Her præsenterer vi en protokol til at kvantificere den chemotaktiske aktivitet af blod monocytter i musemodeller, til at vurdere virkningerne af ernæringsmæssige, farmakologiske og genetiske interventioner på blod monocyt og til at karakterisere de blod monocytter afledte makrofager i mus modeller ved hjælp af monocyte-chemoattraktant protein-1 (MCP-1)-lastet kælder membran-afledte gel stik.
Vævs homøostase og reparation er kritisk afhængige af rekruttering af monocytter-afledte makrofager. Både under-og over-rekruttering af mono byte-afledte makrofager kan forringe sårheling. Vi viste, at høj fedt og høj sukker kost fremme monocyt priming og dysfunktion, omdanne sunde blod monocytter til en hyper chemotaktisk fænotype klar til at differentiere i makrofager med dysregulerede aktiverings profiler og nedsat fænotypiske Plasticitet. Over rekruttering af makrofager, der stammer fra monocyte, og rekruttering af makrofager med dysregulerede aktiverings profiler menes at være en væsentlig bidragyder til udviklingen af kroniske inflammatoriske sygdomme forbundet med metaboliske lidelser, herunder åreforkalkning og fedme. Målet med denne protokol er at kvantificere den chemotaktiske aktivitet af blod monocytter som en biomarkør for monocyt priming og dysfunktion og at karakterisere makrofag fænotype blod monocytter er klar til at differentiere sig i disse musemodeller. Ved hjælp af enkelt celle Western blot analyse, viser vi, at efter 24 h 33% af celler rekrutteret i MCP-1-loaded kælder membran-afledte gel-stik injiceres i mus er monocytter og makrofager; 58% efter dag 3. På dag 5 faldt monocytter og makrofag dog markant. Endelig viser vi, at denne assays også giver mulighed for isolering af levende makrofager fra kirurgisk hentet kælder membran-afledte gel stik, som derefter kan blive udsat for efterfølgende karakterisering af enkelt celle Western blot analyse.
Rekrutteringen af monocytter-afledte makrofager er afgørende for udviklingen af kroniske inflammatoriske sygdomme forbundet med metaboliske lidelser, herunder åreforkalkning og fedme1,2,3, 4. Antallet af mono byte-afledte makrofager på steder af vævsskade samt deres plasticitet er afgørende for væv homøostase og reparation. Både under-og over-rekruttering af mono byte-afledte makrofager kan forringe sårheling5. Udløse lokal vævs betændelse, for eksempel ved ophobning og oxidation af low-density lipoprotein (LDL) i aorta væggen eller inflammatorisk aktivering af adipocytter af fedtsyrer eller bakteriel lipopolysaccharid lækage gennem tarm barriere, fører til frigivelse af inflammatoriske mediatorer, herunder kemo okiner såsom monocyt chemoattraktant protein-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 er medlem af c-c chemokine-familien og en vigtig kemoattraktant, der er ansvarlig for rekrutteringen af monocyt-afledte makrofager til steder med vævs betændelse og-skade6,7,8, 9,10. Inflammatorisk aktivering af vaskulær endotelet resulterer i ekspression af sammenvoksninger molekyler såsom intercellulære adhæsions molekyle 1 (ICAM-1) og vaskulære celle adhæsions molekyle 1 (VCAM-1)11,12, så cirkulerende monocytter aktiveret af MCP-1 til at rulle sammen, fastholde sig til og efterfølgende transmigrere til subendothelial rum12. Infiltrerer monocytter differentiere i makrofager, som kan aktiveres i en proinflammatorisk fænotype, der driver den akutte inflammatoriske proces. Drevet af mikromiljøet, pro-inflammatoriske makrofager kan konvertere til betændelse-løse makrofager, som spiller kritiske roller i clearing af inflammatoriske celler, fjerne pro-inflammatoriske signaler og fuldføre væv reparation og sår Healing12,13.
Kronisk metabolisk stress primtal monocytter for dramatisk forbedret reaktionsevne til Chemo-attraktanter og øget monocyt rekruttering, og vi viste, at primet monocytter giver anledning til makrofager med dysregulerede aktiveringsprogrammer og polarisering stater14,15,16. Monocytter priming fremmer åreforkalkning, fedme, og muligvis andre kroniske inflammatoriske sygdomme forbundet med metaboliske lidelser såsom steatohepatitis, nyresygdomme og muligvis kræft. For at vurdere og kvantificere monokyt priming i musemodeller af menneskelige sygdomme, udviklede vi en ny teknik til at vurdere den spæde tilstand af blod monocytter ved at måle den kemo-aktiske aktivitet in vivo14,15,16, 17. Vores tilgang involverer injektion af kælder membran-afledt gel lastet med enten en chemoattraktant-vi bruger almindeligvis MCP-1-eller køretøj i venstre og højre flanke, henholdsvis af mus. Når omhyggeligt injiceres subkutant, vil kælderen membran-afledte gel danne et enkelt stik, hvorfra chemokinerne kan diffus og skabe en defineret kemo-aktisk gradient, der ikke påvirkes af den metaboliske eller inflammatoriske tilstand af de omgivende væv eller modtager musen.
Den kælder membran-afledte gel vi bruger til vores analyse er en opløst biliseret kælder membran forberedelse udvundet fra Engelbreth-Holm-sværm (EHS) mus sarkom, en tumor rig på sådanne ekstracellulære matrix (ECM) proteiner. Denne komplekse protein blanding indeholder Laminin (60%), kollagen IV (30%), bridging molekyle entactin (8%), og en række vækstfaktorer. Basement membran matrix plug assay blev oprindeligt udviklet til at undersøge angiogenese som reaktion på forskellige vækstfaktorer18,19. Men for at studere monocytter chemotaxis, er det vigtigt at bruge vækstfaktor-forarmet kælder membran-afledte gel til at minimere endotelcelle rekruttering og angiogenese. Hvad gør matrigel (omtales som Basement membran-afledte gel fremover) unikke og især nyttig er, at ved temperaturer under 10 ° c det bliver flydende, gør det muligt for kemokiner at blive opløst. Ved temperaturer over 22 °C gennemgår den membran afledte opløsning hurtigt en faseovergang og danner hurtigt en hydrogel. Stikkene kan fjernes kirurgisk, rengøres og opløses med en Bacillus-afledt neutral metalloprodrille for at give enkelt celle suspensioner, som kan analyseres på en fluorescens-aktiveret celle sortering (FACER), af RNAseq, enkelt celle-RNA og en række andre omik teknikker. Her beskriver vi brugen af enkelt-celle Western blot analyse til karakterisering af cellepopulationer rekrutteret i kælderen membran-afledte gel stik en, tre eller fem dage efter injektion.
Vi udviklede en in vivo chemotaxis assay, gør brug af de unikke fysiske egenskaber af den kælder membran-afledte matrix og evnen til at indlæse denne unikke matrix med kemokiner og injicere det i mus. Analysen giver os mulighed for at vurdere i levende mus reaktionsevne af monocytter (og makrofager) til Chemokines, som illustreret her for MCP-1, og virkningerne af enten genetisk manipulation eller farmakologiske, kosten og andre miljømæssige eksponeringer på monocyt chemotaxis. Fordi den chemokin gradient vi skaber i disse mus er hovedsagelig upåvirket af genetisk, farmakologisk, kosten eller miljømæssig eksponering, ændringer i monocyt chemotaktisk aktivitet faktisk afspejler funktionelle ændringer i disse monocytter og, som vi viste tidligere også omprogrammering på både protein og transkriptional niveau17,20. Vi rapporterede, at metabolisk stress hos mus øger monocyt reaktionsevne til chemoattraktant, og at denne hyper-chemotaktisk aktivitet korrelerer med øget protein S-glutathionylering, en reversibel, redox-afhængig posttranslationel protein modifikation, som i de fleste tilfælde fører til tab af enzymatisk og protein funktion21,22, og i nogle tilfælde endda fremmer protein nedbrydning16,23.
For at kunne udføre denne procedure og opnå optimale resultater med denne analyse er det afgørende, at nøjagtige mængder af kælder membran-afledt opløsning injiceres langsomt for at skabe en ental velformet stik og fibrøse kapsler bør fjernes helt at få rene propper, når høst kælder membran-afledte gel stik, letter opløsningen af hele stikket i dispase løsning. Vores data viser, at efterlader stikket i dyrene i tre dage optimerer 1) signal intensiteten, dvs antallet af monocytter og makrofager rekrutteret i hvert stik, 2) selektiviteten af signalet, dvs indholdet af monocytter og makrofager inden for samlede cellepopulationer og 3) specificiteten af signalet, dvs stigningen i monocytter og makrofager som reaktion på MCP-1 i forhold til køretøjet. Endelig viser vi, hvordan de mest moderne enkelt cellebaserede tilgange i forbindelse med den base, der er afledt af gassæden, kan bruges til at karakterisere de monocytter, der rekrutteres i stikkene, og dermed opnå et øjebliksbillede af den potentielle fænotype af de monocyt-afledte makrofager, der rekrutteres til steder med skade i en given musemodel som reaktion på specifikke genetiske, farmakologiske, kosten eller miljømæssige indgreb.
Der er en række begrænsninger af analysen til at blive overvejet. Først, mus håndtering, herunder anæstesi, injektion af kælderen membran-afledte løsning, og kirurgisk dissektion kræver praksis at generere enkelte stik og reproducerbare data. For det andet, mens de fleste celler rekrutteret i MCP-1 indlæste stik er monocytter og makrofager, et betydeligt antal er ikke. Dette kan påvirke fortolkningen af andre, ikke-enkelt cellebaserede analytiske analyser udført på denne cellepopulation. Endelig, da cellelyse betingelser for scWB er milde, migrations afstande af proteiner kan afvige fra standard WB og kan ikke korrelere med protein størrelse. Derfor skal både cellelyse og kørselstider valideres for hvert nyt protein, der skal testes, og hvert primært antistof, der anvendes.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev støttet af tilskud til R.A. fra NIH (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |