एक नियंत्रण एंटीबॉडी (सामान्य igg) को बाल काटना और स्थैतिक स्थितियों के अंतर्गत दिखाया गया है । चित्र 3में, प्लेटलेट्स 6B4 और एक एंटीबॉडी के साथ एक अनबाइंडिंग बल बहुत कम के साथ इलाज किया गया था gpib-IX सक्रियण, AK2 ट्रिगर । चित्रा 4 एक समय पाठ्यक्रम से पता चलता है. प्लेटलेट सक्रियण के मार्कर की जांच की और 11A8 या AK2 के साथ कतरनी उपचार के दौरान प्रगतिशील समय बिंदुओं पर पता चला रहे थे । चित्रा 5मेंएक, एंटीबॉडी crosslinking प्लेटलेट साइज जीपीआईबी के साथ सजाया-IX एन टर्मिनल डोमेन पारंपरिक प्रवाह कोशिका मिति के माध्यम से assayed था । चित्रा 5 बी 6B4-इमेजिंग फ्लो cytometry के माध्यम से imaged के रूप में प्लेटलेट्स की mediated crosslinking दिखाता है । चित्रा 6में, पिछले आंकड़ों में इस्तेमाल किया gpib-IX के खिलाफ द्वि-संयोजक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के स्थान पर प्रतिरक्षा थ्रोम्बोसाइटोपेनिया के साथ रोगियों से सीरम के नैदानिक नमूनों का इस्तेमाल किया गया । जीपीआईबी-ix के प्रति रोगी प्लाज्मा-युक्त एंटीबॉडी ने जीपीआईबी-IX को लक्षित एंटीबॉडी के बिना आईटीपी रोगियों से प्लाज्मा के विपरीत अपरूपण-निर्भर प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर कर ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्लेटलेट सतह यंत्राग्राही जीपीआईबी-IX एक घुलनशील डाइवेलेंट लिगांड (जैसे एंटीबॉडी) को बाँध सकता है । जब प्लेटलेट का विरोध करने पर दो जीपीआईबी-IX परिसर एक ही डाइवेलेंट लिगंड से बाइंड हो जाते हैं, तो क्रॉसलिंकिंग होती है । शारीरिक अपरूपण के अंतर्गत, क्रॉसलिंक्ड प्लेटलेट्स, जीपीआईबी-IX पर कार्य करने के लिए एक पुलिंग बल उत्पन्न कर सकता है और उसमें एमएसडी को प्रकट कर सकते हैं । एमएसडी के परिणामस्वरूप, जीपीआईबी-IX सक्रिय हो जाता है और प्लेटलेट सिग्नलिंग और डाउनस्ट्रीम प्लेटलेट क्लीयरेंस लाती है, जैसा कि सचित्र है । चित्रा Quach एट अल से अनुकूलित किया गया था21कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : मानव prp में प्लेटलेट सक्रियण के मार्कर की अभिव्यक्ति नियंत्रण के साथ इलाज igg या विरोधी gpib-IX एंटीबॉडी 11a8 और 6b4 स्थिर या अपरूपित (30 dyn/सेमी2) शर्तों के तहत । इन प्रतिनिधियों के परिणामों में, ग्रीन फ्लोरिसेंट प्रोटीन (जीएफपी), β-गैलेक्टोज और पी-चयन के प्लेटलेट सतह के प्रदर्शन की जांच की गई । विरोधी पी-चयन एंटीबॉडी, क्रमशः । प्रतिदीप्ति प्रवाह कोशिकामिति के माध्यम से पाया गया. डेटा नकारात्मक नियंत्रण के ऊपर प्रतिदीप्ति के साथ घटनाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. p ≤ ०.००१, * * * * p ≤ ०.०००१; छात्र टी-टेस्ट के माध्यम से निर्धारित महत्व । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन (SD) का प्रतिनिधित्व करती हैं । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : मानव PRP दो विरोधी GPIb-IX एंटीबॉडी के साथ इलाज किया । मानव PRP दो विरोधी GPIb-IX एंटीबॉडी, एक उच्च अनबाइंडिंग बल (6B4) के साथ एक और कम अनबाइंडिंग बल (0 dyn/सेमी 2), कम कतरनी (5 dyn/सेमी 2), और उच्च कतरनी (30 dyn/ रेखाचित्र दर्शाते हैं कि घटनाओं का प्रतिशत β-गैलेक्टोज, पीएस और पी-सेलेटिन की सतह व्यंजक के लिए धनात्मक होता है । * p ≤ ०.०५, * * * p ≤ ०.००१ । महत्व एक एक तरह से एक प्रकार का ANOVA के माध्यम से निर्धारित किया गया था Tukey परीक्षण । त्रुटि पट्टियां SD. Figure का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिंहें Quach एट अल.11से अनुकूलित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : कतरनी जोखिम के समय पाठ्यक्रम (20 dyn/सेमी2) मानव Prp नियंत्रण Igg, 11a8, या AK2 के साथ इलाज के लिए. पुनश्च के प्लेटलेट सतह जोखिम और पी-selectin के नमूनों के लिए प्रवाह कोशिका मिति के माध्यम से पता चला था 0, ०.५, 1, 3, और 5 मिनट के लिए अपरूपित. * * * p ≤ ०.००१, * * * * p ≤ ०.०००१ । महत्व एक एक तरह से एक प्रकार का ANOVA के माध्यम से निर्धारित किया गया था Tukey परीक्षण । त्रुटि पट्टियां SD का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का कोई बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : क्षेत्र और आस्पेक्ट रेश्यो पैरामीटर्स द्वारा क्रॉलिंकिंग Quantitating । (क) प्लेटलेट-साइज (4 माइक्रोमीटर) मनकों को जीपीबीα के एन-टमनल डोमेन के साथ संयुग्मित किया गया था तथा इन्हें आईआईजी (ग्रे), AK2 (रेड) अथवा 6B4 (ब्लू) के साथ इनक्यूबेटिड (20 डाइन/सेमी2) शर्तों के अंतर्गत दिया गया था । यहां दिखाया आगे तितर बितर (FSC-ए) बनाम विरोधी माउस एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति के समोच्च भूखंड हैं । (ख) पीआरपी में प्लेटलेटों के आस्पेक्ट अनुपात के लिए हिस्टोग्राम 6B4 और फ्लूरेस्सी के साथ इनक्यूबेटेड एंटी-CD41 (प्लेटलेट मार्कर) एंटीबॉडी के रूप में लेबल । विभिंन पहलू अनुपात में प्रतिनिधि छवियों को दिखाया जाता है । चित्रा Quach एट अल से अनुकूलित किया गया है11कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : प्रतिरक्षा थ्रोम्बोसाइटोपेनिया के साथ रोगियों से सीरम के नैदानिक नमूनों gpib-IX के खिलाफ द्वि-संयोजक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के स्थान पर इस्तेमाल किया गया । (क) आईटीपी के रोगियों से प्लाज्मा की जीपीआईबी-IX बंधनकारी क्षमता, जिसे एंजाइम लिंक्ड इम्यूनोसोतुला एपरख (एलिसा) के माध्यम से किया जाता है । (घ) स्थिर और अपरूपित (30 dyn/cm2) शर्तों के तहत itp रोगी प्लाज्मा में पुनर्गठित मानव प्लेटलेट्स धोया । रेखांकन, P-Selectin या PS की सतह अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक घटनाओं का प्रतिशत दिखाएँ * * * * P ≤ ०.०००१. महत्व एक तरह से एक प्रकार का ANOVA के माध्यम से निर्धारित किया गया था Tukey परीक्षण । त्रुटि पट्टियां SD. Figure का प्रतिनिधित्व करती हैं, जिंहें Quach एट अल.11से अनुकूलित किया गया हैकृपया इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल प्लेटलेट और कोशिका सतह रिसेप्टर्स पर स्तरीय कतरनी के प्रभाव के त्वरित और बहुमुखी मूल्यांकन की अनुमति देता है । यहां प्रस्तुत विशिष्ट प्रतिनिधि परिणाम यह रेखांकित करते हैं कि किस प्रकार मल्टीमेरिक या बाइवेलेंट लिगैंड्स के प्रभाव कतरनी प्रवाह से प्रभावित हो सकते हैं । इस आवेदन के अलावा, एक समान कतरनी परख अपरूपण निर्भर प्रभाव देख में व्यापक आवेदन किया है । एक ज्ञात ligand रिसेप्टर जोड़ी के अभाव में, एक समान कतरनी परख भी ऐसे सेल आकार और संकेतन के रूप में कारकों पर कतरनी के प्रभाव का पता लगाने कर सकते हैं, खासकर जब प्रवाह cytometric विश्लेषण के साथ जोड़ा । चित्रा 5बीद्वारा भाग में alluded, एक समान कतरनी परख ही पता लगाने के अंय तरीकों की एक विस्तृत विविधता को बख्शी के अलावा या में मानक प्रवाह cytometric विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित, इमेजिंग सहित, जैव रासायनिक, और सेल आधारित के पूरक assays.

चित्रा 2 परख के मूल आवेदन की मिसाल है, विशेष रूप से एक कतरनी पर निर्भर ligand-रिसेप्टर बातचीत और एक नकारात्मक नियंत्रण के बीच भेदभाव करने के लिए । 6B4, एक एंटीबॉडी जो जीपीआईबी-IX रिसेप्टर्स के लिए बाइंडिंग के माध्यम से प्लेटलेट्स crosslinking करने में सक्षम है और रिसेप्टर11को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त बल को बनाए रखने, कतरनी को उजागर जब ( चित्रा 1में मॉडल में चित्रित), के विपरीत प्लेटलेट्स सक्रिय IgG नियंत्रण जो प्लेटलेट GPIb-IX बांध नहीं है । यह आवेदन एक साथ सबूत है कि प्रभाव चुना रिसेप्टर-ligand जोड़ी के लिए विशिष्ट है प्रदान करता है और कतरनी पर निर्भर है । वर्दी कतरनी परख भी लिगन्डों के प्रभाव के बीच भेद कर सकते है जो और विशिष्ट कतरें स्तर के तहत एक रिसेप्टर के लिए अपने बांड बनाए रखने नहीं कर सकते । चित्रा 3में, हम विरोधी GPIB-IX एंटीबॉडी AK2, जो एक विशेष रूप से कमजोर अबाध्यकारी बल11के साथ अपने epitope बांध से readout संकेतन की कमी देखते हैं । इस आंकड़े को भी कतरनी शंकु द्वारा लागू तनाव के स्तर बदलती के प्रभाव को दर्शाता है एक कम से उच्च कतरें के लिए प्लेट श्यानतामापी ।

चित्रा 4 दर्शाता है कि इस परख कतरनी जोखिम की लंबाई मिलाना और इस डेटा को प्रदर्शित करने के लिए एक रणनीति से पता चलता है इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 5में, दो वैकल्पिक प्रवाह परख के लिए-cytometry आधारित readouts उपयोग किया जाता है, जिनमें से दोनों रिसेप्टर सक्रियण के फ्लोरोसेंट मार्कर पर भरोसा नहीं है, लेकिन बजाय crosslinking और आकार का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है/ चित्रा 5 बी दिखाता है कि कैसे आगे तितर बितर, जो एक घटना के आकार के अनुपात में वृद्धि, असम्बद्ध (एकल) की विशिष्ट आबादी के बीच भेद कर सकते हैं, द्विक, triplet, या उच्च बहु crosslinked घटनाओं । चित्रा 5बीमें के रूप में, परख के लिए ब्याज की एक रिसेप्टर, जो अंय अंय तरीकों के माध्यम से देखा घटनाओं crosslinking में भाग लेने के रिसेप्टर्स की संभावना eliminates संयुग्मित मोतियों को लागू किया जा सकता है । चित्रा 6, प्लाज्मा में, ब्याज के हमारे रिसेप्टर के लिए संभावित लिगन्डों युक्त एक जैविक द्रव शुद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के स्थान पर प्रयोग किया जाता है. यह एक आवेदन है जिसमें ब्याज की एक रिसेप्टर के लिए एक विशिष्ट ज्ञात लिगामेंट बाध्यकारी साथी आवश्यक नहीं हो सकता है दिखाता है ।

हालांकि परख के रूप में लिखा काफी सुलभ है, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है जो देखभाल के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए रहे हैं । इनमें से सबसे महत्वपूर्ण करने के लिए वास्तविक कतरनी उपचार के अलावा अंय बाहरी स्रोतों से कतरनी परिचय नहीं सावधान रहना है । जब रक्त ड्राइंग, के रूप में इस प्रोटोकॉल के कदम १.१ में उल्लेख किया है, यह उचित गेज सुई के माध्यम से आकर्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है । शिरावेधन के माध्यम से मानव रक्त संग्रह के लिए वयस्क दानदाताओं सहमति से, यह एक 21 जी रक्त संग्रह सेट के साथ पूरा किया जा सकता है ( सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध) । एक बार रक्त और खींचा PRP अलग है, यह 6 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर बेंच पर या एक धीमी गति से rotisserie पर संग्रहीत किया जा सकता है ।

यदि अपकेंद्रित्र पीआरपी को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया विभिन्न गति पर ब्रेक कर सकते हैं यह एक धीमी ब्रेक का चयन करने के लिए इतना के रूप में PRP परत और अनावश्यक बल के आवेदन की अशांति को कम करने के लिए सबसे अच्छा है । एक बार PRP अलग है या ब्याज की सेल प्रकार द्रव निलंबन में है, मिश्रण भी जल्दी pipetting से बचने के । इसके बजाय, एक धीमी और स्थिर फैशन में विशेष रूप से महाप्राण और नमूने को निष्कासित कदम २.५, जहां नमूना एक विशेष रूप से संकीर्ण पिपेट टिप के माध्यम से तैयार की है के दौरान । नमूना संस्करणों के लिए जो सही pipetted विभिंन आकारों के सुझावों के माध्यम से pipetted जा सकता है, यह उन के बीच सबसे बड़ा उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है । विशेष रूप से संवेदनशील या चिपचिपा नमूनों के लिए, पिपेट टिप के अंत में एक कोण पर काट किया जा सकता है खोलने के माध्यम से जो नमूना तैयार किया जाना है चौड़ा ।

