Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En uniform Shear analysen for humant blodplater og Cell Surface reseptorer via Cone-plate Viskosimetri

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

Vi beskriver en in-løsning metode for å bruke uniform skjær til blodplater overflaten reseptorer ved hjelp av membran-plate viskosimetri. Denne metoden kan også brukes mer generelt til å bruke skjær til andre celletyper og celle-fragmenter og trenger ikke å målrette et bestemt ligand-reseptor-par.

Abstract

Mange biologiske celler/vev kjenne de mekaniske egenskapene til sine lokale miljøer via mechanoreceptors, proteiner som kan reagere på krefter som trykk eller mekanisk forstyrrelser. Mechanoreceptors oppdage sine stimuli og overføre signaler via et stort mangfold av mekanismer. Noen av de vanligste rollene for mechanoreceptors er i neuronal svar, som berøring og smerte, eller hårceller som fungerer i balanse og hørsel. Mechanosensation er også viktig for celletyper som regelmessig utsettes for skjær stress som endothelial celler, hvilken linje blodkar, eller blodceller som opplever skjær i normal sirkulasjon. Viskosimetre er enheter som oppdager viskositet av væsker. Rotasjons viskosimetre kan også brukes til å påføre en kjent skjærkraft på væsker. Evnen til disse instrumentene til å innføre ensartet skjær til væsker har blitt utnyttet til å studere mange biologiske væsker, inkludert blod og plasma. Viskosimetri kan også brukes til å søke skjær til cellene i en løsning, og å teste effekten av skjær på bestemte ligand-reseptor parene. Her bruker vi membran-plate viskosimetri å teste effekten av endogene nivåer av skjær stress på blodplater behandlet med antistoffer mot blodplater mechanosensory reseptoren komplekse GPIb-IX.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mechanoreceptors er proteiner som reagerer på mekaniske stimuli, som trykk eller mekaniske forstyrrelsene/deformasjon. For noen mechanoreceptors, sensing disse mekaniske forstyrrelser er eksplisitt til funksjonen av celletyper som de er uttrykt. Ta for eksempel strekk reseptorene i baroreceptor neurons; disse mechanosensitive ion-kanaler regulerer blodtrykket ved sensing vaskulær "Stretch"1,2. I det indre øret oppdager ion-kanaler på hårceller mekaniske deformasjoner forårsaket av lydbølger3, og hud lav terskel Mechanoreceptors (LTMRs) Letter overføring av taktil informasjon4. I andre tilfeller, mechanoreceptors gi viktig informasjon til cellen for etablering av vedheft eller vekst. Celler kan fornemme stivhet i sitt lokale miljø, og kan stole på kontraktile styrker via utgangen cytoskeleton og integrins å diktere vekst eller spredning5,6.

Når man studerer reseptor-ligand interaksjoner i celle-eller vevs BAS ert modeller, finnes det felles analyser som raskt og nøyaktig kan rapportere virkningene av å endre temperatur, pH, ligand konsentrasjon, tonisitet, membran potensial, og mange andre parametre som kan variere i vivo. Men de samme analysene kan komme til kort når det gjelder å påvise bidrag av mekanisk kraft til reseptor aktivering. Enten cellene er sensing deres mikromiljøet, oppdage lydbølger, eller reagerer på strekk, en ting de nevnte mechanoreceptors har til felles er at de deltar i interaksjoner der ligand, reseptoren, eller begge, er forankret til en Overflaten. Analyser utviklet for å teste effekten av mekaniske krefter på reseptor interaksjoner gjenspeiler ofte dette paradigmet. Materialer og Flow kamre brukes til å studere virkningene av skjær flyt på celler og reseptorer7,8. Disse typer eksperimenter har fordelen av å tillate finjustering av skjær rater via etablerte strømningshastigheter. Andre teknikker ansette fluorescerende molekylære sonder for å oppdage krefter brukt av celler på ligand-rike overflater, gir en nøyaktig avlesning av omfanget og orientering av krefter involvert i samspillet9,10.

I tillegg til mechanosensation som oppstår der en eller begge partnerne er forankret til en overflate, kan skjær stress påvirke proteiner og celler i løsningen. Dette er ofte observert i blodceller/proteiner som er konstant i sirkulasjon, og kan manifestere via aktivering av mechanoreceptors som normalt overflate-forankret11, eller gjennom eksponering av mål sekvenser som ville være okkludert under statiske forhold12. Men relativt færre teknikker analysen effekten av skjærkraft på partikler i løsningen. Noen i løsningen tilnærminger innføre skjær via virvlingen celler i Fluid suspensjon med varierende hastigheter og varigheter, selv om disse tilnærmingene kan ikke tillate en svært presis bestemmelse av skjær stress generert. Rotasjons viskosimetre måler viskositet ved å påføre en spesifikk skjærkraft på væsker. Heri beskriver vi en anvendt metode for å bestemme effekten av bestemte laminær skjær priser på celler eller celle fragmenter i løsningen.

En av de mest uttrykte proteiner på blodplate overflaten er glykoprotein (GP) IB-IX-komplekset. GPIb-IX er primær reseptoren for plasma proteinet von Willebrand Factor (VWF). Sammen har dette reseptor-ligand paret lenge vært anerkjent som grunnlaget for plate responsen for å skjære stress13. I tilfelle vaskulær skade, VWF binder seg til eksponert kollagen i sub-endothelial matrise14, og dermed rekruttere blodplater til skadestedet via VWF-GPIB-IX interaksjon. VWF engasjement til sitt bindende område i GPIbα-delenhet hvis GPIb-IX under fysiologisk skjærbelastning induserer utfoldelsen av en membran-proksimale mechanosensory domene (MSD) som i sin tur aktiverer GPIb-IX15. I en fersk studie har vi vist at antistoffer mot GPIbα, som de som genereres i mange immun trombocytopeni (ITP) pasienter, er også i stand til å indusere blodplater signalering via MSD utfolder seg under skjær stress11. Men i motsetning til VWF, som letter skjær indusert GPIb-IX-aktivering ved å immobilizing komplekset under normal sirkulasjon, er de bivalent Antistoffene i stand til å krysskobling blodplater via GPIb-IX og utfolde MSD i omløp. På denne måte, en mechanoreceptor hvilke er normalt aktivert av overflate immobilisering under klipping kan aktivert inne løsning. I denne rapporten, vil vi demonstrere hvordan en kapillærviskosimeteret-basert uniform skjær analysen ble utnyttes til å oppdage virkningene av bestemte nivåer av skjær stress på reseptor aktivering i løsningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle metoder benytter donor-avledet Human blodplater beskrevet her over var godkjent av det institusjonell anmelde råd av Emory universitet/barn ' Healthcare av Atlanta.

1. blodprøve og blodplate isolasjon

  1. Tegn menneskelig blod fra samtykkende friske voksne donorer via venepunksjon på dagen av eksperimentet i 3,8% Trisodium Citrate. En 4,5 mL tube blod er tilstrekkelig til å gi nok blodplater rik plasma (PRP) for 20-25 tilstander i donorer som har blodplater teller nær 250 x 103 per μL.
    Merk: unngå å tegne blod via smale måle nåler (mindre enn 21 G).
  2. Klargjør PRP via sentrifugering ved 22 ° c og 140 x g i 12 minutter med lang brems. Dette vil resultere i to forskjellige lag, med røde blodlegemer nederst og lys farget PRP på toppen.
  3. Isoler den øverste, overskyet, gule lag av PRP via forsiktig pipettering gjennom en pipette spissen kuttes i en 45 ° vinkel og få blodplater telle via en fullstendig blodprosent (CBC).
  4. Om nødvendig, vask blodplater i rør-bufret saltvann (150 mM NaCl, 20 mM rør) i nærvær av prostaglandin E1 (PGE1) og resuspend i Tyrode buffer (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mM KCl, 1 mm MgCl2, 5 mm glukose, 12 mm NaHCO 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) med 5 mm glukose, ellers, Fortsett til trinn 1,5. Trinnene nedenfor beskriver vask i korte trekk.
    1. Juster PRP-volum til 10 mL med rør-bufret saltvann og tilsett 0,6 μM PGE1.
    2. Sentrifuger for 8 min ved 1 900 x g, kast deretter supernatanten og la blodplate pellets sitte i 400 ΜL av Tyrode og glukoseoppløsning i 5 min.
    3. Resuspend forsiktig blodplate pellet og hold den uforstyrret i 30 min.
  5. Juster antall blodplater til ~ 250 x 103 blodplater per μL med samlet humant blodplate-fattig plasma (PPP) og oppretthold suspensjonen ved 22 ° c uforstyrret eller under skånsom rotasjon.

