Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil

doi: 10.3791/59704 Published: June 5, 2019

Summary

Koni plaka Viskozimetre kullanılarak trombosit yüzey reseptörlerine Tekdüzen kesme uygulamak için bir çözüm içi yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, diğer hücre türlerine ve hücre parçalara kesme uygulamak için daha geniş ölçüde kullanılabilir ve belirli bir ligand-reseptör çifti hedeflemek gerekmez.

Abstract

Pek çok biyolojik hücre/doku, mekanik özellikleri, basınç veya mekanik pertürasyonlar gibi kuvvetlere yanıt verebilecek proteinler yoluyla yerel ortamlarının mekanik özelliklerini ifade ederler. Makinoreceptors onların uyaranlara algılar ve mekanizmaları büyük bir çeşitlilik yoluyla sinyalleri iletir. Makinoreceptors için en yaygın rollerden bazıları, dokunma ve ağrı gibi nöronal tepkiler, ya da denge ve işitme fonksiyonu saç hücreleri vardır. Mechanosensation aynı zamanda normal sirkülasyonda kesme deneyimi hangi hat kan damarları, ya da kan hücreleri gibi endotel hücreleri olarak kesme stresine düzenli olarak maruz hücre türleri için önemlidir. Viskozimetre, sıvıların viskozitesini algılayan cihazlardır. Rotasyonel viskozimetreler, sıvılara bilinen bir kesme kuvveti uygulamak için de kullanılabilir. Bu enstrümanlar sıvılara üniforma kesme tanıtmak için yeteneği kan ve plazma dahil olmak üzere birçok biyolojik sıvılar çalışmak için sömürülüyor. Viskozimetre Ayrıca bir çözelti hücrelerine kesme uygulamak ve belirli ligand-reseptör çiftleri üzerinde kesme etkilerini sınamak için kullanılabilir. Burada, trombosit mechanoduyusal reseptör kompleksi GPIb-IX karşı antikorlar ile tedavi trombositler üzerinde kesme stres endojen düzeylerinin etkilerini sınamak için koni-plaka viskozimetresi kullanıyoruz.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mekanik uyarıcı, basınç veya mekanik Persleme/deformasyon gibi teknik uyaranlara yanıt veren proteinlerdir. Bazı mekaniği için, bu mekanik perturbations algılama onlar ifade edilir hücre türlerinin işlevine açık. Örneğin, baroreseptör nöronların streç reseptörleri alın; Bu mechanosensitive iyon kanalları vasküler algılayarak kan basıncını düzenleyen "Stretch"1,2. İç kulak, saç hücrelerinde iyon kanalları ses dalgaları3neden mekanik deformasyonlar algılar ve kutanöz düşük eşik mekanoreseptörler (ltmrs) dokunsal bilgi iletimi kolaylaştırır4. Diğer durumlarda, makinoreceptors yapışma veya büyüme kurulması için hücreye önemli bilgiler sağlar. Hücreler kendi yerel ortamının sertlik hissi ve büyüme veya yayılma dikte etmek için aktin siterit ve integrinler aracılığıyla kontril güçler güvenebilirsiniz5,6.

Hücre veya doku tabanlı modellerde reseptör-ligand etkileşimleri okurken, sıcaklık, pH, ligand konsantrasyonu, tonisite, membran potansiyeli ve diğer birçok parametre değiştirme etkilerini hızlı ve doğru bir şekilde raporlayabilen ortak özellikler var Hangi içinde vivo değişebilir. Bununla birlikte, mekanik gücün reseptör aktivasyonuna katkısı tespit etmek için söz konusu olduğunda bu aynı destek kısa düşebilir. Hücrelerin mikro ortamlarını algılayıp, ses dalgaları algılanmasını veya gerdirmek için yanıt verdiğini, yukarıda bahsedilen mekanik iletkenlerin ortak olduğu bir şey, ligand, reseptör veya her iki kişinin de bağlantılı olduğu etkileşimlere katıldıkları Yüzey. Mekanik kuvvetlerin reseptör etkileşimlerinde etkilerini test etmek için geliştirilen testler genellikle bu paradigmasını yansıtır. Microfluidics ve akış odaları hücreleri ve reseptörleri üzerinde kesme akışının etkilerini incelemek için kullanılan7,8. Bu tür deneyler, kurulan akış hızları aracılığıyla kesme oranlarının ince ayarlarına izin verme avantajına sahiptir. Diğer teknikler, ligand zengini yüzeylerdeki hücreler tarafından uygulanan güçleri algılamak için floresan moleküler problar kullanırlar, etkileşiminde yer alan güçlerin büyüklüğü ve oryantasyonlarını doğru bir şekilde okuyabilmektedir9,10.

Bir veya her iki ortağın bir yüzeye sabitlendiği mekanosensation ek olarak, kesme stres çözeltisindeki proteinleri ve hücreleri etkileyebilir. Bu genellikle sürekli sirkülasyonda olan kan hücrelerinde/proteinlerde gözlenen, ve normalde yüzey-bağlantılı olan mekanoreseptörler aktivasyonu ile tezahür edebilir11, veya altında okcluded olacak hedef sıraları maruz kalma yoluyla statik koşullar12. Ancak, nispeten daha az teknikler çözelti parçacıkları üzerinde kesme kuvveti etkilerini tahlil. Bazı çözelti yaklaşımlar değişen hızları ve süreleri ile sıvı süspansiyonu hücrelerde vortekslenir yoluyla kesme tanıtmak, bu yaklaşımlar oluşturulan kesme stres çok kesin bir belirlenmesi izin vermeyebilir rağmen. Rotasyonel viskoziteler, sıvılara belirli bir kesme kuvveti uygulayarak viskozitesi ölçer. Burada, belirli laminar kesme oranlarının hücrelerde veya hücre parçacıklarının çözümdeki etkisini belirlemek için uygulanan bir yöntem açıklanmaktadır.

Trombosit yüzeyinde en çok ifade edilen proteinlerden biri de glikoprotein (GP) IB-IX kompleksidir. GPIB-IX, plazma proteininin Von Willebrand factor (VWF) için birincil reseptörüdür. Birlikte, bu reseptör-ligand çifti uzun kesme stres13trombosit tepkisi temeli olarak tanınmıştır. Vasküler hasar durumunda, VWF alt endotel matriks14içinde maruz kollajen bağlar, böylece VWF-GPIB-IX etkileşimi yoluyla yaralanma siteye trombosit işe. VWF, gpibα altbirim 'teki bağlayıcı sitesine GPIB-IX fizyolojik kesme stres altında ise, bir membran-proksimal mechanosensory alan (MSD) açılırsa, bu da GPIB-IX15' i aktive eder. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, birçok Bağışıklık trombositopeni (ıTP) hastalarında oluşturulan gibi, GPIbα karşı antikorların, aynı zamanda kayma stres altında unfolding MSD üzerinden trombosit sinyalizasyon inducing yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir11. Ancak, VWF aksine, hangi normal dolaşım altında kompleks immobilizing tarafından kesme kaynaklı GPIB-IX aktivasyon kolaylaştırır, iki bivalent antikorlar GPIB-IX üzerinden trombosit Crosslink edebiliyoruz ve dolaşım MSD açın. Bu şekilde, normalde kesme altında yüzey immobilizasyonu ile aktive olan bir mekaniği solüsyonda aktive edilebilir. Bu raporda, biz bir Viskozimetre tabanlı üniforma kesme tahlil çözeltisi reseptör aktivasyonu üzerinde kesme stres belirli düzeylerinin etkilerini algılamak için nasıl yararlanıldı gösterecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan donör türevi insan trombositleri kullanan tüm yöntemler, Emory University/Atlanta çocuk sağlık hizmetleri kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. kan çekme ve trombosit Izolasyonu

  1. % 3,8 Trisodyum sitrat içine deney gününde damara yoluyla sağlıklı yetişkin bağışçılar rızası olan yetişkinlere insan kanı çizin. Bir 4,5 mL tüp kan, trombosit sayısı 250 x 103 Ile μL başına yakın olan bağışçılardan 20-25 için yeterli trombosit zengin plazma (PRP) vermek için yeterlidir.
    Not: dar ölçer iğneleri (21 G 'den küçük) ile kan çizmeyi önleyin.
  2. 22 °C ' de santrifüjleme ile PRP hazırlayın ve uzun fren ile 12 dakika 140 x g . Bu iki farklı katmanla sonuçlanır, altta kırmızı kan hücreleri ve üstte açık renkli PRP ile.
  3. 45 ° açıda kesilmiş bir pipet ucu ile dikkatli pipetleme yoluyla PRP 'nin üst, bulutlu, sarı tabakasını izole edin ve tam bir kan sayımı (CBC) yoluyla trombosit sayısını elde et.
  4. Gerekirse, boru-tamponlu tuz (150 mM NaCl, 20 mM borular) içinde Prostaglandin E1 (PGE1) ve Tyrode tampon (134 mM NaCl, 0,34 mM na2HPO4, 2,9 mm KCL, 1 mM MgCl2,5mm glikoz, 12 mm NaHCO varlığında yıkama trombosit 3, 20 mm HEPES, pH 7,35) 5 mm glikoz, aksi takdirde, adım 1,5 devam edin. Aşağıdaki adımlarda kısa yıkama açıklanmaktadır.
    1. Boru tamponlu tuz ile 10 mL PRP hacmi ayarlayın ve 0,6 μM PGE1 ekleyin.
    2. 1.900 x g'de 8 dakika santrifüjle, sonra süpernatant atın ve trombosit Pelet 5 dk için tyrode ve glikoz çözeltisi 400 μL oturmak izin.
    3. Trombosit Pelet yavaşça pelletini ve 30 dakika boyunca bozulmamış tutmak.
  5. Trombosit sayısını ~ 250 x 103 trombositli, havuz altındaki insan trombosit-zayıf plazma (PPP) ile ayarlayın ve süspansiyonu 22 °c ' de bozulmamış veya nazik rotasyona karşı koruyun.

2. ligand ve uniform kesme tedavisi

Not: pipetleme gerektiren Bölüm 2 ' deki tüm adımlar, herhangi bir kesme sunmak için değil, yavaşça yapılmalıdır.

  1. İstenen antikor veya ligand PRP veya yıkanmış trombositler ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme veya bir pipet ucu ile karıştırma ile karıştırın. 5-10 dk için oda sıcaklığında rahat bırakın. negatif bir denetime PPP veya Tyrode arabelleğinin eşdeğer bir hacmi ekleyin.
  2. Koni-plaka viskozimetresi açın, plaka sıcaklığını 22 °C ' ye ayarlayın ve plakanın bu sıcaklığa ulaşmasını sağlamak için zamana izin verin.
  3. Tedavi edilen PRP veya yıkanan trombositleri, sıcaklık kontrollü koni-plaka viskoziteler üzerine doğrudan plakanın ortasına pipet. Tüm numunenin, konenin kenarının dışında değil, temas noktasında koni ve plaka arasında yatırılmasını sağlayın.
  4. Uygun bir oran ve süre içinde kesme.
    1. Viskozimetre Kılavuzu tarafından belirtildiği gibi veya daha önce15,16olarak gösterilen kesme hesaplayın.
    2. Newton 'un viskozite Kanunu ile Viskozitenin kesme hızını ve istenilen kesme stresini belirleyin; Equation 1; plazma viskozitesi 1,5-1.6 centipoise (cP)17' dir. Örneğin, insan dolaşımı için normal bir kesme aralığı 5-30 dyn/cm2 ve kesme tek basamaklı dakika zaman ölçeğinde uygulanmalıdır.
  5. Numunenin hem plaka hem de koni ile temas halinde kalması ve numune hacminin merkezinden 5-10 μL toplamak için bir jel yükleme veya diğer uzun pipet ucu kullanmak için, plakanın yerine (~ 2 mm) kadar koni kaldırın.
  6. Oda sıcaklığında 20 dakika için istenilen işaretçileri ile yamultulmuş numuneler inküye. Fosfatidilserin, β-galaktoz ve P-selectin pozlama belirteçleri için 0,08 μM18' de Lactadherin C2 etki alanı (LactC2), 6,25 μg/ml 'de Erythrina cristagalli Lekin (ECL) ve anti-P-selectin antikor (20 μg/ml) kullanılır.
  7. Seyreltme veya soğuk depodan önce RT 'de 20 dakika boyunca% 2 civarında formaldehite numunelerini düzeltin ve 3,1 adıma geçin veya 12 h 'den fazla olmayan 4 °c ' de örnekleri saklayın.

3. yüzey işaretçileri ve akış cytometri üzerinden çapraz tespiti

  1. Her koşul için en az 20.000 olaylar toplama, akış sitometri yoluyla örnek analiz edin.
  2. Her fluorophore yoğunluğu için yükseklik değeri veya geometrik ortalama floresan yoğunluğu (MFı) kullanarak floresan işaretçilerinin sinyal gücünü quantitate.
  3. Kesme tedavisini takiben trombosit çapraz algılamasını hedefliyorsanız, örnek bir görüntüleme özellikli akış sitometresi analiz ve bölge ve en boy oranı parametreleri ile çapraz bağlantı quantitate.
    1. Alan ve/veya en boy oranı bir histogram çizin.
    2. Sığır serum albümin (BSA) veya araç ile negatif bir kontrol kullanın (Bu kapı genellikle bir en boy oranı çizilir ~ 0,819,20) ve bu kapının içindeki olayların yüzdesini quantitate çoğu tam dairesel olaylar hariç bir kapı çizmek için. Daha düşük bir en boy oranı olan olaylar daha fazla çapraz bağlanması muhtemeldir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Şekil 1 nasıl GPIB-IX aktivasyonunun tetik modelinin, başlangıçta damar duvarına bağlı olarak kesme bağımlı reseptör aktivasyonunu açıklamak için nasıl tanıtıldığı özetlenmiştir, aynı zamanda multivalent ligand tarafından çapraz bağlı trombositlerin aktivasyonunu destekleyebilir. Şekil 2 , GPIB-IX (6b4 ve 11a8) ' in N-terminal alanını hedefleyen iki antikor tarafından tedavi edilen insan trombosit aktivasyonunun okumasını ve yamultulmuş ve statik koşullarda bir kontrol antikor (normal IgG) gösterir. Şekil 3' te, trombosit 6B4 ile tedavi edildi ve GPIB-IX aktivasyonunu tetiklemek için çok düşük bir bağlayıcı olmayan kuvvet ile bir ANTIKOR, AK2. Şekil 4 bir zaman kursu gösterir. Trombosit aktivasyonunun belirteçleri 11A8 veya AK2 ile kesme tedavisi sırasında Progressive zaman noktalarında probed ve tespit edildi. Şekil 5a'Da, GPıB-IX N-terminal alanı ile süslenmiş antikor çapraz bağlama trombosit ebatlı boncuklar geleneksel Akış sitometrisi yoluyla tespit edildi. Şekil 5 b , görüntüleme akışı sitometrisi ile görüntülenmiş olarak trombositlerin 6b4 aracılı çapraz gösterir. Şekil 6' da, önceki figürlerinde kullanılan GPIB-IX ' a karşı divalent monoklonal antikorların yerine Bağışıklık trombositopeni olan hastalarda serum klinik örnekleri kullanılmıştır. GPIb-IX ' e karşı hasta plazma içeren antikorlar, GPIb-IX ' i hedefleyen antikorsuz ıTP hastalarından plazma ile tersine, kayma bağımlı tepkiler tetiklenmiştir.

Figure 1
Şekil 1 : Trombosit yüzey mekanoreseptör GPIB-IX çözünebilir divalent ligand (antikor gibi) bağlayabilirsiniz. İki GPIB-IX kompleksler karşı trombosit aynı divalent ligand bağlamak, çapraz oluşur. Fizyolojik yırtılma altında, çapraz bağlı trombositler GPIB-IX üzerinde hareket etmek için bir çekme kuvveti oluşturabilir ve MSD 'yi orada açığa çıkarabilir. MSD 'nin açılmasının bir sonucu olarak, GPIB-IX etkinleşir ve gösterildiği gibi trombosit sinyalleme ve aşağı yukarı trombosit boşluğu indükler. Rakam QUACH ve al. 21 adapte edildiBu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2 : Statik veya yamultulmuş (30 dyn/cm2) koşullarında kontrol IgG veya anti-GPIB-IX antikorları 11a8 ve 6b4 ile tedavi edilen insan PRP 'de trombosit aktivasyonunun işaretlerinin ifadesi. Bu temsili sonuçlarında, Fosfatidilserin (PS), β-galaktoz ve P-Selectin trombosit yüzey pozlama yeşil floresan protein (GFP) tarafından probed edildi-konjuza LACT-C2, FITC-konjuza Erythrina cristagalli ıtrin (ECL) ve APC-konjugated Anti-P-Selectin antikor, sırasıyla. Floresans, Akış sitometrisi ile tespit edildi. Veriler, negatif kontrol üzerinde floresan olan olayların yüzdesi olarak ifade edilir. p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001; öğrenci t-testi ile belirlenen öneme sahiptir. Hata çubukları standart sapma (SD) temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Insan PRP iki anti-GPIb-IX antikorları ile tedavi. İnsan PRP iki anti-GPIb-IX antikorlar ile tedavi, bir yüksek ciltsiz kuvvet (6B4) ve düşük ciltsiz kuvvet ile (AK2) statik altında (0 dyn/cm2), düşük kesme (5 dyn/cm 2), ve yüksek kesme (30 dyn/cm2) koşullar. Grafikler β-galaktoz, PS ve P-Selectin yüzey ifadesi için olumlu olayların yüzdesini gösterir. * p ≤ 0,05, * * * p ≤ 0,001. Önemi, Tukey testi ile tek yönlü ANOVA ile belirlendi. Hata çubukları SD 'yi temsil eder. Şekil QUACH ve al.11' den uyarlanmıştır.Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .

Figure 4
Şekil 4 : Kontrol IgG, 11A8 veya AK2 ile tedavi edilen insan PRP için kesme pozlama (20 dyn/cm2) zaman kursu. PS ve p-selectin ' d e k i trombosit yüzey Pozlama 0, 0,5, 1, 3 ve 5 dk. * * * p ≤ 0,001, * * * * p ≤ 0,0001 için yamultulmuş örnekleri için akış sitometri ile tespit edildi. Önemi, Tukey testi ile tek yönlü ANOVA ile belirlendi. Hata çubukları SD 'yi temsil eder. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 5
Şekil 5 : Alan ve en boy oranı parametrelerine göre çapraz bağlama Quantitating. (a) trombosit boyutunda (4 μm) boncuk Gpıbα N-terminal alanı ile konjued ve IgG (gri), AK2 (kırmızı), veya 6B4 (mavi) (20 dyn/cm2) koşullar altında tıkanmış. Burada gösterilen ileri dağılım (FSC-A) ve anti-fare antikor floresans ile kontur çizimleri vardır. (b) PRP 'deki trombositlerin en boy oranı için histogram, 6B4 ve floresan olarak etiketli ANTI-CD41 (trombosit Marker) antikorları ile kayma altındadır. Çeşitli en boy oranlarında temsili görüntüler gösterilir. Rakam QUACH ve al.11uyarlanmıştırBu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6 : GPIB-IX ' a karşı divalent monoklonal antikorların yerine immün trombositopeni olan hastalarda serum klinik örnekleri kullanılmıştır. (a) ITP hastalarından plazmanın GPIB-IX bağlayıcı kapasitesi, enzime bağlı İmmünosorbent Assay (ELISA) ile tespit edilmiştir. (b) statik ve yamultulmuş (30 dyn/cm2) koşullarında ITP hasta plazmasında reconstituted yıkanmış insan trombosit. Grafikler, P-Selectin veya PS yüzey ifadesi için pozitif olayların yüzdesini gösterir. * * * * p ≤ 0,0001. Önemi, Tukey testi ile tek yönlü ANOVA ile belirlendi. Hata çubukları SD 'yi temsil eder. Şekil QUACH ve al.11' den uyarlanmıştır.Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu yazıda açıklanan protokol, laminar kesmesinin trombosit ve hücre yüzeyi reseptörlerine etkisini hızlı ve çok yönlü olarak değerlendirmenizi sağlar. Burada sunulan spesifik temsili sonuçlar, multimerik veya iki bivalent ligin etkilerini kesme akışından nasıl etkileneceğini alt çizgi olarak sundu. Bu uygulamaya ek olarak, bir üniforma kesme tahlil kesme bağımlı etkileri gözlem geniş uygulamalar vardır. Bilinen bir ligand reseptör çifti yokluğunda, bir Tekdüzen kesme tahlil aynı zamanda hücre şekli ve sinyalizasyon gibi faktörler üzerinde kesme etkilerini tespit edebilir, özellikle akış sitometrik analizler ile eşleştirilmiş. Şekil 5b, bir Tekdüzen kesme tahlil tarafından kısmen ya da standart akış cytometrik analizler bu protokol, özetlenen, görüntüleme, biyokimyasal ve hücre tabanlı dahil kapsamlı algılama yöntemleri geniş bir yelpazede kendini ödünç olarak alluded deneyleri.

Şekil 2 , özellikle bir kayma bağımlı ligand-reseptör etkileşimi ve negatif kontrol arasında ayrımcılık için, testin temel uygulama örneklendirir. 6B4, GPIB-IX reseptörlerine bağlanma ve reseptör11' i aktive etmek için yeterli kuvvet sürdürme yoluyla trombositlerin çapraz bağlanması yeteneğine sahip olan bir antikor ( Şekil 1' de modelde tasvir edilen) kesmeye maruz kaldığında trombositleri etkinleştirir, aksine trombosit GPIb-IX bağlayamaz kontrol IgG. Bu uygulama aynı anda etkisi seçilen reseptör-ligand çifti için spesifik olduğunu ve kesme bağlıdır kanıt sağlar. Üniforma kesme tahlil de ve özel kesme seviyeleri altında bir reseptör için onların tahvil sürdürebilir ligin etkileri arasında ayırt edebilirsiniz. Şekil 3' te, biz Anti-GPIB-IX antikor AK2, özellikle zayıf unbinding kuvvet11ile epitopu bağlar sinyalizasyon okuma eksikliği bakın. Bu rakam Ayrıca, koni-plaka viskozimetresi tarafından uygulanan kesme stres seviyesinin düşük ve yüksek bir kesime kadar değişen etkilerini de gösterir.

Şekil 4 bu tahlil kesme pozlama uzunluğunu modülate için kullanılabilir ve bu verileri görüntülemek için bir strateji öneriyor gösterir. Şekil 5' te, test için iki alternatif akış-sitometri tabanlı okunabilirlik kullanılır, her ikisi de reseptör aktivasyonunun floresan işaretleyicilerine güvenmez ancak bunun yerine çapraz ve boyut/şekil değişiklerini açıklamak için kullanılabilir. Şekil 5 b , bir olayın boyutuna orantılı olarak artan bir dağılımı, bağlı olmayan (singlet), Doublet, Triplet veya daha yüksek multiplet çapraz bağlı olayların farklı popülasyonları arasında ayrım yapabilir gösterir. Şekil 5bgibi, tahlil, diğer reseptörlerin diğer yöntemler üzerinden görülen çapraz olaylara katılan olasılığını ortadan kaldıran bir faiz reseptörü için konjudi boncuklar uygulanabilir. Şekil 6' da, plazmada, faiz reseptörlerimiz için potansiyel Ligleri içeren biyolojik bir sıvı, saflaştırılmış monoklonal antikorların yerine kullanılır. Bu, bir ilgi reseptörü için belirli bir bilinen ligand veya bağlayıcı ortağının gerekli olmayabilir bir uygulama gösterir.

Tahlil yazılı olarak oldukça erişilebilir olmasına rağmen, bakım ile yapılmalıdır birkaç önemli adımlar vardır. Bunlar arasında en önemlisi, gerçek kesme tedavisinin kendisi dışında dış kaynaklardan gelen kesme tanıtmak için dikkatli olmaktır. Kan çizerken, adım 1,1 Bu protokol belirtildiği gibi, uygun ölçer iğneler aracılığıyla çizmek önemlidir. Yetişkin bağışçıların rızası ile damara yoluyla insan kanı toplama için, bu bir 21 G kan toplama seti ile gerçekleştirilebilir ( malzeme tablosundalistelenen). Kan çizildikten ve PRP izole edildikten sonra, tezgah üzerinde veya yavaş bir Rotisserie üzerinde 6 saate kadar oda sıcaklığında saklanabilir.