कई assays है जो सेलुलर यंत्राबोध पर कतरनी के प्रभाव का परीक्षण एक लंगर लिगामेंट और उसके रिसेप्टर के बीच एक बातचीत पर भरोसा करते हैं । Microfluidics और प्रवाह कक्षों एक ऐसा उदाहरण है, जहां एक लंगर लिगामेंट और एक रिसेप्टर के बीच बातचीत, आम तौर पर समाधान में एक सेल पर, वास्तविक समय में मनाया जा सकता है7,8। अन्य तकनीकों एक कोशिका परत और अंतर्निहित सब्सट्रेट या जांच9के बीच इंटरफेस पर होने वाली घटनाओं का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें. इन तकनीकों के संचलन में रक्त कोशिकाओं का अध्ययन करने में विशेष रूप से महान प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया गया है । दूसरी ओर, तकनीक जो घटनाओं कि प्रवाह के तहत समाधान में पूरी तरह से होने की पूछताछ की अनुमति अधिक सीमित हैं । समाधान में बल के जेनेरिक आवेदन के लिए, एक नमूना vortexing एक "त्वरित और गंदे" विधि के रूप में सेवा कर सकते हैं । हालांकि, लागू सटीक बल निर्धारित करने के लिए मुश्किल है, और कतरनी स्तरीय प्रवाह से परिणाम के लिए निश्चित नहीं है । यह एक समान कतरनी परख के लाभों में से एक है । दूसरी ओर, वर्दी कतरनी है परख प्राथमिक दोष आवेदन कतरनी के बीच एक समय अंतराल और कोशिकाओं को खुद देख रहा है । कतरें लागू किया जाता है, तो कोशिकाओं को दाग और तय कर रहे हैं, लेकिन इमेजिंग तकनीक कतरनी प्रक्रिया के दौरान ही कोशिकाओं का पालन नहीं कर सकते । इस विधि का एक अनुकूलन कोशिकाओं को सीधे वांछित मार्करों को जोड़ने और वर्तमान मार्करों के साथ बाल काटना शामिल होगा । यह किसी भी क्षणिक प्रभाव का तत्काल पता लगाने की अनुमति होगी ।

इस प्रकार अब तक हमने इस परख को लागू किया है कि जीपीआईबी-IX परिसर को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के कतरनी-आधारित समाधान प्रभाव का पता लगाया जाए । जबकि एंटीबॉडी एक सुविधाजनक, सरल, द्वि-संयोजक बाध्यकारी साथी प्रदान करते हैं, यह मानना है कि संचलन में कोशिकाओं का विरोध करने पर मैकेनोरेक्टर्स के crosslinking पर्याप्त उच्च अबाध्यकारी के साथ असंख्य बहुसंयोजक लिगन्डों के माध्यम से पूरा किया जा सकता है तार्किक है बलों. यह तकनीक भविष्य में ऐसे लिगांड्स के विशिष्ट प्रभावों का पता लगाने में उपयोगी हो सकती है । इसके अतिरिक्त, समान कतरनी परख इमेजिंग तकनीक के साथ संयोजन के रूप में इस तरह के मानक प्रतिदीप्ति microscopy के रूप में वर्णित नहीं किया जा सकता है । अंत में, वर्दी कतरनी परख एक यथोचित सस्ते, मात्रात्मक प्रदान करता है, और समाधान में कोशिकाओं और कोशिका टुकड़े को स्तरीय कतरें लागू करने के लिए विशिष्ट विधि, और कई का पता लगाने तरीकों के ऊपर इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए प्रासंगिक कार्य स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान अनुदान HL082808, HL123984 (à), और F31HL134241 (M.E.Q.) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । NIH राष्ट्रीय जनरल मेडिकल साइंसेज संस्थान अनुदान T32GM008367 (M.E.Q.) द्वारा भी प्रदान की फंडिंग; और पायलट प्रदान अटलांटा और Emory विश्वविद्यालय बाल चिकित्सा फ्लो Cytometry कोर के बच्चों के स्वास्थ्य से धन । लेखकों को 6B4 एंटीबॉडी साझा करने के लिए डॉ हंस Deckmyn शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और Emory बच्चों के बाल चिकित्सा अनुसंधान केंद्र प्रवाह Cytometry कोर तकनीकी सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

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References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).

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जीवविज्ञान निर्गम १४८ कतरनी यंत्रसंवेदना यंत्राग्राही प्लेटलेट श्यानतामिति बायोफिजिक्स फ्लो सायटोमेट्री हेमोस्टेसिस
एक वर्दी कतरनी परख के लिए मानव प्लेटलेट और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के माध्यम से शंकु प्लेट Viscometry
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Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A… More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

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