2. ligand og jevn skjær behandling

Merk: alle trinn i del 2 som krever pipettering bør gjøres langsomt, for ikke å innføre noen skjær.

  1. Tilsett ønsket antistoff eller ligand til PRP eller vasket blodplater og bland forsiktig ved å pipettering opp og ned eller røre med en pipette spissen. La den være uforstyrret i romtemperatur i 5-10 min. Legg til et tilsvarende volum av PPP eller Tyrode buffer til en negativ kontroll.
  2. Slå på membran plate kapillærviskosimeteret, sett plate temperaturen til 22 ° c og gi tid til å la platen nå denne temperaturen.
  3. Pipetter de behandlede PRP eller vasket blodplater på den temperaturkontrollerte membran plate kapillærviskosimeteret direkte i midten av platen. Sørg for at alle prøvene er deponert mellom membranen og platen på kontaktpunktet, og ikke på utsiden av membran felgen.
  4. Skjær med riktig sats og varighet.
    1. Beregn skråstilling som indikert av kapillærviskosimeteret manualen, eller som tidligere vist15,16.
    2. Bestem skjær rate fra viskositet og ønsket skjær stress via Newtons lov av viskositet; Equation 1; plasma viskositet er 1.5-1.6 centipoises (cP)17. For eksempel, en normal skjær rekkevidde for menneskelig sirkulasjon er 5-30 Dyn/cm2 og skjær bør påføres på ett siffer minutt tidsskala.
  5. Løft membranen ut av plate slighlty (~ 2 mm) slik at prøven forblir i kontakt med både platen og membranen, og bruk en gel-loading eller annen lang pipette spiss for å samle 5-10 μL fra midten av prøvevolumet.
  6. Ruge de skåret prøvene med ønskede markører i 20 min ved romtemperatur. For markører av fosfatidylserin, β-galaktose og P-selectin eksponering bruker Lactadherin C2-domenet (LactC2) ved 0,08 μM18, Erythrina cristagalli LEKTINER (ECL) ved 6,25 μg/ml, og anti-P-selectin-antistoff (20 μg/ml), henholdsvis.
  7. Fix prøver i 2% paraformaldehyde i 20 min ved RT før fortynning eller kulde lagring, og gå videre til trinn 3,1 eller lagre prøver ved 4 ° c i ikke lenger enn 12 h.

3. påvisning av overflate markører og Cross Linking via strømnings flowcytometri

  1. Analysere prøven via Flow flowcytometri, samle minst 20 000 hendelser for hver tilstand.
  2. Quantitate signalstyrken til fluorescerende markører ved hjelp av høydeverdien for intensiteten til hver fluoroforen, eller den geometriske middel fluorescens intensiteten (MFI).
  3. Hvis sikte på å påvise blodplate Cross Linking etter skjær behandling, analysere prøven på en tenkelig-stand Flow flowcytometer og quantitate Cross Linking av areal og størrelsesforhold parametere.
    1. Tegne et histogram med areal og/eller størrelsesforhold.
    2. Bruk en negativ kontroll med storfe serum albumin (BSA) eller kjøretøy for å tegne en gate unntatt de fleste fullt sirkulære hendelser (denne porten er vanligvis trukket i et størrelsesforhold ~ 0,819,20) og quantitate prosentandelen av hendelser inne i denne porten. Det er mer sannsynlig at hendelser med lavere størrelsesforhold blir krysskoblet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1 skisserer hvordan utløse modell av GPIB-IX aktivering, først introdusert for å forklare skjær avhengig reseptor aktivering når forankret til fartøyet veggen, kan også støtte aktivering av blodplater krysskoblet av en multivalent ligand. Figur 2 viser readouts av humant blodplate behandlet av to antistoffer rettet mot N-Terminal domenet til GPIB-IX (6B4 og 11A8), og ett kontroll antistoff (normal IgG) under skåret og statiske forhold. I Figur 3ble blodplater behandlet med 6B4 og et antistoff med en unbinding kraft for lavt til å utløse GPIB-IX-aktivering, AK2. Figur 4 viser et tidspunkt kurs. Markører for blodplate aktivering ble analysert og oppdaget ved progressive tidspunkter under skjær behandling med 11A8 eller AK2. I figur 5a, ble antistoff Cross Linking med blodplater størrelse DEKORERT med GPIb-IX N-Terminal-domenet analyseres via konvensjonell strømnings flowcytometri. Figur 5 b viser 6B4-mediert Cross Linking av blodplater som avbildet via Imaging Flow flowcytometri. I figur 6ble kliniske prøver av serum fra pasienter med immun trombocytopeni brukt i stedet for de divalent monoklonale antistoffer mot GPIB-IX som ble brukt i tidligere tall. Pasienter plasma-inneholdende antistoffer mot GPIb-IX utløste skjær-avhengige responser, i kontrast med plasma fra ITP pasientene uten antistoffer rettet mot GPIb-IX.

Figure 1
Figur 1 : Blodplate overflaten mechanoreceptor GPIb-IX kan binde en oppløselig divalent ligand (for eksempel et antistoff). Når to GPIb-IX komplekser på motstående blodplater binder til samme divalent ligand, oppstår Cross Linking. Under fysiologisk skjær, krysskoblet blodplater kan generere en trekke kraft til å handle på GPIb-IX og utfolde MSD deri. Som en konsekvens av MSD er GPIb-IX aktivert, og induserer blodplater signalering og nedstrøms plate rydding, som illustrert. Figur ble tilpasset fra QUACH et al.21Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Uttrykk for markører for blodplate aktivering i HUMANT PRP behandlet med kontroll IgG eller anti-GPIb-IX-antistoffer 11A8 og 6B4 under statiske eller skåret (30 Dyn/cm2) forhold. I disse representative resultatene, blodplater overflaten eksponering av fosfatidylserin (PS), β-galaktose, og P-selectin ble analysert av grønt fluorescerende protein (GFP)-bøyd lb-C2, FITC-bøyd Erythrina cristagalli Lektiner (ECL) og APC-bøyd anti-P-selectin antistoff, henholdsvis. Fluorescens ble oppdaget via Flow flowcytometri. Data uttrykkes som prosentandel av hendelser med fluorescens over negativ kontroll. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; som er bestemt via student t-test. Feilfelt representerer standardavvik (SD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Human PRP behandlet med to anti-GPIb-IX-antistoffer. Human PRP behandlet med to anti-GPIb-IX antistoffer, en med høy unbinding kraft (6B4) og en med lav unbinding kraft (AK2) under statisk (0 Dyn/cm2), lav skjær (5 Dyn/cm2), og høy skjær (30 Dyn/cm2) forhold. Grafer viser prosentandelen av hendelser som er positive for overflate uttrykk for β-galaktose, PS og P-selectin. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. Betydning ble bestemt via en enveis ANOVA med Tukey test. Feilfelt representerer SD. figur er tilpasset fra QUACH et al.11Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Tid løpet av skjær eksponering (20 Dyn/cm2) for Human PRP behandlet med kontroll IgG, 11A8, eller AK2. Eksponeringen av blodplate overflaten av PS og P-selectin ble oppdaget via strømnings flowcytometri for prøver skåret for 0, 0,5, 1, 3 og 5 min. * * * p ≤ 0,001, * * * * P ≤ 0,0001. Betydning ble bestemt via en enveis ANOVA med Tukey test. Feilfelt representerer SD. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Kvantitere Cross Linking etter område-og størrelsesforhold parametere. (a) blodplater størrelse (4 μm) perler ble bøyd med N-Terminal domene av GPIbα og inkubert med IgG (grå), AK2 (rød), eller 6B4 (blå) under skåret (20 Dyn/cm2) forhold. Vist her er kontur tomter fremover scatter (FSC-A) versus anti-mus antistoff fluorescens. (b) histogram for størrelsesforholdet mellom blodplater i PRP-inkubert med 6B4 og fluorescensmerkete merket anti-CD41 (en blodplate markør) antistoffer under skjær. Representative bilder med ulike størrelsesforhold vises. Figuren er tilpasset fra QUACH et al.11Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Kliniske prøver av serum fra pasienter med immun trombocytopeni ble brukt i stedet for divalent monoklonale antistoffer mot GPIb-IX. (a) GPIB-IX-binding av plasma fra pasienter med itp, analyseres via enzym koblet immunosorbentanalyse-analyse (Elisa). (b) vasket menneskelige blodplater TILBEREDT i itp pasientens plasma under statiske og skåret (30 Dyn/cm2) forhold. Grafer viser prosentandelen av hendelser som er positive for overflate uttrykk av P-selectin eller PS. * * * * p ≤ 0,0001. Betydning ble bestemt via enveis ANOVA med Tukey test. Feilfelt representerer SD. figur er tilpasset fra QUACH et al.11Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Protokollen som er beskrevet i dette manuskriptet gir rask og allsidig vurdering av effekten av laminær skjær på blodplater og celleoverflaten reseptorer. Den spesifikke representative resultatene som presenteres her understreker hvordan virkningene av multimeric eller bivalent ligander kan påvirkes av skjær flyt. I tillegg til dette programmet, en enhetlig skjær analysen har brede anvendelser i observere skjær-avhengige effekter. I fravær av en kjent ligand-reseptor par, en enhetlig skjær analysen kan også oppdage effekten av skjær på faktorer som celle form og signalering, spesielt når sammenkoblet med Flow analytiske analyser. Antydet delvis av figur 5b, gir en uniform Shear analysen seg til et bredt spekter av oppdagelsen metoder enn eller i tillegg til standard Flow analytiske analyser skissert i denne protokollen, inkludert Imaging, biokjemiske, og celle-baserte analyser.

Figur 2 illustrerer den grunnleggende anvendelsen av analysen, spesielt for å diskriminere mellom en skjær avhengig ligand-reseptor interaksjon og en negativ kontroll. 6B4, et antistoff som er i stand til å Cross Linking blodplater via binding til GPIb-IX reseptorer og opprettholde nok kraft til å aktivere reseptoren11, aktiverer blodplater når de utsettes for skjær (avbildet i modellen i figur 1), i motsetning til kontroll IgG som ikke binder blodplater GPIb-IX. Dette programmet gir samtidig bevis for at effekten er spesifikk for den valgte reseptor-ligand par og er avhengig av skjær. Den uniform skjær analysen kan også skille mellom virkningene av ligander som kan og ikke kan opprettholde sine obligasjoner til en reseptor under spesifikke skjær nivåer. I Figur 3, ser vi en mangel på signalering avlesning fra anti-GPIB-IX antistoff AK2, som binder sin epitope med en spesielt svak unbinding Force11. Dette tallet demonstrerer også effekten av å variere nivået av skjær stress påføres av membran-plate kapillærviskosimeteret fra en lav til høy skjær.

Figur 4 viser at denne analysen kan brukes til å modulere lengden på skjær eksponering og antyder en strategi for å vise disse dataene. I figur 5, to alternative Flow-flowcytometri basert readouts for analysen brukes, som begge ikke er avhengig av fluorescerende markører for reseptor-aktivering, men i stedet kan brukes til å beskrive Cross Linking og størrelse/form endring. Figur 5 b viser hvordan frem scatter, som øker proporsjonalt med størrelsen på en hendelse, kan skille mellom distinkte populasjoner av opphevet koblingen (singlet), doublet, Triplet eller høyere multiplet krysskoblet hendelser. Som i figur 5b, kan analysen brukes til perler bøyd til en reseptor av interesse, noe som eliminerer muligheten for andre reseptorer som deltar i Cross Linking hendelser sett via andre metoder. I figur 6, plasma, en biologisk væske som inneholder potensielle ligander for vår reseptor av interesse brukes i stedet for renset monoklonale antistoffer. Dette illustrerer et program der en bestemt kjent ligand eller bindende partner for en reseptor av interesse ikke kan være nødvendig.

Selv om analysen er ganske tilgjengelig som skrevet, er det noen viktige trinn som bør utføres med forsiktighet. Fremst blant disse er å være forsiktig med å ikke innføre skjær fra eksterne kilder enn den faktiske skjær behandling selv. Når du tegner blod, som nevnt i trinn 1,1 av denne protokollen, er det viktig å trekke det gjennom riktig gauge nåler. For menneskelig blod samling via venepunksjon fra samtykkende voksne givere, dette kan oppnås med en 21 G blod samling sett (oppført i tabellen av materialer). Når blodet er trukket og PRP er isolert, kan det lagres ved romtemperatur for opp til 6 timer på benken eller på en langsom Rotisserie.

Hvis sentrifuger som brukes til å isolere PRP kan bremse ved forskjellige hastigheter er det best å velge en langsom brems for å minimere forstyrrelse av PRP lag og anvendelse av unødvendig kraft. Når PRP er isolert eller celletypen av interesse er i væske suspensjon, unngå å pipettering blandinger for fort. I stedet aspirer og utvise prøver på en langsom og stødig måte, spesielt i trinn 2,5, der prøven trekkes gjennom en spesielt smal pipette spissen. For prøve volumer som nøyaktig kan Pipet tert via pipette tips av forskjellige størrelser, er det tilrådelig å bruke den største blant dem. For spesielt følsomme eller tyktflytende prøver kan enden av dråpe spissen kuttes i en vinkel for å utvide åpningen som prøven skal trekkes gjennom.

Mange analyser som tester effekten av skjær på mobilnettet mechanosensation stole på en interaksjon mellom en forankret ligand og dens reseptor. Materialer og strømnings kamre er et slikt eksempel, der samspillet mellom en forankret ligand og en reseptor, vanligvis på en celle i løsningen, kan observeres i sanntid7,8. Andre teknikker bruker mikroskopi til å oppdage hendelser som oppstår i grensesnittet mellom et celle lag og det underliggende underlaget eller sonde9. Disse teknikkene har blitt brukt til spesielt stor effekt i å studere blodlegemer i omløp. På den annen side, teknikker som gjør at avhør av hendelser som oppstår helt i løsning underflyt er mer begrenset. For generell anvendelse av makt i løsningen, virvlingen en prøve kan tjene som en "rask og skitten"-metoden. Det er imidlertid vanskelig å fastslå presis kraft brukt, og skjær er ikke sikker på å følge av laminær flyt. Dette er en av fordelene med uniform skjær analysen. På den annen side er det uniform skjær analysen primære ulempen er en tidsforskjell mellom programmet skjær og observere cellene selv. Skjær brukes, så cellene er farget og fast, men Imaging teknikker kan ikke observere cellene under skjær prosessen selv. En tilpasning av denne metoden ville innebære å legge til cellene direkte til ønsket markører og klipping med markører stede. Dette vil tillate umiddelbar påvisning av eventuelle forbigående effekter.

Så langt har vi søkt denne analysen for å oppdage skjær avhengig in-løsning effekt av antistoffer rettet mot GPIb-IX kompleks. Mens Antistoffene gir en praktisk, enkel, divalent bindende partner, er det logisk å anta at Cross Linking av mechanoreceptors på motstridende celler i sirkulasjon kan oppnås via utallige multivalent ligander med tilstrekkelig høy unbinding Styrker. Denne teknikken kan være nyttig i fremtiden i å oppdage de spesifikke virkningene av slike ligander. I tillegg kan uniform skjær analysen brukes sammen med Imaging teknikker som ikke er beskrevet her som standard fluorescens mikroskopi. Til syvende og sist, uniform skjær analysen gir en rimelig billig, kvantitativ, og spesifikk metode for å anvende laminær skjær til celler og celle fragmenter i løsningen, og kan brukes oppstrøms av mange oppdagelsen metoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Arbeid relevant for denne studien ble støttet delvis av National Institutes of Health (NIH) National Heart, Lung, og Blood Institute tilskudd HL082808, HL123984 (R.L.), og F31HL134241 (M.E.Q.). Finansiering også levert av NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); og pilot stipend midler fra Children ' s Healthcare av Atlanta og Emory University pediatric Flow flowcytometri Core. Forfatterne vil gjerne takke Dr. hans Deckmyn for deling av 6B4 antistoff, og Emory Children ' s pediatric Research Center Flow flowcytometri Core for teknisk støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
En uniform Shear analysen for humant blodplater og Cell Surface reseptorer via Cone-plate Viskosimetri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter