Ici nous présentons un protocole pour quantifier l’activité chimiotactique des monocytes sanguins dans les modèles de souris, pour évaluer les effets des interventions nutritionnelles, pharmacologiques et génétiques sur le monocyte sanguin et pour caractériser les macrophages dérivés des monocytes sanguins dans modèles de souris utilisant des bouchons de gel dérivés de la membrane de membrane de membrane de sous-sol monocyte-chemoattractant-1 (MCP-1).
L’homéostasie tissulaire et la réparation dépendent de façon critique du recrutement de macrophages dérivés de monocytes. Le sous-recrutement et le sur-recrutement des macrophages monocyte-dérivés peuvent altérer la cicatrisation de blessure. Nous avons montré que les régimes riches en graisses et en sucre favorisent l’amorçage et le dysfonctionnement de monocyte, convertissant les monocytes sains de sang en un phénotype hyper chimiotaxique prêt à se différencier en macrophages avec des profils d’activation dysregulated et phenoypic altérés Plasticité. Le sur-recrutement des macrophages dérivés de monocytes et le recrutement de macrophages avec des profils d’activation dysrégulés est considéré comme un contributeur majeur au développement de maladies inflammatoires chroniques associées aux troubles métaboliques, l’athérosclérose et l’obésité. Le but de ce protocole est de quantifier l’activité chimiothérapeutique des monocytes sanguins comme biomarqueur pour l’amorçage et le dysfonctionnement de monocyte et de caractériser les monocytes sanguins de phénotype de macrophage sont prêts à se différencier dans ces modèles de souris. À l’aide de l’analyse de tache occidentale de cellule simple, nous montrons qu’après 24 h 33% des cellules recrutées dans les bouchons de gel membranaires de sous-sol chargés de MCP-1 injectés dans les souris sont des monocytes et des macrophages ; 58% après le 3e jour. Cependant, le jour 5, les nombres de monocytes et de macrophages ont été sensiblement diminués. Enfin, nous montrons que cette analyse permet également l’isolement des macrophages vivants des bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol récupérés chirurgicalement, qui peuvent ensuite être soumis à la caractérisation ultérieure par l’analyse de tache occidentale à cellule unique.
Le recrutement de macrophages dérivés de monocytes est essentiel pour le développement de maladies inflammatoires chroniques associées aux troubles métaboliques, y compris l’athérosclérose et l’obésité1,2,3, 4. Le nombre de macrophages monocytes-dérivés aux emplacements des dommages de tissu aussi bien que leur plasticité sont critiques pour l’homéostasie et la réparation de tissu. Le sous-recrutement et le sur-recrutement des macrophages monocyte-dérivés peuvent altérer la cicatrisation des plaies5. Déclencher l’inflammation des tissus locaux, par exemple, par l’accumulation et l’oxydation de la lipoprotéine de faible densité (LDL) dans la paroi aortique ou l’activation inflammatoire des adipocytes par les acides gras ou le lipopolysaccharide bactérien qui fuit à travers l’intestin barrière, mène à la libération des médiateurs inflammatoires, y compris des chemokines tels que la protéine chimioattractant de monocyte-1 (MCP-1/CCL2). MCP-1 est un membre de la famille c-C chemokine et un chimioattractant clé responsable du recrutement de macrophages monocytes-dérivés aux emplacements de l’inflammation de tissu et des dommages6,7,8, 9,10. L’activation inflammatoire de l’endothélium vasculaire a comme conséquence l’expression des molécules d’adhérence telles que la molécule intercellulaire d’adhérence 1 (ICAM-1) et la molécule d’adhérence vasculaire de cellules 1 (VCAM-1)11,12, permettant monocytes circulants activés par MCP-1 pour rouler le long, adhérer fermement et ensuite transmigrer dans l’espace subendothélial12. Les monocytes infiltrants se différencient en macrophages, qui peuvent être activés dans un phénotype proinflammatoire, conduisant le processus inflammatoire aigu. Poussés par le microenvironnement, les macrophages pro-inflammatoires peuvent se convertir en macrophages résolvant l’inflammation, qui jouent un rôle critique dans le nettoyage des cellules inflammatoires, en supprimant les signaux pro-inflammatoires et en complétant la réparation et la blessure des tissus. guérison12,13.
Le stress métabolique chronique augmente les monocytes pour une réactivité considérablement améliorée aux chimio-attractants et une augmentation du recrutement de monocytes, et nous avons montré que les monocytes apprêtés donnent lieu à des macrophages avec des programmes d’activation dysrégulés et la polarisation États14,15,16. L’amorçage de Monocyte favorise l’athérosclérose, l’obésité, et probablement d’autres maladies inflammatoires chroniques liées aux désordres métaboliques tels que la stéatohépatite, les maladies rénales et peut-être le cancer. Pour évaluer et quantifier l’amorçage de monocyte dans les modèles de souris des maladies humaines, nous avons développé une nouvelle technique pour évaluer l’état d’amorçage des monocytes de sang en mesurant l’activité chimiotactique in vivo14,15,16, 17. Notre approche consiste à injecter du gel dérivé de la membrane du sous-sol chargé soit d’un chimioattractant — nous utilisons couramment le MCP-1 — ou d’un véhicule sur le flanc gauche et droit, respectivement, de souris. Lorsqu’il est soigneusement injecté sous-cutanée, le gel dérivé de la membrane du sous-sol formera un seul bouchon, à partir duquel les chimiocines peuvent se diffuser et créer un gradient chimiotaxique défini qui n’est pas affecté par l’état métabolique ou inflammatoire de l’environnement tissu ou la souris receveuse.
Le gel dérivé de la membrane du sous-sol que nous utilisons pour notre essai est une préparation solubilisée de membrane de sous-sol extraite du sarcome de souris d’Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), une tumeur riche en ces protéines extracellulaires de matrice (ECM). Ce mélange complexe de protéines contient de la lamininin (60%), du collagène IV (30%), de l’entactine de la molécule de pontage (8%), et d’un certain nombre de facteurs de croissance. L’assay de la matrice de membrane de sous-sol a été à l’origine développé pour étudier l’angiogenèse en réponse à divers facteurs de croissance18,19. Cependant, afin d’étudier la chimiotaxie monocyte, il est important d’employer le gel membrane-dérivé de sous-sol facteur de croissance-appauvri pour réduire au minimum le recrutement endothélial de cellules et l’angiogenèse. Ce qui rend Matrigel (appelé gel dérivé de la membrane du sous-sol désormais) unique et particulièrement utile, c’est qu’à des températures inférieures à 10 oC, il se liquéfie, ce qui permet de dissoudre les chimiocines. À des températures supérieures à 22 oC, la solution dérivée de la membrane du sous-sol subit rapidement une transition de phase et forme rapidement un hydrogel. Les bouchons peuvent être excisés chirurgicalement, nettoyés et dissous à l’aide d’un métalloproté neutre dérivé du bacille pour produire des suspensions à cellule unique, qui peuvent être analysées sur un trieur de cellules activé par la fluorescence (FACS), par RNAseq, l’ARN unicellulaire et une variété d’autres techniques d’omique. Ici nous décrivons l’utilisation de l’analyse occidentale de tache unicellulaire pour la caractérisation des populations de cellules recrutées dans les bouchons de gel membrane-dérivés de sous-sol un, trois ou cinq jours après injection.
Nous avons développé un résultat chimiotaxie in vivo, en faisant usage des propriétés physiques uniques de la matrice dérivée de la membrane du sous-sol et de la capacité de charger cette matrice unique de chimiocines et de l’injecter chez la souris. L’essai nous permet d’évaluer chez les souris vivantes la réactivité des monocytes (et des macrophages) aux chimiocines, comme illustré ici pour MCP-1, et les effets de la manipulation génétique ou pharmacologique, diététique et autres expositions environnementales sur les monocytes Chemotaxis. Parce que le gradient chimiokine que nous créons chez ces souris n’est essentiellement pas affecté par l’exposition génétique, pharmacologique, diététique ou environnementale, les changements dans l’activité chimiotactique monocyte reflètent réellement les changements fonctionnels dans ces monocytes et, comme nous l’avons montré précédemment, aussi la reprogrammation à la fois à la protéine et le niveau transcriptionnel17,20. Nous avons rapporté que le stress métabolique chez les souris augmente la réactivité de monocyte au chimioattractant et que cette activité hyper-chimiotactique corrèle avec la protéine accrue S-glutathionylation, un réversible, redox-dépendant posttranslationnel modification des protéines, qui dans la plupart des cas conduit à la perte de la fonction enzymatique et protéique21,22, et dans certains cas favorise même la dégradation des protéines16,23.
Pour exécuter avec succès cette procédure et pour obtenir des résultats optimaux avec cet test, il est essentiel que des volumes précis de solution dérivée de la membrane du sous-sol soient injectés lentement pour créer un bouchon et des capsules fibreuses singulières bien formées. complètement pour obtenir des bouchons propres lors de la récolte des bouchons de gel dérivés de la membrane du sous-sol, facilite la dissolution de l’ensemble du bouchon dans la solution de dispase. Nos données montrent que laisser le bouchon dans les animaux pendant trois jours optimise 1) l’intensité du signal, c’est-à-dire le nombre de monocytes et de macrophages recrutés dans chaque prise, 2) la sélectivité du signal, c’est-à-dire le contenu des monocytes et des macrophages au sein de la populations cellulaires totales et 3) la spécificité du signal, c’est-à-dire l’augmentation des monocytes et des macrophages en réponse au MCP-1 par rapport au véhicule. Enfin, nous démontrons comment des approches à base de cellules individuelles de pointe en conjonction avec l’analyse de la fiche de gel dérivée de la membrane du sous-sol peuvent être utilisées pour caractériser les monocytes recrutés dans les bouchons et ainsi obtenir un instantané du phénotype potentiel de les macrophages dérivés du monocyte étant recrutés sur des sites de blessures dans un modèle de souris donné en réponse à des interventions génétiques, pharmacologiques, diététiques ou environnementales spécifiques.
Il y a un certain nombre de limites à considérer. Tout d’abord, la manipulation de la souris, y compris l’anesthésie, l’injection de la solution dérivée de la membrane du sous-sol, et la dissection chirurgicale nécessite la pratique de générer des bouchons uniques et des données reproductibles. Deuxièmement, alors que la plupart des cellules recrutées dans les bouchons chargés MCP-1 sont des monocytes et des macrophages, un nombre important ne le sont pas. Cela peut affecter l’interprétation d’autres essais analytiques non à cellule unique effectués sur cette population cellulaire. Enfin, puisque les conditions de lyse cellulaire pour scWB sont douces, les distances de migration des protéines peuvent différer de wb standard et ne peuvent pas corrélé avec la taille des protéines. Par conséquent, la lyse cellulaire et les temps d’exécution doivent être validés pour chaque nouvelle protéine à tester et chaque anticorps primaire utilisé.
The authors have nothing to disclose.
Ce projet a été soutenu par des subventions accordées à R.A. par les NIH (AT006885).
10 cm petri dish | griner bio-one | 664 160 | |
10x suspension buffer | proteinsimple | R101 | |
15 cm petri dish | Falcon | 353025 | |
2-Mercaptoethanol | MP BIOMEDICALS | 2194705 | |
5% washing buffer | proteinsimple | R252 | |
Antibody diluent | proteinsimple | 042-203 | |
Bench Top Centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R Centrifuge | |
Bovine Serim Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | 1 ml |
CD11b | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
CD45 (D4H7K) rabbit mAb | Cell Signal Technologies | 727987S | |
CD68/SR-D1 (FA-11) | Novus Biologicals | NBP2-33337SS | |
Cellometer Vision | Nexcelom | ||
Dispase | BD | 354235 | 100 ml |
Dissecting sissor | |||
Donkey anti-Rabbit IgG secondary antibody [NL557] | Novus Biologicals | NL004 | NL 557 conjugate |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) secondary antibody [DyLight 650] | Novus Biologicals | NBP1-75655 | DyLight 650 conjugate |
F4/80 (CI-A3-1) | Novus Biologicals | NB600-404SS | |
Heat Block | effendorf | 22331 | Thermomixer |
Lysis/Running buffer | proteinsimple | R200 | |
Matrigel Matrix (Grwoth Factor Reduced) | BD | 354230 | 10 ml |
Microarray scanner | PerkinElmer | ScanArray Gx | |
Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Microscope | ThermoFisher | Evos fl | |
Milo | proteinsimple | Single cell western | |
Needle | BD | 305111 | 26G |
Parafilm | |||
Probing chamber | proteinsimple | 035-020 | |
Recombinant mouse CCL2/JE/MCP-1 protein | R&D | 479-JE-050 | |
scWEST chip | proteinsimple | C300 | |
Shaker | Bioexpress | Gene mate orbital shaker | |
Single cell western chip canister | proteinsimple | 035-118 | |
Slide spinner | Labnet | C1303-T | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP 166-500 | |
Syringe | BD | 309602 | 1 ml |
Tris-Hydrochloride | Fisher Scientific | BP 153-500 | |
Tweezer | proteinsimple | 035-020 | |
Water bath | ThermoFisher |