PRP izole etmek için kullanılan santrifüjün farklı hızlarda fren yapabilir eğer PRP katmanı ve gereksiz kuvvet uygulama bozukluğu en aza indirmek için yavaş bir fren seçmek en iyisidir. PRP yalıtılmış veya ilgi hücre türü sıvı süspansiyon ise, çok hızlı bir şekilde karışımları pipetleme kaçının. Bunun yerine, numunenin özellikle dar bir pipet ucu ile çizildiği adım 2,5 sırasında özellikle yavaş ve sabit bir moda örnek olarak Aspire ve sınırdışı. Farklı boyutlarda pipet uçları ile doğru pipetleme yapılabilir örnek birimler için, bunların arasında en büyüğü kullanmak tavsiye edilir. Özellikle hassas veya viskoz numuneler için, pipet ucunun çok sonu, numunenin çizilmesi gereken açma açısını genişletmek için bir açıyla kesilebilir.

Hücresel mechanosensation üzerinde kesme etkisini test birçok asder bir bağlantılı ligand ve reseptörü arasında bir etkileşim güveniyor. Microfluidics ve akış odaları böyle bir örnektir, nerede bir bağlantılı ligand ve bir reseptör arasındaki etkileşimi, genellikle çözüm bir hücrede, gerçek zamanlı olarak görülebilir7,8. Diğer teknikler, hücre tabakası ile temel substrat veya prob9arasındaki arayüzde meydana gelen olayları algılamak için mikroskobik kullanın. Bu teknikler dolaşım kan hücrelerinin eğitim özellikle büyük etkisi için kullanılmıştır. Öte yandan, tamamen çözümde meydana gelen olayların sorgulanmasına izin veren teknikler daha sınırlıdır. Çözüm kuvvet genel uygulama için bir örnek vortekslenir bir "hızlı ve kirli" yöntemi olarak hizmet verebilir. Ancak, uygulanan kesin kuvveti belirlemek zordur ve kesme laminar akışından kaynaklanan kesin değildir. Bu üniforma kesme tahlil avantajları biridir. Öte yandan, üniforma kesme tahlil birincil dezavantajı uygulama kesme ve hücrelerin kendilerini gözlem arasında bir zaman boşluğudur. Kesme uygulanır, sonra hücreler lekelenmiş ve sabit, ancak görüntüleme teknikleri kesme işlemi sırasında hücreleri gözlemlemek olamaz. Bu yöntemin bir adaptasyon hücreleri doğrudan istenen işaretçileri ekleme ve işaretleri mevcut ile kesme içerir. Bu, herhangi bir geçici efektlerin hemen algılanmasını sağlar.

Şimdiye kadar bu tahlil, GPIB-IX kompleksi hedefleyen antikorların kesme bağımlı çözüm etkisi algılamak için uyguladıysanız. Antikorlar uygun, basit, divalent bağlayıcı ortak sağlarken, bu sirkülasyonda karşı hücrelerde makinoreceptors çapraz yeterince yüksek unbinding ile sayısız multivalent ligler aracılığıyla gerçekleştirilebilir varsaymak mantıklıdır Kuvvetleri. Bu teknik, bu tür liglerin belirli etkilerini tespit etmek gelecekte yararlı olabilir. Ayrıca, Tekdüzen kesme tahlil Standart Floresan Mikroskobu gibi burada açıklanmayan görüntüleme teknikleri ile birlikte kullanılabilir. Sonuçta, Tekdüzen kesme tahlil bir makul ucuz sağlar, nicel, ve çözelti hücreleri ve hücre parçaları laminar kesme uygulamak için özel bir yöntem, ve birçok algılama yöntemlerinin upstream kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışmada ilgili çalışmalar kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NıH) Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü hibe HL082808, HL123984 (LID) ve F31HL134241 (M.E.Q.) tarafından desteklenmektedir. Fon da NıH Ulusal Enstitüsü Genel Tıp Bilimleri Grant T32GM008367 (M.E.Q.) tarafından sağlanan; ve Atlanta çocuk sağlık ve Emory Üniversitesi Pediatrik akış sitometri çekirdek pilot hibe fonları. Yazarlar, 6B4 antikor paylaşımı için Dr. Hans Deckmyn teşekkür etmek istiyorum ve teknik destek için Emory çocuk Pediatrik araştırma merkezi akış sitometri çekirdek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC anti-human CD62P (P-Selectin) BioLegend 304910
Brookfield Cap 2000+ Viscometer Brookfield -
FITC-conjugated Erythrina cristagalli lectin (ECL) Vector Labs FL-1141
Pooled Normal Human Plasma Precision Biologic CCN-10
Vacutainer Light Blue Blood Collection Tube (Sodium Citrate) BD 369714
Vacutainer Blood Collection Set, 21G x ¾" Needle BD 367287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sullivan, M. J., et al. Non-voltage-gated Ca2+ influx through mechanosensitive ion channels in aortic baroreceptor neurons. Circulation Research. 80, (6), 861-867 (1997).
  2. Lansman, J. B., Hallam, T. J., Rink, T. J. Single stretch-activated ion channels in vascular endothelial cells as mechanotransducers. Nature. 325, (6107), 811-813 (1987).
  3. Fettiplace, R. Hair Cell Transduction, Tuning, and Synaptic Transmission in the Mammalian Cochlea. Comprehensive Physiology. 7, (4), 1197-1227 (2017).
  4. Zimmerman, A., Bai, L., Ginty, D. D. The gentle touch receptors of mammalian skin. Science. 346, (6212), 950-954 (2014).
  5. Nelson, C. M., et al. Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102, (33), 11594-11599 (2005).
  6. Yu, C. H., Law, J. B., Suryana, M., Low, H. Y., Sheetz, M. P. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, (51), 20585-20590 (2011).
  7. Wen, L., et al. A shear-dependent NO-cGMP-cGKI cascade in platelets acts as an auto-regulatory brake of thrombosis. Nature Communications. 9, (1), 4301 (2018).
  8. Marki, A., Gutierrez, E., Mikulski, Z., Groisman, A., Ley, K. Microfluidics-based side view flow chamber reveals tether-to-sling transition in rolling neutrophils. Scientific Reports. 6, 28870 (2016).
  9. Brockman, J. M., et al. Mapping the 3D orientation of piconewton integrin traction forces. Nature Methods. 15, (2), 115-118 (2018).
  10. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 21584 (2016).
  11. Quach, M. E., et al. Fc-independent immune thrombocytopenia via mechanomolecular signaling in platelets. Blood. 131, (7), 787-796 (2018).
  12. Cao, W., Krishnaswamy, S., Camire, R. M., Lenting, P. J., Zheng, X. L. Factor VIII accelerates proteolytic cleavage of von Willebrand factor by ADAMTS13. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, (21), 7416-7421 (2008).
  13. Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. Platelets and shear stress. Blood. 88, (5), 1525-1541 (1996).
  14. Pareti, F. I., Niiya, K., McPherson, J. M., Ruggeri, Z. M. Isolation and characterization of two domains of human von Willebrand factor that interact with fibrillar collagen types I and III. Journal of Biological Chemistry. 262, (28), 13835-13841 (1987).
  15. Deng, W., et al. Platelet clearance via shear-induced unfolding of a membrane mechanoreceptor. Nature Communications. 7, 12863 (2016).
  16. Ikeda, Y., et al. The role of von Willebrand factor and fibrinogen in platelet aggregation under varying shear stress. Journal of Clinical Investigation. 87, (4), 1234-1240 (1991).
  17. Westerhof, N., Stergiopulos, N., Noble, M. I. Snapshots of hemodynamics: an aid for clinical research and graduate education. Springer Science, Business Media. (2010).
  18. Liang, X., et al. Specific inhibition of ectodomain shedding of glycoprotein Ibalpha by targeting its juxtamembrane shedding cleavage site. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11, (12), 2155-2162 (2013).
  19. Samsel, L., et al. Imaging flow cytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulating endothelial cells. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84, (6), 379-389 (2013).
  20. Basiji, D. A., Ortyn, W. E., Liang, L., Venkatachalam, V., Morrissey, P. Cellular image analysis and imaging by flow cytometry. Clinics in Laboratory Medicine. 27, (3), 653-670 (2007).
  21. Quach, M. E., Chen, W., Li, R. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage. Blood. 131, (14), 1512-1521 (2018).
Koni-plaka viskozimetre ile ınsan trombosit ve hücre yüzeyi reseptörleri için Tekdüzen kesme tahlil
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).More

Quach, M. E., Syed, A. K., Li, R. A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry. J. Vis. Exp. (148), e59704, doi:10.3791/59704 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter