Summary
Nós descrevemos um método da em-solução para aplicar a tesoura uniforme aos receptores de superfície da plaqueta usando o viscometry da cone-placa. Esse método também pode ser usado de forma mais ampla para aplicar cisalhamento a outros tipos de células e fragmentos de células e não precisa direcionar um par de receptor de ligante específico.
Abstract
Muitas células/tecidos biológicos sentem as propriedades mecânicas de seus ambientes locais através de mecanoreceptors, proteínas que podem responder a forças como pressão ou perturbações mecânicas. Os mechanoreceptors detectam seus estímulos e transmitem sinais através de uma grande diversidade de mecanismos. Alguns dos papéis os mais comuns para mecanorreceptores estão em respostas neuronal, como o toque e a dor, ou as pilhas de cabelo que funcionam no contrapeso e na audição. O mechanosensation é igualmente importante para os tipos da pilha que são expostos regularmente ao esforço de cisalhamento tal como pilhas endothelial, que alinham os vasos sanguíneos, ou as pilhas de sangue que experimentam a tesoura na circulação normal. Os viscometers são dispositivos que detectam a viscosidade dos líquidos. Os Viscosímetros rotatórios podem igualmente ser usados para aplicar uma força de tesoura conhecida aos líquidos. A capacidade destes instrumentos para introduzir a tesoura uniforme aos líquidos foi explorada para estudar muitos líquidos biológicos que incluem o sangue e o plasma. O viscometry pode igualmente ser usado para aplicar a tesoura às pilhas em uma solução, e para testar os efeitos da tesoura em pares específicos do ligand-receptor. Aqui, utilizamos o viscosimetria da cone-placa para testar os efeitos de níveis endógenos de tensão de cisalhamento em plaquetas tratadas com anticorpos contra o complexo do receptor mecanosensorial plaquetária GPIB-IX.
Introduction
Os mecanoreceptores são proteínas que respondem a estímulos mecânicos, como pressão ou perturbação mecânica/deformação. Para alguns mecanoreceptores, a detecção dessas perturbações mecânicas é explícita à função dos tipos de células em que são expressas. Tome, por exemplo, os receptores do estiramento em neurônios do barorreceptor; Estas canaletas mechanosensitive do íon regulam a pressão sanguínea detectando o "estiramento vascular"1,2. Na orelha interna, os canais iônicos nas células ciliadas detectam deformações mecânicas causadas por ondas sonoras3, e os mecanoreceptores cutâneos de baixo limiar (ltmrs) facilitam a transmissão da informação tátil4. Em outros casos, os mecanorreceptores fornecem a informação importante à pilha para o estabelecimento da adesão ou do crescimento. As pilhas podem sentir a rigidez de seu ambiente local, e podem confiar em forças contrátil através do citoesqueleto e das integrinas do actina para ditar o crescimento ou a propagação5,6.
Ao estudar as interações receptor-ligante em modelos celulares ou tecidos, existem ensaios comuns que podem relatar com rapidez e precisão os efeitos da alteração da temperatura, pH, concentração de ligantes, tonicidade, potencial de membrana e muitos outros parâmetros que pode variar in vivo. No entanto, esses mesmos ensaios podem ficar curtos quando se trata de detectar a contribuição da força mecânica para a ativação do receptor. Se as células estão sentindo seu microambiente, detectando ondas sonoras, ou respondendo a esticar, uma coisa que os mecanoreceptores acima mencionados têm em comum é que eles estão participando de interações onde o ligand, receptor, ou ambos, estão ancorados a um Superfície. Os ensaios desenvolvidos para testar os efeitos das forças mecânicas nas interações dos receptores freqüentemente refletem esse paradigma. Microfluínicos e câmaras de fluxo são usados para estudar os efeitos do fluxo de cisalhamento em células e receptores7,8. Estes tipos de experimentos têm a vantagem de permitir o ajuste fino das taxas de cisalhamento através de velocidades de fluxo estabelecidas. Outras técnicas empregam sondas moleculares fluorescentes para detectar forças aplicadas pelas células em superfícies ricas em ligantes, produzindo uma leitura acurada da magnitude e orientações das forças envolvidas na interação9,10.
Além do que o mechanosensation que ocorre onde um ou ambos os sócios são ancorados a uma superfície, a tensão de cisalhamento pode afetar proteínas e pilhas na solução. Isto é muitas vezes observado em células sanguíneas/proteínas que estão constantemente na circulação, e pode manifestar-se através da ativação de mecanoreceptors que normalmente são ancorados na superfície11, ou através da exposição de sequências-alvo que seriam fechadas condições estáticas12. No entanto, relativamente menos técnicas de ensaio os efeitos da força de cisalhamento sobre as partículas em solução. Algumas abordagens em solução introduzem cisalhamento através de células vortexing em suspensão fluida com velocidades e durações variadas, embora essas abordagens não permitam uma determinação muito precisa do estresse de cisalhamento gerado. Os Viscosímetros rotatórios medem a viscosidade aplicando uma força de tesoura específica aos líquidos. Nisto nós descrevemos um método aplicado para determinar o efeito de taxas laminar específicas da tesoura em pilhas ou em fragmentos da pilha na solução.
Uma das proteínas mais altamente expressas na superfície plaquetária é o complexo de glicoproteína (GP) IB-IX. O GPIb-IX é o principal receptor da proteína plasmática de von Willebrand factor (fvw). Junto, este par do receptor-ligand tem sido reconhecido por muito tempo como a Fundação da resposta da plaqueta ao esforço de cisalhamento13. Em caso de dano vascular, o fvw se liga ao colágeno exposto na matriz subendotelial14, recrutando assim plaquetas para o local de lesão por meio da interação VWF-GPIB-IX. Engajamento do VWF em seu local de ligação na subunidade GPIbα se GPIb-IX estresse fisiológico de cisalhamento induz o desdobramento de um domínio mecanosensorial membrana-proximal (MSD) que, por sua vez, ativa o GPIb-IX15. Em um estudo recente, nós mostramos que os anticorpos de encontro a GPIbα, como aqueles gerados em muitos pacientes do thrombocytopenia imune (ITP), são igualmente capazes de induzir a sinalização da plaqueta através do desdobramento de MSD o esforço de cisalhamento11. No entanto, diferentemente do fvw, que facilita a ativação do GPIb-IX induzida por cisalhamento ao imobilizar o complexo circulação normal, os anticorpos bivalentes são capazes de ligar as plaquetas através do GPIb-IX e desdobrar a MSD em circulação. Desta maneira, um Mecanorreceptor que seja ativado normalmente pela imobilização de superfície a tesoura pode ser ativado na solução. No presente relato, demonstraremos como um ensaio de cisalhamento uniforme baseado em viscosímetro foi aproveitado para detectar os efeitos de níveis específicos de estresse de cisalhamento na ativação do receptor em solução.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os métodos que utilizam plaquetas humanas derivadas de doadores aqui descritos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Emory University/Children ' s Healthcare of Atlanta.
1. tração do sangue e isolação da plaqueta
- Desenhe sangue humano de doadores adultos saudáveis consentantes via punção venosa no dia do experimento em 3,8% de citrato trisódico. Um tubo de 4,5 mL de sangue é suficiente para produzir bastante plasma rico em plaquetas (PRP) para 20-25 condições em doadores cujas contagens de plaquetas estão próximas de 250 x 103 por μl.
Nota: Evite extrair sangue através de agulhas de bitola estreita (inferior a 21 G). - Prepare o PRP através da centrifugação a 22 ° c e 140 x g durante 12 min com um travão longo. Isso resultará em duas camadas distintas, com glóbulos vermelhos na parte inferior e a luz colorida PRP na parte superior.
- Isole a camada superior, nebulosa, amarela de PRP através da pipetagem cuidadosa através de uma ponta de pipeta cortada em um ângulo de 45 ° e obtenha a contagem de plaqueta através de uma contagem sanguínea completa (CBC).
- Se necessário, lave as plaquetas em soro fisiológico tamponado com tubos (150 mM NaCl, tubos de 20 mM) na presença de prostaglandina E1 (PGE1) e ressuscita no tampão de Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCl, 1 mM MgCl2,5mm glucose, 12 mm NaHCO 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) com 5 mm de glicose, caso contrário, avance para o passo 1,5. As etapas a seguir descrevem a lavagem em breve.
- Ajuste o volume PRP para 10 mL com solução salina tamponada por tubos e adicione 0,6 μM PGE1.
- Centrifugador por 8 min a 1.900 x g, em seguida, descarte o sobrenadante e deixe o pellet plaquetário sentar-se em 400 μL de solução de Tyrode e glicose por 5 min.
- Ressuspender suavemente a pastilha plaquetária e mantê-la intacta por 30 min.
- Ajuste a contagem de plaquetas para ~ 250 x 103 plaquetas por μl com plasma plaquetário humano pobre em agregados (PPP) e mantenha a suspensão a 22 ° c sem perturbações ou rotação suave.
2. ligand e tratamento uniforme da tesoura
Nota: todos os passos na secção 2 que necessitam de pipetagem devem ser feitos lentamente, de modo a não introduzir qualquer cisalhamento.
- Adicione o anticorpo ou ligante desejado ao PRP ou as plaquetas lavadas e misture suavemente pipetando para cima e para baixo ou mexendo com uma ponta de pipeta. Deixe-o não perturbado à temperatura ambiente por 5-10 min. Adicione um volume equivalente de PPP ou buffer de Tyrode a um controle negativo.
- Gire sobre o viscosímetro da cone-placa, ajuste a temperatura da placa a 22 ° c e deixe a hora de deixar a placa alcangar esta temperatura.
- Pipete o PRP Tratado ou as plaquetas lavadas no viscosímetro de placa de cone com temperatura controlada diretamente no centro da placa. Assegure-se de que toda a amostra esteja depositada entre o cone e a placa no ponto do contato, e não na parte externa da borda do cone.
- Cisalhamento a uma taxa e duração apropriadas.
- Calcule o cisalhamento como indicado pelo manual do viscosímetro, ou como mostrado anteriormente15,16.
- Determine a taxa da tesoura da viscosidade e do esforço de cisalhamento desejado através da lei de Newton da viscosidade;
; a viscosidade plasmática é de 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Por exemplo, uma escala normal da tesoura para a circulação humana é 5-30 dyn/cm2 e a tesoura deve ser aplicada na escala de tempo do minuto do único dígito.
- Levante o cone da placa com um pouco de comprimento (~ 2 mm) para que a amostra permaneça em contacto com a placa e o cone, e utilize uma ponta de pipeta longa ou de carga de gel para recolher 5-10 μL do centro do volume da amostra.
- Incubar as amostras cortadas com os marcadores desejados durante 20 min à temperatura ambiente. Para os marcadores de fosfatidilserina, β-galactose, e P-Selectin exposição uso lactadherin C2 domínio (LactC2) em 0, 8 μm18, Erythrina Erythrina lectina (ECL) em 6,25 μg/ml, e anti-p-Selectin anticorpo (20 μg/ml), respectivamente.
- Fixar amostras em 2% paraformaldeído durante 20 min em RT antes da diluição ou armazenamento a frio, e proceder à etapa 3,1 ou armazenar amostras a 4 ° c por não mais de 12 h.
; a viscosidade plasmática é de 1,5-1,6 centipoise (cP)17. Por exemplo, uma escala normal da tesoura para a circulação humana é 5-30 dyn/cm2 e a tesoura deve ser aplicada na escala de tempo do minuto do único dígito.3. detecção de marcadores de superfície e reticulação via citometria de fluxo
- Analise a amostra via citometria de fluxo, coletando pelo menos 20.000 eventos para cada condição.
- Quantificar a intensidade do sinal dos marcadores fluorescentes utilizando o valor de altura para a intensidade de cada fluoróforo, ou a média geométrica de fluorescência (MFI).
- Se com o objetivo de detectar a reticulação plaquetária após o tratamento de cisalhamento, analise a amostra em um citometro de fluxo capaz de imagem e quantificar reticulação por parâmetros de área e proporção.
- Plotar um histograma de área e/ou proporção.
- Use um controle negativo com albumina sérica bovina (BSA) ou veículo para desenhar um portão excluindo os eventos mais totalmente circulares (este portão é geralmente desenhado em uma relação de aspecto ~ 0,819,20) e quantificar a percentagem de eventos dentro deste portão. Eventos com uma taxa de proporção mais baixa são mais propensos a ser reticulado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1 descreve como o modelo de gatilho da ativação do GPIB-IX, inicialmente introduzido para explicar a ativação do receptor dependente de cisalhamento quando ancorado na parede do vaso, também pode suportar a ativação de plaquetas reticuladas por um ligante multivalente. A Figura 2 mostra leituras de Ativação plaquetária humana tratadas por dois anticorpos direcionados ao domínio N-terminal de GPIB-IX (6b4 e 11A8) e um anticorpo controle (IgG normal) condições de cisalhamento e estática. Na Figura 3, as plaquetas foram tratadas com 6B4 e um anticorpo com força desvinculante muito baixa para desencadear a ativação do GPIB-IX, AK2. A Figura 4 mostra um curso de tempo. Os marcadores de Ativação plaquetária foram sonados e detectados em pontos de tempo progressivos durante o tratamento de cisalhamento com 11A8 ou AK2. Na Figura 5a, o anticorpo que reticulação plaqueta-tamanho grânulos decorado com o domínio do N-terminal de GPIB-IX foi analisado através da citometria de fluxo convencional. Figura 5 b mostra a reticulação mediada por 6B4 de plaquetas como imaged via citometria de fluxo de imagem. Na Figura 6, foram utilizadas amostras clínicas de soro de pacientes com trombocitopenia imune em lugar dos anticorpos monoclonais divalentes contra o GPIB-IX utilizados em figuras anteriores. Os anticorpos contendo plasma do paciente contra o GPIb-IX desencadearam respostas dependentes de cisalhamento, em contraste com o plasma de pacientes com ITP sem anticorpos direcionados ao GPIb-IX.
Figura 1 : O mecanoreceptor de superfície plaquetária GPIb-IX pode ligar um ligante divalente solúvel (como um anticorpo). Quando dois complexos GPIb-IX em plaquetas opostas se ligam ao mesmo ligador divalente, ocorre reticulação. cisalhamento fisiológico, as plaquetas reticuladas podem gerar uma força de tração para atuar no GPIb-IX e desdobrar o MSD nele. Como consequência do desdobramento da MSD, o GPIb-IX é ativado e induz a sinalização plaquetária e a depuração plaquetária a jusante, conforme ilustrado. A figura foi adaptada de Quach et al.21por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Expressão de marcadores de Ativação plaquetária em PRP humano tratados com controle de anticorpos IgG ou anti-GPIB-IX 11a8 e 6b4 condições estáticas ou cortado (30 dyn/cm2). Nestes resultados representativos, a exposição de superfície da plaqueta da fosfatidilserina (picosegundo), β-galactose, e P-Selectin foi sonada pela proteína fluorescente verde (GFP)-LACT-C2 conjugado, FITC-Conjugado Erythrina Erythrina lectina (ECL) e APC-conjugated anticorpos anti-P-Selectin, respetivamente. A fluorescência foi detectada através da citometria de fluxo. Os dados são expressos em porcentagem de eventos com fluorescência acima do controle negativo. p ≤ 0, 1, * * * * p ≤ 0, 1; significância determinada através do teste tde Student. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : PRP humano tratado com dois anticorpos anti-GPIb-IX. O PRP humano tratou com os dois anticorpos de anti-GPIB-IX, um com força desvinculação elevada (6b4) e um com baixa força desvinculação (AK2) a estática (0 dyn/cm2), baixo cisalhamento (5 dyn/cm2), e alto cisalhamento (30 dyn/cm2) condições. Os gráficos mostram a porcentagem de eventos positivos para a expressão superficial de β-galactose, PS e P-Selectin. * p ≤ 0, 5, * * * p ≤ 0, 1. A significância foi determinada por meio de ANOVA unidirecional com teste de Tukey. As barras de erro representam SD. a figura foi adaptada de Quach et al.11por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Tempo de exposição ao cisalhamento (20 dyn/cm2) para PRP humano tratado com controle IgG, 11a8 ou AK2. A exposição superficial plaquetária de PS e P-Selectin foi detectada através de citometria de fluxo para amostras cortadas para 0, 0,5, 1, 3 e 5 min. * * * p ≤ 0, 1, * * * * p ≤ 0, 1. A significância foi determinada por meio de ANOVA unidirecional com teste de Tukey. As barras de erro representam SD. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Quantitando a reticulação por parâmetros de área e proporção. (a) grânulos de tamanho plaquetário (4 μm) foram conjugados com o domínio N-terminal de GPIbα e incubados com IgG (cinza), AK2 (vermelho) ou 6B4 (azul) condições de cisalhamento (20 dyn/cm2). São mostrados aqui as parcelas do contorno da dispersão para diante (FSC-A) contra A fluorescência do anticorpo do anti-rato. (b) histograma para relação de aspecto de plaquetas em PRP incubada com 6b4 e anticorpos CD41 (marcador plaquetário) com rótulo cDNAs cisalhamento. Imagens representativas em várias proporções são mostradas. A figura foi adaptada de Quach et al.11por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : As amostras clínicas do soro dos pacientes com thrombocytopenia imune foram usadas no lugar dos anticorpos monoclonais divalentes de encontro a GPIb-IX. (a) capacidade de ligação GPIB-IX do plasma de doentes com ITP, ensaiadas através de ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA). (b) plaquetas humanas lavadas reconstituídas no plasma paciente do ITP condições estáticas e cortado (30 dyn/cm2). Os gráficos mostram a porcentagem de eventos positivos para a expressão de superfície de P-Selectin ou PS. * * * * p ≤ 0, 1. A significância foi determinada por meio de ANOVA One-Way com teste de Tukey. As barras de erro representam SD. a figura foi adaptada de Quach et al.11por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O protocolo descrito neste manuscrito permite uma avaliação rápida e versátil do efeito da cisalhamento laminar nos receptores de plaquetas e de superfície celular. Os resultados representativos específicos aqui apresentados sublinham como os efeitos dos ligantes multiméricos ou bivalentes podem ser afetados pelo fluxo de cisalhamento. Além desta aplicação, um ensaio de cisalhamento uniforme tem amplas aplicações na observação de efeitos de cisalhamento-dependentes. Na ausência de um par conhecido do ligante-receptor, um ensaio uniforme da tesoura pode igualmente detectar os efeitos da tesoura em fatores tais como a forma e a sinalização da pilha, especial quando emparelhado com análises cytometric do do fluxo. Aludido em parte pela Figura 5b, um ensaio de cisalhamento uniforme presta-se a uma ampla variedade de métodos de detecção que não seja ou em complemento às análises citométricas de fluxo padrão descritas neste protocolo, incluindo imagens, bioquímicas e baseadas em células Ensaios.
A Figura 2 exemplifica a aplicação básica do ensaio, especificamente para discriminar entre uma interação ligante-receptor dependente de cisalhamento e um controle negativo. 6B4, um anticorpo que é capaz de reticulação de plaquetas através da ligação aos receptores GPIb-IX e sustentar força suficiente para ativar o receptor11, ativa as plaquetas quando exposto a cisalhamento (representado no modelo na Figura 1), ao contrário do IgG de controlo que não liga a plaqueta GPIb-IX. Esta aplicação fornece simultaneamente a evidência que o efeito é específico ao par receptor-ligand escolhido e é dependente da tesoura. O ensaio de cisalhamento uniforme também pode distinguir entre os efeitos dos ligantes que podem e não conseguem sustentar suas ligações a um receptor níveis de cisalhamento específicos. Na Figura 3, vemos a falta de leitura de sinalização do anticorpo anti-GPIB-IX AK2, que vincula seu epítopo com uma força de desvinculação particularmente fraca11. Este valor também demonstra os efeitos da variação do nível de tensão de cisalhamento aplicado pelo viscosímetro de placa de cone de um cisalhamento baixo a alto.
A Figura 4 demonstra que este ensaio pode ser usado para modular o comprimento da exposição ao cisalhamento e sugere uma estratégia para exibir esses dados. Na Figura 5, são utilizados dois leituras baseados em fluxo-citometria alternativos para o ensaio, ambos não dependem de marcadores fluorescentes de ativação do receptor, mas podem ser usados para descrever a reticulação e a mudança de tamanho/forma. Figura 5 b mostra como dispersão para a frente, que aumenta proporcional ao tamanho de um evento, pode distinguir entre populações distintas de desvinculados (singlet), dúvida, Triplet, ou maior multiplet reticulado eventos. Como na Figura 5b, o ensaio pode ser aplicado em grânulos conjugados a um receptor de interesse, o que elimina a possibilidade de outros receptores participarem dos eventos de reticulação observados através de outros métodos. Na Figura 6, o plasma, um fluido biológico contendo potenciais ligantes para o nosso receptor de interesse é usado no lugar de anticorpos monoclonais purificados. Isso ilustra um aplicativo no qual um ligante conhecido específico ou parceiro vinculativo para um receptor de interesse pode não ser necessário.
Embora o ensaio seja razoavelmente acessível como escrito, há algumas etapas chaves que devem ser executadas com cuidado. Mais importante entre estes é ter cuidado para não introduzir cisalhamento de fontes externas que não seja o tratamento de cisalhamento propriamente dito. Ao extrair o sangue, como mencionado na etapa 1,1 deste protocolo, é importante desenhá-lo através de agulhas de calibre apropriadas. Para a coleta de sangue humano via punção venosa de doadores adultos consentantes, isso pode ser realizado com um conjunto de coleta de sangue de 21 G (listado na tabela de materiais). Uma vez que o sangue é desenhado e PRP é isolado, ele pode ser armazenado em temperatura ambiente para até 6 h no banco ou em um Rotisserie lento.
Se o centrifugador usado para isolar PRP pode travar em velocidades diferentes é o melhor escolher um freio lento para minimizar a violação da camada de PRP e a aplicação da força desnecessária. Uma vez que o PRP é isolado ou o tipo de célula de interesse está em suspensão de fluido, evite Pipetar as misturas muito rapidamente. Em vez disso, aspirar e expelir amostras de forma lenta e constante, especialmente durante a etapa 2,5, onde a amostra é desenhada através de uma ponteira de pipeta particularmente estreita. Para os volumes da amostra que podem com precisão ser pipetado através das pontas da pipeta de tamanhos diferentes, é aconselhável usar o maior entre eles. Para amostras especialmente sensíveis ou viscosas, a extremidade da ponta da pipeta pode ser cortada em um ângulo para ampliar a abertura através da qual a amostra deve ser desenhada.
Muitos ensaios que testam o efeito da tesoura na mecanosensação celular dependem de uma interação entre um ligante ancorado e seu receptor. Microfluínicos e câmaras de fluxo são um exemplo, onde a interação entre um ligante ancorado e um receptor, geralmente em uma célula em solução, pode ser observada em tempo real7,8. Outras técnicas utilizam microscopia para detectar eventos que ocorrem na interface entre uma camada celular e o substrato subjacente ou sonda9. Estas técnicas têm sido usadas para particularmente grande efeito no estudo de células sanguíneas em circulação. Por outro lado, as técnicas que permitem a interrogação de eventos que ocorrem inteiramente em solução fluxo são mais limitadas. Para a aplicação genérica da força na solução, vortexing uma amostra pode servir como um método "rápido e sujo". Entretanto, é difícil determinar a força exata aplicada, e a tesoura não é certa resultar do fluxo laminar. Esta é uma das vantagens do ensaio de cisalhamento uniforme. Por outro lado, a desvantagem primária do ensaio de cisalhamento uniforme é uma lacuna de tempo entre a aplicação de cisalhamento e observando as próprias células. A tesoura é aplicada, então as células são manchadas e fixas, mas as técnicas de imagem não podem observar as células durante o processo de cisalhamento propriamente dito. Uma adaptação desse método envolveria a adição das células diretamente aos marcadores desejados e o cisalhamento com os marcadores presentes. Isso permitiria a detecção imediata de quaisquer efeitos transitórios.
Até o momento, aplicamos este ensaio para detectar o efeito da solução de cisalhamento dependente de anticorpos direcionados ao complexo GPIb-IX. Quando os anticorpos fornecerem um sócio vinculativo conveniente, simples, divalentes, é lógico supor que a reticulação dos mecanorreceptores em pilhas de oposição na circulação pode ser conseguida através dos ligantes multivalentes da miríade com suficientemente elevado desvinculação Forças. Esta técnica pode ser útil no futuro em detectar os efeitos específicos de tais ligands. Adicionalmente, o ensaio uniforme da tesoura pode ser usado conjuntamente com as técnicas da imagem latente não descritas nisto tais como a microscopia de fluorescência padrão. Em última análise, o ensaio de cisalhamento uniforme fornece um método razoavelmente barato, quantitativo e específico para a aplicação de cisalhamento laminar a células e fragmentos celulares em solução, e pode ser usado a montante de muitos métodos de detecção.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O trabalho pertinente a este estudo foi apoiado em parte pelos institutos nacionais de saúde (NIH) National Heart, Lung e Blood Institute concede HL082808, HL123984 (R.L.), e F31HL134241 (M.E.Q.). Financiamento também fornecido pelo NIH National Institute of General Medical Sciences Grant T32GM008367 (M.E.Q.); e fundos de subvenção piloto da Children ' s Healthcare de Atlanta e Emory Universidade pediátrica fluxo cytometry Core. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Hans Deckmyn por compartilhar o anticorpo 6B4 e o núcleo de citometria de fluxo pediátrico do Emory Children ' s Center para suporte técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD62P (P-Selectin) | BioLegend | 304910 | |
| Brookfield Cap 2000+ Viscometer | Brookfield | - | |
| FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) | Vector Labs | FL-1141 | |
| Pooled Normal Human Plasma | Precision Biologic | CCN-10 | |
| Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) | BD | 369714 | |
| Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle | BD | 367287 |
References
- Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80 (6), 861-867 (1997).
- Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325 (6107), 811-813 (1987).
- Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
- Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346 (6212), 950-954 (2014).
- Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (33), 11594-11599 (2005).
- Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (51), 20585-20590 (2011).
- Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9 (1), 4301 (2018).
- Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
- Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15 (2), 115-118 (2018).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
- Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131 (7), 787-796 (2018).
- Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105 (21), 7416-7421 (2008).
- Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).
- Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262 (28), 13835-13841 (1987).
- Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
- Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87 (4), 1234-1240 (1991).
- Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. , Springer Science, Business Media. (2010).
- Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (12), 2155-2162 (2013).
- Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (6), 379-389 (2013).
- Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27 (3), 653-670 (2007).
- Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131 (14), 1512-1521 (2018).
