Summary
Deze real-time RT-PCR met behulp van dsDNA intercalating Dye is geschikt om Lyssavirus infecties te diagnosticeren. De methode begint met RNA geëxtraheerd uit rabiës verdachte ante-mortem-of postmortemmonsters, detaillering Master Mix preparaat, RNA toevoeging, installatie van de real-time machine en juiste interpretatie van de resultaten.
Abstract
Moleculaire assays zijn snel, gevoelig en specifiek, en zijn centraal geworden bij het diagnosticeren van rabiës. PCR-gebaseerde assays zijn al decennia lang gebruikt om de diagnose van rabiës te bevestigen, maar zijn pas recentelijk geaccepteerd door de OIE (Wereldorganisatie voor diergezondheid) als een primaire methode om rabiës infectie op te sporen. Real-time RT-PCR-testen bieden real-time gegevens en zijn gesloten-buis systemen, waardoor het risico op verontreiniging tijdens de installatie wordt geminimaliseerd. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR-tests vereisen geen dure sondes, waardoor de kosten per monster worden geminimaliseerd en wanneer de primers zijn ontworpen in gecondengeerde regio's, die specifiek zijn voor virus geslachten in plaats van specifiek voor slechts één virus soorten zijn mogelijk. Hier beschrijven we een pan-Lyssavirus SYBR real-time RT-PCR-test die lyssavirussen in de Lyssavirus -genus detecteert, inclusief de meest uiteenlopende virussen ikov, WCBV en llebv. In combinatie met dissociatie curve analyse is deze assay gevoelig en specifiek, met als voordeel dat alle Lyssavirus soorten worden opgespoord. De test is goedgekeurd in vele diagnostische laboratoria met een gegarandeerde kwaliteit, waardoor een robuuste, snelle en gevoelige diagnose van dieren-en menselijke rabiës gevallen mogelijk is.
Introduction
De diagnose van rabiës met behulp van moleculaire methodologieën werd door het OIE in 20181aanvaard, waarbij de voordelen van deze technieken voor de bevestiging van rabiës gevallen werden erkend, met name in situaties waarin de monsters suboptimaal zijn, of bij een antemortem-diagnose; omdat er geen behoefte is aan levend virus of verse monsters. PCR-testen voor lyssavirussen vereisen een omgekeerde transcriptie (RT) voordat PCR kan beginnen als het genoom RNA is. RT-PCR-testen die de 3 ' proximale regio van het genoom detecteren worden beschouwd als de meest gevoelige, als transcriptionele gradiënten optreden tijdens Lyssavirus replicatie. Veelgebruikte RT-PCR-testen kunnen globaal worden onderverdeeld in twee categorieën, eindpunt (of gel-gebaseerd) en real-time. Beide benaderingen zijn gevoelig en specifiek; de real-time assay heeft echter enkele extra voordelen, zoals het behalen van resultaten in ' real-time ' en het uitvoeren van een volledig gesloten buis systeem, waardoor de kans op besmetting van de machinist afneemt. Er zijn twee belangrijke benaderingen voor het detecteren van lyssavirusspecifieke amplicons verkregen met behulp van real-time testen. De eerste maakt gebruik van hydrolyse sondes (zoals taqman probes) die een de en een quencher bevatten. Wanneer de sonde tijdens de versterking aan de doelregio bindt, resulteert de exonuclease-activiteit van de polymerase in dissociatie van de en quencher, waardoor de resulterende fluorescentie kan worden gemeten. De tweede maakt gebruik van een DNA-intercalciërende kleurstof (fluorochrome zoals SYBR Green) die bindt aan dubbel gestrande DNA tijdens versterking. De gebonden fluorochromes zenden fluorescentie die wordt gedetecteerd bij elke cyclus, waardoor real-time detectie en kwantificering van het product. Vanwege de niet-specifieke aard van binding aan een dsDNA, wordt een dissociatie curve analyse ondernomen om de specificiteit van de reactie te bevestigen. Real-time RT-PCRs zijn snel als gevolg van de kleine ampliconlengte voor temp maten, meestal minder dan 200 BP in lengte; echter, het identificeren van geschikte regio's voor het ontwerpen van primers en sondes in geconmaveerde regio's, kan een uitdaging blijken, dus het verwijderen van de eis voor een sonde is een duidelijk voordeel.
Een aantal real-time RT-PCRs zijn ontworpen voor het specifiek opsporen van individuele stammen of lijn afstanden van rabv2 en ook voor het opsporen van lyssavirussen in het genus3,4,5,6, 7,8,9. Alle assays zullen een aantoonbaarheidsgrens hebben afhankelijk van hoe de primer (en indien nodig de sonde) sequenties over het genus worden bewaard. Inderdaad, opkomende of nieuwe virusstammen kunnen de zeer specifieke sonde gebaseerde assays ineffectief. De keuze van de real-time detectie (kleurstof versus sonde) is afhankelijk van de beoogde toepassing. Voor een laboratorium toezicht op lokaal geproduceerde hersen materiaal en verwachten van hoge aantallen negatieve monsters, het gebruik van de goedkopere intercalating kleurstof is een verstandige keuze. De SYBR groene aanpak zou ook optimaal zijn bij het uitvoeren van scanning surveillance waarbij de aanwezigheid van nieuwe of divergerende lyssavirussen onopgemerkt zou blijven door meer beperkte sonde-gebaseerde testen.
Alle leden van het geslacht Lyssavirus veroorzaken de ziekte rabiës, die is fataal zodra de symptomen verschijnen. De overgrote meerderheid van de gevallen van menselijke en dierlijke rabiës is te wijten aan het rabiësvirus (RABV), het dominante reservoir waarvoor de huis hond10is. Vleermuizen zijn belangrijke gastheer reservoirs voor lyssavirussen en alle maar twee Lyssavirus soorten gekenmerkt zijn direct geïdentificeerd in vleermuizen-Ikoma Lyssavirus (IKOV) en Mokola virus (MOKV)-en van deze twee, IKOV is gespeceeerd om een vleermuis gastheer reservoir 11. naast de 16 erkende Lyssavirus soorten12, er zijn twee lyssavirussen die onlangs zijn beschreven: Taiwan bat Lyssavirus (twblv)13 en kotalahti bat Lyssavirus (kblv)14. Lyssavirussen kunnen genetisch worden onderverdeeld in drie fylogroepen, met de meerderheid van lyssavirussen, waaronder RABV, behorend tot phylogroup I. Echter, de meest uiteenlopende lyssavirussen behoren tot phylogroup III en zijn waarschijnlijk niet worden gedetecteerd door RT-PCRs ontworpen om te richten op RABV of phylogroup I virus sequenties.
De hier beschreven assay maakt gebruik van de real-time primer pair JW12-N165, voor het eerst beschreven in 20053. De primers werden ontworpen om te worden pan-Lyssavirus hoewel de oorspronkelijke toepassing was als een TaqMan assay met sondes te differentiëren Lyssavirus soorten. Daaropvolgende bevestiging dat het primer paar was pan-Lyssavirus in specificiteit werd bereikt met behulp van een 2-stappen SYBR real-time assay op alle Lyssavirus soorten die beschikbaar zijn, waaronder WCBV15. Het primer paar wordt hier beschreven in een One-Step RT-PCR real-time assay met behulp van een intercalating fluorochrome, gevalideerd met behulp van vertegenwoordigers van alle 16 erkende Lyssavirus soorten. Deze real-time assay in één stap is een snelle, gevoelige, lyssavirusspecifieke assay en toont aan dat de robuustheid van de primer is ingesteld om zelfs zeer uiteenlopende Lyssavirus soorten te identificeren.
Protocol
Monsters van diagnostisch materiaal dat na een natuurlijke infectie bij APHA is ontvangen, of verkregen door het inoculeren van muizen met behulp van protocollen die zijn beoordeeld door het Comité ethiek en statistiek van de UK onder licentie 70/7394.
1. kwantificering van RNA met behulp van een micro volume spectrofotometer
- Zorg ervoor dat de instellingen van de spectrofotometer op RNA zijn ingesteld.
- Gebruik 1-2 μL moleculair water om de machine te initialiseren en een basislijn in te stellen.
- Gebruik 1-2 μL van elk test-RNA-monster om de RNA-hoeveelheid te beoordelen.
- Sla de lezingen en het document op.
- Stel het RNA zo nodig in op 1 μg/μL.
Opmerking: RNA moet te allen tijde op ijs (of in een koelblok) worden bewaard. Als RNA wordt verkregen met behulp van een kolom of een op kraal gebaseerde methode, is het RNA meestal minder dan 1 μg/μL. In deze situatie gebruik maken van de RNA netjes.
2. bereiding van RNA-verdunningsreeks om de gevoeligheid van het eindpunt te bepalen
-
Maak een 10-voudige seriële verdunning van het RNA.
- Etiket buizen met de verdunningsreeks (bijv. 10-1, 10-2, enz.) en de RNA-gegevens.
- Voeg 45 μL moleculair water toe aan elke buis.
- Voeg 5 μL RNA (voorheen verdund tot 1 μg/μL) toe en meng goed.
- Gooi de pipetpunt weg in een geschikt ontsmettingsmiddel en vervang deze door een nieuwe tip.
- Neem 5 μL van de 10-1 en voeg toe aan 10-2 buis en meng goed.
- Herhaal 2.1.3-2.1.5 met de resterende verdunningen.
Opmerking: RNA moet te allen tijde op ijs (of in een koelblok) worden bewaard.
3. voorbereiding van real-time RT-PCR-reacties
- Gebruik een werkblad om de plaat indeling te plannen volgens het aantal test monsters en controlemonsters, zowel voor het Lyssavirus als het ß-actin-assays.
Opmerking: Als 4 monsters moeten worden getest in tweevoud met een positieve en negatieve controle, komt dit neer op 10 Reacties voor beide assays. - Veeg in een ' schone ruimte ' of een gebied dat losstaat van het RNA-template de oppervlakken af met een geschikt ontsmettingsmiddel vóór gebruik of maak een PCR-werkstation (indien gebruikt). Om het werkstation voor te bereiden, veegt u het oppervlak van de kast af met een geschikte desinfectie en plaatst u de benodigde items in het werkstation en sluit u de deuren. Het UV-licht gedurende 10 minuten inschakelen
- Verwijder regenten en primers uit de vriezer en ontdooien (reagentia vermeld in tabel 1 en primers in tabel 2).
Opmerking: Het enzym mengsel wordt opgeslagen in glycerol, dus niet ontdooien en moet te allen tijde op ijs (of in een koelblok) worden gehouden. Alle andere reagentia kunnen op kamertemperatuur ontdooid worden. - Meng de reagentia eenmaal ontdooid en centrifugeer kort om vloeistof te verzamelen.
Opmerking: Draai het enzym mengsel niet Vortex, centrifugeer gewoon kort. - Bereid afzonderlijke Master mixen voor Lyssavirus en ß-actin. Voeg voor elke reactie 7,55 μL moleculair water, 10 μL van 2x universele SYBR groene reactiemix, 0,6 μL voorwaartse primer, 0,6 μL omgekeerde primer, 0,25 μL iTaq RT enzym mengsel.
- Gebruik een werkblad om de juiste volumes te berekenen om fouten in handmatige berekeningen te voorkomen. Zorg ervoor dat voldoende Master-Mix is voorbereid om te compenseren voor Pipetteer fouten. Dus als 10 Reacties nodig zijn (zie opmerking in 3,1), bereid 12 Reacties
- Bereid de Master-mix op ijs (of in een koelblok) en blijf op ijs totdat het in de real-time machine wordt geplaatst.
- Meng de bereide meester mixen, centrifugeer kort en breng 19 μL in de relevante putten van strook buizen of een 96 goed plaat compatibel met de real-time machine in gebruik.
Opmerking: Minimaliseer de productie van bellen in de putjes tijdens het pipetteren. - Voeg in een aparte ruimte, of in een UV-kast die is bereid zoals beschreven in 3,2, voorzichtig 1 μL van het RNA toe dat eerder is afgesteld op 1 μg/μL (zie stap 1,5) onder het oppervlak van de juiste Master-Mix goed en meng zachtjes. Gooi de pipetpunt direct na gebruik weg in een ontsmettingsmiddel (onder het oppervlak).
- Voeg de besturingselementen toe na de test voorbeelden, met de volgende positieve controle en het besturingselement geen sjabloon (NTC – moleculair niveau water) dat als laatste is toegevoegd. De hoeveelheid RNA die wordt gebruikt, kan worden gewijzigd afhankelijk van het type monster en de gebruikte RNA-extractie. De gebruikte hoeveelheid moet worden gevalideerd om ervoor te zorgen dat de reactie wordt geoptimaliseerd.
- Afdichtings plaat met behulp van strip deksels of sealer zorg ervoor dat alle deksels stevig zijn gesloten en voldoende geëtiketteerd om de monsters te oriënteren. Label de rand van de plaat/strook buizen.
- Draai de monsters met behulp van een centrifuge om alle vloeistof op de bodem van de putjes te verzamelen.
- Transfer plaat naar de real-time PCR-machine, open de deur en plaats in de houder en zorg voor de juiste locatie/oriëntatie van de monsters volgens de plaat indeling.
Opmerking: Als er buis stroken worden gebruikt, controleer dan of de houder op zijn plaats is. - Open het real-time PCR-machine programma en kies de optie voor SYBR real-time experiment met dissociatie curve. Program meer de real-time PCR-machine met behulp van de thermische fiets condities zoals aangegeven in tabel 3, inclusief de gegevens inzamelingspunten.
- Selecteer Sybr als de fluorescerende kleurstof en selecteer onbekend als het sample type en voeg een naam in de juiste voorbeeld naam doos.
Opmerking: Onderscheid tussen de replicaten en ook tussen de Lyssavirus en ß-actin Wells. - Kies een bestandslocatie om de experimentele gegevens op te slaan, zorg ervoor dat de lamp aan het einde van de hardloopsessie wordt uitgeschakeld en start de hardloopsessie.
Opmerking: Aangezien de eerste stap een RT-fase is, worden er gedurende deze tijd geen gegevens verzameld, dus als de lamp een warming-upperiode vereist, kan dit tijdens de RT-fase plaatsvinden. De real-time machine en software zullen de versterkings curves in real-time weergeven, terwijl de smelt curve wordt gegenereerd aan het einde van de cyclus.
4. gegevensanalyse
-
Als de uitvoering is voltooid, voert u de gegevensanalyse als volgt uit.
- Analyseer eerst de versterkings plot resultaten van de test monsters naast de controlemonsters. Positieve monsters tonen exponentiële hellingen, meestal gevolgd door plateau en een Ct -waarde. Negatieve monsters bevatten vlakke versterkings percelen zonder Ct -waarden (Figuur 1a). De Ct -waarde wordt automatisch berekend door de software, hoewel dit moet worden gecontroleerd en handmatig worden gewijzigd indien nodig.
- Ten tweede analyseert u de resultaten van de dissociatie curve van de test monsters naast de controlemonsters. Een positief monster zal een smelttemperatuur (Tm) 77 – 80 °c hebben en overlappen met de positieve controle Figuur 1b).
- Verkrijg het algemene diagnostische resultaat door ervoor te zorgen dat de besturingselementen geldig zijn. Gebruik tabel 4 om de resultaten te interpreteren in relatie tot het interne ß-actin-besturingselement. Als de positieve controlemonsters negatief zijn en/of de negatieve monsters positief zijn, moet de uitvoering buiten beschouwing worden gelaten.
- Noteer de Ct -en tm -waarden die zijn verkregen voor het controle-RNA in een ' controlekaart ' om trendanalyse mogelijk te maken en om Drifts in de gevoeligheid van de assay te helpen identificeren.
Representative Results
Volgens het hierboven beschreven protocol is de gevoeligheid van het pan-Lyssavirus RT-PCR aangetoond op een verdunningsreeks van het controle standaard virus (CVS) (Figuur 1) en een reeks andere lyssavirussen (Figuur 2EnFiguur 3). SYBR Green I Dye werd gebruikt als een universele One-Step RT-PCR, waar cDNA-synthese en PCR-versterking in een enkele buis worden uitgevoerd. Naarmate de versterking van het specifieke doelwit plaatsvindt, is er meer kleurstof gebonden, wat resulteert in real-time verhoogde fluorescentie niveaus. Alle kleurstof intercalating real-time assays moeten in twee fasen worden geïnterpreteerd: versterking en dissociatie. De versterkings fase is identiek aan elke real-time versterking (Figuur 1A). Er is een lineaire ' vroege fase ' tijdens de vroege cycli waar de DNA-versterking niet kan worden berekend als gevolg van onvoldoende signaal ten opzichte van de achtergrond. De lengte van deze is rechtstreeks gerelateerd aan de hoeveelheid doel in het voorbeeld. Vervolgens is er een exponentiële fase waarin de verdubbeling van DNA-moleculen wordt gedetecteerd en geregistreerd. Ten slotte wordt de plateaufase bereikt (afgezien van de zeer verdunde monsters die deze fase niet voor het einde van het programma kunnen bereiken). In deze fase, de intensiteit van de fluorescentie niveaus uit, als gevolg van de uitputting van reagentia. De versterkings plots die werden waargenomen met een 10-voudige seriële verdunning van CV'S, die op de verwachte waarnemingspunten werden geconformeerd (Figuur 1AC) waar de Lyssavirus test een hogere gevoeligheid vertoonde dan de ß-actin test. De dissociatie curve werd berekend na versterking, waarbij het dsDNA werd losgekoppeld in ssDNA door een incrementele stijging van de temperatuur en de fluorescentie gecontroleerd als een functie van temperatuur (Figuur 1B, D-F). De drempel temperatuur waarbij de specifieke ampliconlengte voor temp dissocieert in ssdna, veroorzaakte een afgifte van fluorescentie, die werd gemeten door de Thermocycler software (TM). Deze dissociatie fase verstrekte gegevens op de grootte van de ampliconlengte voor temp, waardoor de gebruiker om het resultaat in vergelijking met een positieve controle te interpreteren, wat resulteert in een verwaarloosbare waarschijnlijkheid van vals-positieve resultaten. De TMbij gebruik van de pan-Lyssavirus-test (Figuur 1B) en ß-actin assay (Afbeelding 1D) zijn verschillend en hebben de gebruiker geholpen om de juiste assay-analyse te bevestigen doorMverkregenFiguur 1E). Bovendien heeft de CTen TMwaarden tussen runs en operatoren werden geëvalueerd en aangetoond dat ze reproduceerbaar waren (Tabel 5). De drempelwaarde die wordt gebruikt voor het berekenen van de CTde waarde werd automatisch berekend door de software en is afhankelijk van vele factoren, waaronder de reactiemix of het gebruikte instrument. Over de 12 onafhankelijke runs is de gemiddelde CTwas 20,66 (SD 0,63) voor de Lyssavirus assay en 27,5 (SD 1,13) voor de ß-actin test. In tegenstelling tot de variatie waargenomen in de TMde waarden waren aanzienlijk lager, vanwege het gebrek aan externe invloeden op deze meting. Bijvoorbeeld, de gemiddelde TMvoor de CVS Lyssavirus assay was 78,92 (SD 0,16) (Tabel 5), in vergelijking met het gemiddelde van alle lyssavirussen 78,81 °C (SD 0,531) (Tabel 6EnFiguur 1F). Dit gebrek aan variatie in de TMover de hele Lyssavirusgeslacht is voordelig als dezelfde controle RNA kan worden gebruikt ongeacht het Lyssavirus in het monster, echter differentiëren tussen de Lyssavirus soorten met behulp van de TMniet mogelijk is, met name omdat de verschillende sub-lijn afstanden het bereik van TMwaargenomen waarden (Tabel 6). Niet-specifieke versterkings plots worden zelden waargenomen met deze test; specifieke parameters voor het definiëren van een positief resultaat versus een niet-specifiek negatief resultaat zijn echter vereist. De SD waargenomen over alle lyssavirussen (0,531) werd toegepast op de laagste (77,34-LBVa) en hoogste (79,67-IKOV) waargenomen TMwaarden voor het instellen van een bereik 76,8 °C-80,2 °C voor positieve specifieke banden. Daarom TMwaarden buiten dit bereik werden beschouwd als niet-specifiek en dus een negatief resultaat. Er worden af en toe meerdere pieken waargenomen voor een monster. Als de dominante piek op de juiste TM(voor elke replicaat) wordt het monster als positief beschouwd. De meest voorkomende reden dat een niet-specifieke piek wordt waargenomen, is te wijten aan primer-dimers, de assay is geoptimaliseerd om primer dimers te minimaliseren. Primer Dimeren resulteren meestal in een ampliconlengte voor temp kleiner dan die van de doel sequentie, dus zou een TMlager is dan het specifieke product.
Een 10-voudige seriële verdunning van drie Lyssavirus positieve hersen monster Rna's geëxtraheerd met behulp van TRIzol, werden parallel uitgevoerd en uitgezet (Figuur 2). De aantoonbaarheidsgrens voor de drie lyssavirussen varieerde, maar geen overschreden Ct 36. De R2 -coëfficiënt waarden voor de in Figuur 2 geplot virussen varieerden van 0,9637 en 0,996. Voor alle geanalyseerde virussen (tabel 6) was het bereik niet hoger dan dit, bovendien, 7 van de 29 Lyssavirus had R2 > 0.99 (gegevens niet weergegeven). Rekening houdend met het voorkomen van de verdunningsreeks van totale RNA-extracties, levert de waargenomen lineariteit het bewijs dat de test robuust is. Tot slot, detectie van alle Lyssavirus soorten (met name de meest diverse phylogroup III virussen) werd onderzocht met behulp van een panel van Rna's verspreid over alle drie phylogroups in de Lyssavirus geslacht. RNA geëxtraheerd uit ofwel originele, of experimenteel geïnfecteerde muizen, hersen materiaal, werd gebruikt met behulp van de hierboven beschreven protocollen. De resultaten bevestigen dat de primers alle Lyssavirus soorten versterken, waaronder de divergerende phylogroup III lyssavirussen IKOV, WBCV en LLEBV (tabel 6 en Figuur 3). Een divers panel van niet-Lyssavirus rhabdovirussen, oorspronkelijk verzameld en geanalyseerd geen16, en meer recentelijk genetisch17 werden gescreend en no-cross reactiviteit werd gedetecteerd, wat aangeeft dat de primers specifiek zijn voor leden van het geslacht Lyssavirus alleen (gegevens niet weergegeven). De pan-Lyssavirus real-time assay is opgenomen in de interlaboratoriumbekwaamheids Programma's van het EURL (EU-referentielaboratorium) sinds 2013, waarbij 100% overeenstemming wordt aangetoond met andere moleculaire assays, zoals de panlyssavirus TaqMan assay en de conventionele RT-PCR-assay naast het vet (fluorescerende antilichaam test).
Afbeelding 1:10-fold seriële verdunning van CVS-positieve controle RNA, uitgevoerd op de pan-Lyssavirus RT-PCR-test, gevisualiseerd als het versterkings plot (a) en dissociatie curve (B), en uitgevoerd op de ß-actin RT-PCR-test gevisualiseerd als het versterkings plot (C), en Dissociatie curve (D). NTC = geen sjabloon besturingselement. Vergelijking van de CVS-controle RNA op zowel de pan-Lyssavirus RT-PCR-test (blauw) als de ß-actin RT-PCR-test (rood) die het verschil in dissociatie curves aantonen (E) — Zie tabel 5 voor de gemiddelde waarden; en ten slotte dissociatie curves voor LBVa (blauw) en IKOV (rood) die het bereik van Tm -waarden aantonen dat is waargenomen in het Lyssavirus genus (F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2:10-fold seriële verdunningen voor drie Lyssavirus soorten: RABV (RV108), DUVV (RV131) en ARAV (RV3379). Respectievelijk R2 = 0,996, 0,9962 en 0,9637. De gegevenspunten bij 10-7 (0,0001 ng/μL) bereikten de aantoonbaarheidsgrens (waar een waarde werd verkregen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve 10-voudige seriële verdunnings gegevens van het geslacht Lyssavirus (zie afzonderlijke legenda's voor Lyssavirus-identiteit en tabel 6 voor getabelleerde resultaten in vergelijking met andere lyssavirussen). Panelen a, c, e, G versterkings plots en B, D, F, H dissociatie curves voor respectievelijk a, c, e en g. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reagens | μL/reactie |
| Water van moleculaire kwaliteit | 7,55 |
| 2x universele RT PCR-reactiemix | 10 |
| Primer voorwaarts [20 μM] | 0,6 |
| Omgekeerde primer [20 μM] | 0,6 |
| RT enzym mix | 0,25 |
| Totaal per reactie | 19 |
Tabel 1: pan-Lyssavirus real-time RT-PCR-Master Meng reagentia.
| Assay | Naam primer | Primer rol | Sequentie 5 '-3 ' | Positie1 |
| Lyssavirus | JW12 | RT-PCR | ATG TAA CAC CYC TAC AAT G | 53-73 |
| N165 | Pcr | GCA GGG TAY TTR TAC TCA TA | 165-146 | |
| ß-actin | ß-actin intronic | Pcr | CGA TGA AGA TCA AGA TCA TTG | 1051-1072 |
| ß-actin reverse | RT-PCR | AAG CAT TTG CGG TGG AC | 1204-1188 | |
| Primer posities worden gegeven met betrekking tot Pasteur virus sequentie (M13215) en de muis ß-actin gensequentie (NM_007393) | ||||
Tabel 2: pan-Lyssavirus real-time RT-PCR primer Details.
| Fase | Cycli | Temperatuur | Tijd | Gegevensverzameling |
| Omgekeerde transcriptie | 1 | 50 °C | 10 min. | |
| RT inactivatie/initiële denaturatie | 1 | 95 °C | 5 min. | |
| Versterking | 40 | 95 °C | 10 s | |
| 60 °C | 30 s | eindpunt | ||
| Analyse van dissociatie curve | 1 | 9 °C | 1 min | |
| 55 °C | 1 min | |||
| 55-95 °C | 10 s | alle punten |
Tabel 3: pan-Lyssavirus real-time RT-PCR-fiets condities.
| Test resultaat | Interne ß-actin controle | Totaalresultaat |
| Negatieve | Negatief1 | Ongeldig. Herhaalde extractie en assay2 |
| Negatieve | Positieve | Negatief resultaat gerapporteerd |
| Positieve | Positieve | Positief resultaat gerapporteerd |
| Positieve | Negatief1 | Herhaalde extractie en assay3 |
| 1 Het gebruik van heterologeuze externe controle zou voordelig zijn tijdens herhaalde extractie. | ||
| 2 Als voor de interne controle een tweede negatief resultaat wordt verkregen, wordt het monster door deze test als niet-testable gerapporteerd. | ||
| 3 Als een tweede negatief resultaat wordt verkregen voor de interne controle, naast een positief testresultaat, een secundaire rabiës | ||
| de diagnostische test moet worden uitgevoerd om dit resultaat te bevestigen. | ||
Tabel 4: samenvatting van uitkomsten en algemene resultaten voor pan-Lyssavirus real-time RT-PCR. Negatief is aangewezen op een monster met geen Ct -waarde (amplificatie) en geen smelttemperatuur (dissociatie), of een smelttemperatuur die buiten het tm -bereik ligt voor positieve lyssavirussen (76,8 °c-80,2 °c). Positief is aangewezen op een monster met een Ct -waarde (amplificatie) en een smelttemperatuur (dissociatie) die zich in het tm -bereik bevindt voor positieve lyssavirussen.
| Lyssavirus assay | ß-actin assay | |||
| Ct | Tm | Ct | Tm | |
| Bedoel | 20,66 | 78,92 | 27,5 | 85,26 |
| Sd | 0,63 | 0,16 | 1,13 | 0,35 |
| LCL (95%) | 19,39 | 78,59 | 25,23 | 84,56 |
| UCL (95%) | 21,93 | 79,25 | 29,76 | 85,96 |
Tabel 5: analyse van de CVS-positieve controle over 12 onafhankelijke runs, waaronder meerdere operatoren.
| Phylogroup | Soort(en) | Virus-ID | Geslacht | Aantoonbaarheidsgrens | Tm |
| I | RABV | RV50 | US bat | 10-5 | 79,5 |
| I | RABV | RV51 | US Fox | 10-7 | 77,6 |
| I | RABV | RV108 | Chili vleermuis | 10-7 | 78,63 |
| I | RABV | RV313 | Europese Vos | 10-9 | 78,53 |
| I | RABV | RV437 | Europese RacDog | 10-7 | 78,09 |
| I | RABV | RV1237 | Europees hert | 10-8 | 78,76 |
| I | RABV | RV334 | Chinees vaccin | 10-8 | 79,03 |
| I | RABV | RV102 | Afrika 2 | 10-7 | 78,58 |
| I | RABV | RV995 | Afrika 3a | 10-8 | 79,66 |
| I | RABV | RV410 | Afrika 3B | 10-7 | 79,03 |
| I | RABV | RV2324 | Afrika 4 | 10-7 | 79,17 |
| I | RABV | RV2417 | Sri Lanka hond | 10-9 | 78,71 |
| I | RABV | CVS-11 | 10-7 | 79,17 | |
| I | EBLV-1 | RV20 | Duitsland | 10-6 | 79,05 |
| I | EBLV-2 | RV1787 | Uk | 10-7 | 78,76 |
| I | BBLV | RV2507 | Duitsland | 10-9 | 78,71 |
| I | ABLV | RV634 | 10-8 | 78,25 | |
| I | DUVV | RV131 | 10-5 | 79,03 | |
| I | GBLV | RV3269 | 10-7 | 79,15 | |
| I | ARAV | RV3379 | 10-7 | 79,46 | |
| I | KHUV | RV3380 | 10-7 | 78,97 | |
| I | SHIBV | RV3381 | 10-7 | 78,59 | |
| I | IRKV | RV3382 | 10-3 | 78,59 | |
| Ii | LBVa | RV767 | 10-5 | 77,34 | |
| Ii | LBVd | RV3383 | 10-7 | 78,59 | |
| Ii | MOKV | RV4 | 10-3 | 78,81 | |
| Iii | IKOV | RV2508 | 10-5 | 79,67 | |
| Iii | LLEBV | RV3208 | 10-4 | 79,15 | |
| Iii | WCBV | RV3384 | 10-3 | 79 |
Tabel 6: samenvatting van pan-Lyssavirus real-time RT-PCR-specificiteit, gevoeligheid en Tm voor representatieve lyssavirussen in alle drie de fylogroepen. De gemiddelde Tm over lyssavirussen was 78,81 (SD 0,531).
Discussion
De beschreven pan-Lyssavirus real-time RT-PCR-test is een gesloten buis, één stap test die lyssavirussen in alle drie phylogroepen detecteert. De test is gevalideerd voor de diagnose van zowel dier-als humane rabiës, waaronder postmortemse hersenweefsel (optimaal hersenstam) en antemmortem monsters zoals huid biopsie, in serie verzamelde speeksel of cerebrale spinale vloeistof (CSF). De primers die in deze test werden gebruikt, werden voor het eerst ontworpen en gebruikt voor een sonde-gebaseerde assay om onderscheid te maken tussen RABV, EBLV-1 en EBLV-23, die in veel OIE-rabiës laboratoria is gebruikt en consistent presteert in de EURL-bekwaamheids schema's. Vervolgens is het ' pan-lyssavirus'-karakter van deze primers bevestigd met behulp van een 2-stappen real-time assay15. De hier beschreven bepaling heeft de primers gebruikt om de RT-PCR verder te optimaliseren in een éénstsluitende SYBR-assay die een snel systeem met gesloten buizen mogelijk maakt. Bovendien heeft de opleiding in endemische landen met rabiës met behulp van deze test de geschiktheid bevestigd om in elk laboratorium met basis BESCHERMINGSmiddelen en kwaliteitssystemen te implementeren om kruisbesmetting en traceer monsters te verminderen, faciliteiten om de reagentia op te slaan en een real-time machine met SYBR-detectie. De assay is extreem robuust en heeft 100% correlatie met het vet, met verbeterde gevoeligheid voor afgebroken monsters3. Een van de belangrijkste voordelen voor een DNA-intercalciërende kleurstof analyse in vergelijking met een test op basis van een sonde is de relatieve kosten. Een bijkomend voordeel is dat de assay slechts twee primers gebruikt, waardoor er minder kans is op mislukte detectie vanwege sequentie divergentie, wat een zwakte is geweest in eerder gepubliceerde sonde-gebaseerde testen. Inderdaad, vertegenwoordigers van alle Lyssavirus soorten (afgezien van TWBLV en KBLV) worden gedetecteerd met behulp van deze test, en sequentieanalyse van TWBLV en KBLV over de primer sites onthult geen significante divergentie die sterk suggereert dat ze ook zullen worden gedetecteerd met behulp van Deze methode. Het bereik van de aantoonbaarheidsgrens die wordt waargenomen bij de geanalyseerde virussen, kan worden beschouwd als gevolg van twee belangrijke factoren. De eerste is dat het RNA werd geïsoleerd van klinisch hersen materiaal, daarom is de hoeveelheid genoom kopieën in elk onverdund monster niet direct vergelijkbaar. Het RNA werd ' genormaliseerd ' door het totaal RNA op 1 μg/μL aan te passen; echter, het aandeel van virale genoom RNA binnen dat monster zal variëren. De tweede is de diversiteit van Lyssavirus sequenties, ondanks de primer sites die zich in gecondengeerde regio's bevinden, blijven er posities van variatie. Daarom is het niet verwonderlijk dat de meerderheid van lyssavirussen met een lagere gevoeligheid voor de assay phylogroup II en III virussen zijn. De dissociatie curve analyse vertegenwoordigt een essentiële parameter, het minimaliseren van een vals positief resultaat dat anders zou kunnen optreden als gevolg van de vorming van primer dimers, of versterking van een niet-specifieke regio in de gastheer genoom. In werkelijkheid is dit een zeldzame gebeurtenis en de dissociatie curve analyse is equivalent aan het uitvoeren van een agarose-gel voor het visualiseren van de juiste grootte van conventionele RT-PCR-amplicons. Het bereik van acceptabele Tm -waarden is opgegeven (77-80 °c), op basis van de gegevens die in ons laboratorium zijn verzameld. Het wordt sterk aanbevolen dat individuele laboratoria in-House gegevens verzamelen om ervoor te zorgen dat het bereik overdraagbaar is en dienovereenkomstig wordt gewijzigd. De interpretatie van de resultaten van zowel de versterkings-als de dissociatie plots, naast de positieve en negatieve controles en de ß-actin resultaten, maakt robuuste en reproduceerbare diagnostische uitkomsten mogelijk.
Buiten het toepassingsgebied van dit protocol is de RNA-extractiemethode die wordt gebruikt om RNA van hoge kwaliteit te verkrijgen. Alle RNA geanalyseerd in dit protocol werd bereid met behulp van TRIzol; Er zijn echter veel geschikte op guanidium gebaseerde extracties RNA-extractie protocollen beschikbaar, inclusief op kolom en kraal gebaseerde extractie Kits. Het gebruik van Lyssavirus positieve (of vermoede) monsters moet binnen de erkende biocontainmentfaciliteiten binnen het land zijn. Echter, het totale RNA geëxtraheerd is niet-infectieuze, daarom behandeld binnen lage containment laboratoria. Afhankelijk van de gebruikte extractiemethode moet de vereiste om het RNA te kwantificeren en te verdunnen worden beoordeeld. Voor op fenol gebaseerde extracties, waaronder TRIzol, is deze stap vereist en voorkomt remming van de test tegen contaminerende gDNA; echter, kolom-en kraal-gebaseerde extracties (met name die met een DNA-depletie fase) vereisen geen verdunning voorafgaand aan het testen.
In het hele protocol is het essentieel dat zorg en toewijding worden gebruikt om kruisbesmetting en nauwkeurige toevoeging van monster aan de juiste putten te voorkomen. Een spreadsheet met de reagens berekeningen en plaat indeling is als aanvullend bestand beschikbaar om te downloaden. Goede laboratoriumpraktijken, waaronder schone werkoppervlakken, regelmatige veranderingen van handschoenen, het gebruik van barrière tips en verschillende kamers/UV-kasten om elke fase te scheiden, minimaliseren de kans op verontreiniging. Om ervoor te zorgen dat de test met de verwachte parameters presteert, moeten positieve en negatieve controles worden opgenomen en worden alle test monsters in tweevoud (of drie) uitgevoerd.
Het opnemen van controles is een essentieel kenmerk van elke PCR, met name voor diagnostiek. Positieve controle RNA werd bereid uit CVS (Challenge virus Standard) geïnfecteerde muizenhersenen in batches en gevalideerd en gekalibreerd om consistentie tussen batches te garanderen. Het RNA van de controle werd gekwantificeerd en verdund tot 1 μg/μL. RNA waarvoor een positief resultaat werd verkregen in een seriële verdunning tot ten minste 10-4 (gelijk aan 100 PG/μl) werd geschikt geacht voor het beoogde doel. De positieve controle RNA werd opgeslagen bij-80 °C in 10-1 aliquots. Indien nodig werd een aliquot verdund tot 1:100 voor een werkende kolf van 1 ng/μL en opgeslagen bij-80 °C in 5 μL enkelvoudige aliquots voor eenmalig gebruik. De verdunde positieve controle RNA werd gebruikt om lage positieve monsters te vertegenwoordigen, en om ervoor te zorgen dat elke vermindering van de gevoeligheid van de assay werd gedetecteerd. Voor elke controle werd een ' controlekaart ' bijgehouden om de Ct -waarden te bewaken en trends te identificeren (tabel 5). Tabel 5 toonde een goede onderlinge vergelijkbaarheid voor de CVS-positieve controlemonster CT -en tm -waarden over meerdere dagen en exploitanten, met de verzekering dat de test robuust en reproduceerbaar is. De resultaten die afwijken van deze metingen moeten worden onderzocht en indien nodig moeten test monsters worden herhaald. Moleculair water werd bij elke run opgenomen als een NTC om te bevestigen dat de reagentia vrij waren van besmetting met Lyssavirus RNA en een negatief monster te bevestigen. Bovendien werd ß-actin, om de werkzaamheid van RNA-extractie te garanderen, samen met de test monsters in een aparte buis getest. Het Lyssavirus positieve controle RNA werd ook gebruikt voor de ß-actin positieve controle. Andere endogene genen of heterologeuze interne controlesystemen kunnen worden gebruikt. Het gebruik van deze besturingselementen zorgde ervoor dat alle stappen werden geanalyseerd onder dezelfde omstandigheden als de testsamples. Soms, als het monster sterk werd afgebroken of niet voldoende gastheer RNA bevat (zoals speeksel of CSF), kan de endogene genpcr mislukken. In dit geval, waar het Lyssavirus real-time RT-PCR-resultaat positief was, bevestiging op een onafhankelijke RNA-extractie-om besmetting te voorkomen tijdens RNA-extractie op de oorspronkelijke test of door een secundaire test (ofwel moleculaire, zoals conventionele RT-PCR) , of vet. Het gebruik van tabel 4 tijdens de analyse van een diagnostisch monster zorgde voor de juiste interpretatie.
Ongeacht de moleculaire assay die wordt gebruikt om een infectie met rabiës te bevestigen, follow-up onderzoeken met Sanger-sequencing om de soorten Lyssavirus te bepalen en klassieke technieken in virologie zoals vet of virusisolatie moeten ook worden ondernomen om het mogelijk te maken verdere virus karakterisering en ondersteuning van de melding van positieve gevallen aan OIE en WHO.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Miss Emma Wise en Miss Megan Golding bedanken voor hun hulp bij het afronden van de experimenten. De ontwikkeling van dit protocol werd financieel gesteund door het Britse ministerie van milieu, voedsel en Plattelandszaken (DEFRA), de Schotse regering en de regering van Wales door subsidies [SV3500 en SE0431] en door het Europese virus Archive Global (EVAg) project dat financiering ontvangen uit het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 653316.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
| Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
| Centrifuge (mico) | Sigma | ||
| Finnpipettes (to dispense 0.5-1,000 µL) | Thermofisher | various | |
| iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
| MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
| MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
| Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
| Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
| Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
| Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
| Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
| Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
| Unless stated, alternative equipment can be used |
References
- OIE. OIE Terrestrial Manual 2018. , 8-14 (2018).
- Panning, M., et al. Comparative analysis of rabies virus reverse transcription-PCR and virus isolation using samples from a patient infected with rabies virus. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2960-2962 (2010).
- Wakeley, P. R., et al. Development of a real-time, TaqMan reverse transcription-PCR assay for detection and differentiation of lyssavirus genotypes 1, 5, and 6. Journal of Clinical Microbiology. 43 (6), 2786-2792 (2005).
- Wang, L., et al. A SYBR-green I quantitative real-time reverse transcription-PCR assay for rabies viruses with different virulence. Virologica Sinica. 29 (2), 131-132 (2014).
- Wadhwa, A., et al. A Pan-Lyssavirus Taqman Real-Time RT-PCR Assay for the Detection of Highly Variable Rabies virus and Other Lyssaviruses. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (1), e0005258 (2017).
- Nadin-Davis, S. A., Sheen, M., Wandeler, A. I. Development of real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction methods for human rabies diagnosis. Journal of Medical Virology. 81 (8), 1484-1497 (2009).
- Hoffmann, B., et al. Improved safety for molecular diagnosis of classical rabies viruses by use of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR "double check" strategy. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3970-3978 (2010).
- Faye, M., et al. Development and validation of sensitive real-time RT-PCR assay for broad detection of rabies virus. Journal of Virological Methods. 243, 120-130 (2017).
- Dacheux, L., et al. Dual Combined Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Assay for the Diagnosis of Lyssavirus Infection. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), e0004812 (2016).
- Fooks, A. R., et al. Rabies. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17091 (2017).
- Marston, D. A., et al. Ikoma lyssavirus, highly divergent novel lyssavirus in an african civet. Emerging Infectious Diseases. 18 (4), 664-667 (2012).
- ICTV. Virus Taxonomy: 2018 Release: Email ratification October 2018 (MSL #33). , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy/ (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Disease. 24 (4), 782-785 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hayman, D. T., et al. A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses. Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).
- Calisher, C. H., et al. Antigenic relationships among rhabdoviruses from vertebrates and hematophagous arthropods. Intervirology. 30 (5), 241-257 (1989).
- Aznar-Lopez, C., et al. Detection of rhabdovirus viral RNA in oropharyngeal swabs and ectoparasites of Spanish bats. Journal of General Virology. 94 (1), 69-75 (2013).
