Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Published: June 16, 2019 doi: 10.3791/59714

Summary

כאן, אנו מציגים מספר שיטות פשוטות להערכת הכדאיות והמוות ב-3D הסרטן תאים spheroids, אשר לחקות את פיזיקאלית-כימיים מעברי הצבע של גידולים vivo הרבה יותר טוב מאשר תרבות דו-ממדית. מודל ספרואיד, לכן, מאפשר הערכה של יעילות התרופה לסרטן עם תרגום משופר בתנאים vivo.

Abstract

Spheroids תלת מימדי של תאים סרטניים הם כלים חשובים עבור שני מסכי תרופה לסרטן, לקבלת תובנה מכניסטית לביולוגיה תא סרטן. הכוח של הכנה זה טמון ביכולתה לחקות היבטים רבים של התנאים vivo של גידולים תוך להיות מהיר, זול, תכליתי מספיק כדי לאפשר יחסית הקרנת תפוקה גבוהה. תנאי התרבות הספרואיד יכולים ללכוד את מעברי הצבע הפיזיקאלית-כימיים בגידול, כולל חומציות החילוץ ההולכת וגוברת, מוגברת לקטט, והפחתת הגלוקוז וזמינות החמצן, מהפריפריה הספרואיד עד ליבה. כמו כן, תכונות מכניות ואינטראקציות תא התא של גידולים vivo הם חלק מחקה על ידי מודל זה. המאפיינים הספציפיים וכתוצאה מכך את תנאי הצמיחה האופטימלי, של spheroids 3D, שונים באופן נרחב בין סוגים שונים של תאים סרטניים. יתר על כן, הערכת הכדאיות של תאים ומוות ב-spheroids 3D דורש שיטות שונות בחלק מאלה מועסקים עבור תרבויות דו-ממדיות. כאן אנו מתארים מספר פרוטוקולים להכנת spheroids תלת-ממד של תאים סרטניים, ועל שימוש בתרבויות כאלה כדי להעריך את הכדאיות התאים ואת המוות בהקשר של הערכת היעילות של תרופות נגד סרטן.

Introduction

השימוש במודלים ספרואידים בביולוגיה של סרטן הוא מספר עשורים בן1,2, אבל צבר מומנטום משמעותי בשנים האחרונות. בחלק הגדול, זה משקף את המודעות הגוברת של כמה חזק הפנוטיפ של תאים סרטניים תלוי המיקרוסביבה שלהם ותנאי גדילה ספציפיים. המיקרואקולוגיה בגידולים מוצקים שונה ביסודה מזה ברקמות הנורמלי המקביל. זה כולל מצבים פיזיקאלית-כימיים כגון pH, מתח חמצן, כמו גם הלחץ ביניים, ריכוז מעברי הצבע של גורמים מסיסים כגון חומרים מזינים, פסולת מוצרים, מופרש תרכובות איתות (גורמי גדילה, ציטוקינים). יתרה מזאת, היא כוללת את הארגון של מטריצה החילוץ (ecm), אינטראקציות תא תא ו איתות התרבות, והיבטים אחרים של הארכיטקטורה תלת ממדית מסוימת (3d) של הגידול3,4, 5,6. התנאים המיקרוסביבתיים הספציפיים שבהם תאים סרטניים קיימים, משפיעים עמוקות על פרופיל הביטוי הגנטי שלהם ועל תכונות הפונקציונליות שלהם, וברור כי בהשוואה לאלה של תאים שגדלו ב-2D, הפנוטיפ של הספרואידים תלת-ממדיים הרבה יותר מחקה מקרוב זה של בvivo גידולים7,8,9,10,11. 2D מודלים, גם אם הם מעסיקים היפוקסיה, חומציות חומצי, וריכוזים גבוהים לקטט לחקות היבטים ידועים של מיקרוסביבה הגידול, עדיין להיכשל ללכוד את מעברי הצבע של הפרמטרים פיזיקאלית-כימיים הנובעים בתוך גידולים, כמו גם גידול תלת-ממד שלהם אדריכלות. מאידך, מודלים בעלי חיים יקרים, איטיים ובעייתיים באופן מבחינה מוסרית, ובדרך כלל גם יש חסרונות ביכולתם ללכוד את מצבם של הגידול האנושי. אפוא, 3d spheroids הוחלו כמודל מורכבות ביניים במחקרים של מגוון רחב של מאפיינים של סרטן מוצק ביותר9,11,12,13, 14,15,16,17.

שימוש נרחב בשימוש בspheroids 3d הוא בהקרנה בחני של טיפול אנטי סרטן יעילות9,18,19,20. תגובות הטיפול רגישות במיוחד מיקרוסביבה הגידול, המשקף הן את ההשפעה של tortuosity, דיפוזיה מוגבלת, לחץ ביניים גבוהה, ו-pH הסביבה חומצי על משלוח תרופות, ואת ההשפעה של היפוקסיה ועוד היבטים של המיקרו-סביבה על תגובת מוות בתא9,17. בגלל הסביבה בתוך spheroids 3d מפתחת באופן מיסודו את כל המאפיינים הללו7,8,9,10,11, העסקת תרבויות 3d תאים יכול ל לשפר באופן משמעותי את התרגום של תוצאות בתנאים vivo, ועם זאת לאפשר הקרנת תפוקה גבוהה יעילה ובמחיר סביר של הצמיחה נטו. עם זאת, הרוב הגדול של המחקרים על תגובת התרופה של תאים סרטניים עדיין מתבצעות תחת תנאים 2D. זה כנראה משקף כי, בעוד כמה בחני יכול בקלות להיות מיושם עבור תרבויות תא תלת-ממד, רבים, כגון הכדאיות, כתמים מערביים, וניתוח immunofluorescence, הם הרבה יותר נוח לעשות ב-2d מאשר 3d.

מטרת העבודה הנוכחית היא לספק בקלות הקלה מענה ופרוטוקולים מדויקים עבור ניתוחים של השפעת הטיפול עם תרופות נגד סרטן על הכדאיות של תאים סרטניים והישרדות בקביעת הגידול תלת ממדי מחקה. באופן ספציפי, אנו מספקים ולהשוות שלוש שיטות שונות עבור היווצרות כספרואיד, ואחריו שיטות לניתוח איכותי וכמותי של צמיחה, הכדאיות ותגובת התרופה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הדור של הספרואידים

  1. הכנת השעיות של תאים עבור היווצרות הספרואיד
    הערה:
    לקווי תאים שונים יש מאפייני הדבקה שונים מאוד והפרוטוקול המתאים ביותר של היווצרות הספרואיד חייב להיות מבוסס בכל מקרה. מצאנו כי MCF-7 ו-BxPC-3 תאים מתאימים היווצרות ספרואיד ספונטנית, בעוד מד א-MB-231, SKBr-3, Panc-1 ו-MiaPaCa דורשים תוספת של קרום מרתף מחדש לטופס בהצלחה spheroids. רק מד א-MB-231 ו BxPC-3 תאים שהיו מועסקים עבור פרוטוקול ירידה תלויה, עם זאת קווי תאים אחרים בהחלט ישים.
    1. הגדל תאים כמונאולייר עד 70-80% השטף.
    2. לשטוף תאים עם תמיסת מלח מאגור פוספט (1x PBS, 5 מ"ל עבור 25 ס מ2 או 10 מ"ל עבור 75 ס מ2 בקבוקון), להוסיף את האנזים הדיסוציאציה של התא (0.5 mL עבור 25 ס"מ או 1 מ"ל עבור 75 ס מ2 בקבוקון) ו מודרת תאים עבור 2-5 דקות ב 37 ° c ב 5% CO2 ו 95% לחות.
    3. בדוק את התנתקות התא תחת מיקרוסקופ ולנטרל את האנזים הדיסוציאציה של התא על ידי הוספת בינונית צמיחה (6-10% סרום בהתאם לקו התא) לנפח הכולל של 5 מ"ל ב 25 ס מ2 או 10 מ ל עבור 75 ס מ2 בקבוקון.
    4. השתמש בחדר בורקר כדי לספור תאים ולספור 8 ריבועים בחדר לכל ההכנה לתא כדי לקבל מהווה מהווה מהווה בגודל של הספרואידים.
      הערה: שלושה פרוטוקולים כל אחד מתאר שיטה שונה עבור היווצרות כספרואיד מוצגים להלן. פרוטוקול 1.2 ו 1.3 יכול לשמש עבור כל הפרוטוקולים האנליטיים הבאים הציג, בעוד פרוטוקול 1.4 הוא המתאים ביותר להטבעה ולאחר ההכנות. בהתאם לקו התא, היווצרות ספרואיד לוקח 2-4 ימים, ללא קשר לשיטה שבשימוש.
  2. מבנה ספרואיד ספונטני
    1. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.4.
    2. לדלל את ההשעיה התא בצינור 15 מ ל כדי להשיג 0.5-2 x 104 תאים/mL (צפיפות התא אופטימלית צריך להיקבע עבור כל קו תא) (איור 1א (ii)).
    3. ממלאים את הטבעת החיצונית של בארות עם 1x PBS או בינוני גדילה כדי להפחית אידוי מבארות שנותרו. להעביר את ההשעיה התא כדי מאגר סטרילי, באמצעות הצנרת רב-ערוצי, לוותר 200 μL/גם לתוך הקובץ המצורף אולטרה נמוך 96-היטב לוחות התחתונה עגול (איור 1a).
    4. מודקת את הצלחת בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2, 95% לחות.
    5. כל 2-3 ימים רוכשים תמונות מיקרוסקופיים קלות של הספרואידים.
      הערה: התמונות בנייר זה נלקחים בהגדלה 11.5 x, אשר מתאים ביותר spheroids שהוכנו באמצעות פרוטוקולים אלה.
    6. כל 2-3 ימים (לאחר רכישת תמונות) להחליף 100 μL של בינוני (להסיר 100 μL של בינוני בילו ולהחליף עם 100 μL של מדיום טרי.
      הערה: כדי למנוע הסרת spheroids בעת החלפת בינוני, מומלץ להטות את הצלחת קצת באיטיות הסרת המדיום ולבדוק את המדיום משומת בטיפים לראות spheroids לפני להשליך אותו.
  3. מבנה מרתף ממברנה-תיווך ספרואיד.
    הערה:
    הנגיף לקטוז דהידרוגנאז וירוס (ldev)-גורם הצמיחה מופחת ללא שימוש קרום המרתף (rbm) שימש. rBM הוא רגיש לטמפרטורה ויש לשמור תמיד על קרח, כפי שהוא יהיה לקריש אם הוא מגיע 15 ° c. הפשרת rBM על הקרח או לילה ב 4 ° צ' או 2-4 h בטמפרטורת החדר (RT) לפני ציפוי.
    1. הפשרת rBM על הקרח (ראה טבלת חומרים).
    2. לשמור על הצלחות ומאגרים (אם עטוף בנפרד) על הקרח לפני השימוש.
    3. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.4.
    4. ממלאים את הטבעת החיצונית של בארות עם 1x PBS או בינוני גדילה כדי להפחית אידוי מבארות שנותרו. לדלל את ההשעיה התא בצינור 15 מ ל כדי להשיג 0.5-2 x 104 תאים/mL (צפיפות התא אופטימלית צריך להיקבע עבור כל קו תא) (איור 1א (ii)).
    5. מניחים את השפופרת 15 מ"ל המכילה את ההשעיה התא מדולל על קרח (למשל, בגביע הזכוכית) (איור 1א (iia)).
    6. להעביר את הצלחות מקורר ומאגרים למכסה המנוע. לשטוף מכולות פלסטיק, למלא אותם בקרח ולהעביר אותם לתוך המכסה כדי לאפשר את הצלחות ומאגרים להיות ממוקם על הקרח במהלך ההליך כולו.
    7. השהה מחדש את rBM בעדינות כדי להבטיח ג'ל הומוגנית.
    8. הוסף 1-2% rBM (הריכוז האופטימלי צריך להיקבע עבור כל קו תא) להשעיות התא הצוננים (איור 1א (iib)).
    9. היפוך שפופרת 15 mL כדי להבטיח ערבוב נכון של rBM וההשעיה התא לפני לחלק את ההשעיה לתוך הצלחת.
    10. להעביר את rBM מכיל תא הבולם למאגר סטרילי ולוותר 200 μL/גם לתוך מכיל מצורף אולטרה נמוך המצורף 96-היטב צלחות באמצעות פיפטה רב-ערוצי (איור 1a).
      הערה: אם עבודה עם מספר השעיות תא (למשל, יותר מקו תא אחד), זה חיוני לוותר על כל השעיה התא מיד לאחר rBM בנוסף כדי למנוע הגלינג מוקדמת.
    11. צנטריפוגה את הצלחת עבור 15 דקות ב 750 x g באמצעות ' הגון רך '/לא בלימה (אם אפשר, צנטריפוגה ב 4 ° צ' כדי לשמור את הנוזל rbm יותר, אבל לא דרישה עבור היווצרות ספרואיד מוצלחת), כדי להבטיח כי התאים מקובצים יחד כאשר rbm מתקשה, להקל על היווצרות של ספרואיד אחד בודד.
    12. מודקת את הצלחת באינקובטור (37 ° c, 5% CO2, 95% לחות).
    13. כל 2-3 ימים לרכוש תמונות מיקרוסקופיים אור להערכה של צמיחה ספרואיד.
    14. כל 2-3 ימים להחליף 100 μL של בינוני (להסיר 100 μL ולהחליף עם 100 μL של בינוני טרי).
  4. . לתלות מספרי משחרר
    1. בצע את השלבים 1.1.1-1.1.4.
    2. מדלל תאים כדי להשיג דילול מתאים. דילול מעשי הוא 50,000 תאים/mL.
    3. הסר את המכסה של צלחת 10 ס מ2 תרבות התא ומניחים אותו כך שהוא פונה כלפי מעלה. הוסף 6 מ ל של 1x PBS למנה (איור 1B (i)).
    4. יוצקים את ההשעיה התא לתוך מאגר סטרילי ובזהירות מקום עד 30 טיפות של 40 μL של ההשעיה של התא על המכסה של הצלחת תרבות התא באמצעות פיפטה רב ערוצי (איור 1B (ii)), וכתוצאה מכך ריכוז של 2,000 תאים/טיפה. להימנע מהנחת הטיפות קרוב מדי לקצה המכסה כמו טיפות אלה נוטים יותר לאבד מתח פני השטח בעת היפוך המכסה בשלב הבא.
    5. היפוך המכסה בתנועה מהירה אך מבוקרת ומניחים אותו על גבי המנה המכילה את ה-1x המכיל את תרבות התא (איור 1B (iii)).
    6. מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 ו 95% לחות מבלי להפריע את הטיפות ולהשאיר אותם לגדול עבור 4-6 ימים.
    7. אם לשמש ליסביטים חלבון או להטביע, spheroids הבריכה על ידי הסרת המכסה ולהטות אותו, כדי לשטוף את הטיפות עם 1 מ ל של מדיום מחומם. העבר את המדיום המתקבל המכיל spheroids לצינור 1.5 mL ולאפשר להם להתיישב בתחתית הצינור. המשך כפי שמתואר ב 4.4 ו 6.2.2 לחלבונים חלבון והטבעה, בהתאמה.

2. טיפול תרופתי בספרואידים

הערה: טיפול תרופתי לטווח ארוך יכול להיות מיושם על הספרואידים כדי להקרין השפעות של סם התעניינות. לפני התחלת טיפול תרופתי, מומלץ לבצע ניסוי היענות למינון של התרופה (ים), כדי למצוא מנה מתאימה לטיפול הניסיוני. המינון צריך להיות מבוסס על הקבוע IC50/ki של התרופה וטווח של כ 0.2 x-10x של ערך זה.

  1. הגדרת 6-12 spheroids לפי התנאי הרצוי כמתואר ב 1.2 או 1.3 ומקום בחממה (37 ° c, 5% CO2, 95% לחות) עבור יומיים.
  2. ביום השני, קחו תמונות מיקרוסקופיים קלות של הספרואידים.
  3. הכינו את מנות הטיפול הראשונות (לאחר שרכשו תמונות).
    הערה: ריכוז הטיפול הראשון חייב להיות פעמיים את הריכוז הסופי הרצוי כמו הפתרון יהיה מדולל 1:2 על בנוסף היטב המכיל 100 μL מדיום. מרווחי הטיפול בסמים מוצעים (יהיה תלוי בחצי חיים של התרופה): יום 2, 4 ו -7.
  4. באמצעות הצנרת רב-ערוצי, להסיר בעדינות 100 μL של בינוני ולהחליף אותו עם 100 μL של התרופה המכילה בינוני.
  5. מניחים את הצלחת 96-באר חזרה בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 ו 95% לחות ולחזור על 2.3 ו 2.4 בימים הנבחרים של הטיפול אבל עכשיו בלי להכפיל את המינון כדי להשיג את המינון הסופי הנכון.
  6. ביום האחרון של לוח הזמנים לפרוטוקול/טיפול, ניתן לבצע אחת או כמה מהפעולות הבאות.

3. שיטת הכדאיות התאית לספרואידים

  1. הגדר 4-6 spheroids לפי התנאי הרצוי כמתואר ב 1.2 או 1.3 ומקום בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 ו-95% לחות.
    הערה: במקרה זה, שיטת הכדאיות התאית בוצעה ביום 7 או 9, לאחר הגידול המנוכל 2-3 ימים על ידי מיקרוסקופ אור כפי שמתואר לעיל (נקודה 1.2.5 ו 1.3.13).
  2. הפשרת שיטת הכדאיות הכימית (ראה טבלת חומרים) והרשה לה להיות מעורפלת לפני השימוש.
  3. מערבבים בעדינות על-ידי היפוך כדי לקבל פתרון הומוגניות.
  4. לפני ביצוע העיבוד, להסיר 50% של מדיום התרבות מן spheroids (100 μL).
  5. הוספת יכולת הכדאיות של תא לכל באר ביחס 1:3 לכמות המדיום בבאר (איור 2a)עבור צלחת 96-באר, להוסיף 50 μl של מגיב ל100 μl של בינונית.
  6. מערבבים את התוכן במרץ עבור 5 דקות כדי לגרום לפירוק התא (איור 2A).
  7. דגירה עבור 25 דקות ב-RT כדי לייצב את האות זורח (איור 2א (iii)).
  8. הקלט את האות הזורח (איור 2א).

4. הכנת ליקוטים חלבון לכתמים מערביים מתרביות ספרואיד תלת-ממדית

הערה: בעת איסוף הספרואידים, מומלץ להשתמש בפיפטה P200 ולחתוך את קצה הקצה כדי לאפשר פתיחה גדולה יותר ומכאן לכידה קלה יותר של הספרואידים מבלי להפריע למבנה שלהם.

  1. עבור כל תנאי, הבריכה מינימום של 12, באופן אידיאלי 18-24 spheroids (בהתאם לגודל ספרואיד) בצינור 1.5 mL (להימנע 2 שפופרות mL, כמו השלבים הבאים יהפכו קשה יותר עקב התחתון מחודד פחות שלהם).
    הערה: אם כמות המדיום עולה 1.5 mL לפני איסוף כל spheroids, לאפשר spheroids שנאספו להתיישב בתחתית (קורה מהר מאוד, צנטריפוגה לא נחוץ) ולמחוק חצי נפח של הצינור לפני שתמשיך איסוף ה הספרואידים שנותרו.
  2. הניחו שפופרות על הקרח והניחו לספרואידים להתיישב בתחתית צינור ה1.5 mL.
  3. מעבר ממעבדת התא הסטרילי למעבדה הרגילה.
  4. שטוף את הרואידים פעמיים ב 1 מ ל של קרח קר 1x PBS. תן לספרואידים להתיישב לפני הסרת ה-PBS 1x בין כל צעד כביסה.
  5. מתיז כמו PBS 1 x ככל האפשר מבלי להפריע או להסיר את הספרואידים.
  6. הוסף 5 μL של מאגר לפירוק מחומם (LB) עם פוספספטאז-ו מעכבי פרוטאז, לכל ספרואיד (למשל, 10 spheroids = 50 μL).
  7. חזור על מרווחי המערבולת ואחריו ספין למטה עד התפרקה. לבצע מחזור של vortexing עבור 30 s ואחריו צנטריפוגה (מהדורה מהירה באמצעות צנטריפוגה שולחן מספיק) עבור 10 עבור כ. 5-10 דקות בהתאם לגודל ואת הקומפקטיות של spheroids.
    הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. לשמור על lysates ב-20 ° צ' עד שתמשיך עם sonication, המגון וקביעת חלבון כמו בפרוטוקול ליפוסט סטנדרטי חלבון 2D, ואחריו הכתמים המערביים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

5. Propidium יודיד (PI) צביעת הספרואידים

  1. הגדרת 3-6 spheroids לפי המצב הרצוי כמתואר ב 1.2 או 1.3 ומקום בחממה ב 37 ° c עם 5% CO2 ו-95% לחות.
  2. , במעבדת התרבות הסלולרית הסטרילית. מחממים 1 x PBS ל 37 ° c
  3. לעשות פתרון PI של 4 μM על ידי דילול פתרון מניות 1x PBS: לדלל 1 mg/mL מלאי מימית של PI 1:350 ב 1x PBS.
    הערה: ריכוז זה יהיה הרבה יותר מלאה עם תוספת של הפתרון לבארות מתן ריכוז סופי של 2 μM. 100 μL של פתרון זה נדרש עבור כל היטב המכיל ספרואיד.
    זהירות: Propidium יודיד (PI) צריך להיות מטופל בתוך מכסה וללבוש כפפות. PI הוא רגיש לאור. הגנה מפני אור בעת הטיפול.
  4. הסר 100 μL של המדיום מכל באר בצלחת 96-היטב מבלי להסיר את הspheroids.
  5. לשטוף את המדיום הנותרים על ידי הוספת 100 μL של מחומם 1x PBS לכל הבארות ואחריו הסרת 100 μL של הנוזל בבארות. חזור על שלב זה כביסה 3 פעמים.
  6. הוסף 100 μL של פתרון PI לכל טוב, לכסות את הצלחת ברדיד אלומיניום ולמקם אותו בחממה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 ו 95% לחות עבור 10-15 min.
  7. חזור על 3 שלבי הכביסה המתוארים ב-4.5 כדי לשטוף את פתרון PI, כדי לצמצם את אות הרקע בעת הדמיה.
  8. השתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצלי. כדי לצלם את הספרואידים כדי להעריך את הכדאיות של תאים בליבת ספרואיד לקחת z-ערימות כדי לקבל תמונות עם מעמקי שונות של הספרואיד.
    הערה: גודל צעד סביב 18-35 יקרומטר בין כל פרוסה בהתאם לגודל ספרואיד מומלץ, ונותן כ-11-18 ערימות לכל ספרואיד. את ה-z-ערימות ניתן לעבד ב-ImageJ באמצעות פונקציית ה-z-הקרנה, אשר יכולה לשלב את כל הערימות z לתמונה אחרונה אחת, נותן סקירה של הצביעת ברחבי הספרואיד (לקבלת הנחיות נוספות על השימוש ImageJ למטרה זו, ראה (https://imagej.net/Z-functions).

6. הטבעה של הספרואידים תלת-ממדיים

  1. הכן את ג'ל ה-agheroשאליו מוטבעים הספרואידים (בפעם הראשונה הנדרשת ביצוע הפרוטוקול).
    1. מערבבים 1 גר' באקטואגר ב 50 מ ל של ddH2O.
    2. החום לאט במיקרוגל עד שבאקנטונאגר הומס והוא יצר ג'ל הומוגנית. אל תאפשר הג'ל לרתוח.
    3. המשיכו לחמם את הבאקנאגר באמבט מים ב-60 ° c.
    4. שמרו על 4 ° c בין ניסויים.
  2. . הטבעה של הספרואידים
    1. ביום 1, עבור כל תנאי, מאגר מינימום של 12 הספרואידים בצינור 1.5 mL.
    2. שטוף פעם אחת עם 1 מ ל של קרח קר 1x PBS.
    3. כדי לתקן את הספרואידים, להוסיף 1 mL של 4% פאראמפורמלדהיד.
      הערה: טיפול בפאראמפורמלדהיד צריך להתבצע בתוך מכסה.
    4. תן להם לעבור את הדגירה 24 שעות ב RT.
    5. ביום 2, החום ג'ל בקפידה על ידי הצבת אותו בגביע מלא מים במיקרוגל. ודא כי ג'ל לא לרתוח! המשיכו להתחמם בצלחת החימום של הספסל, בשעה 60 ° צ' עד השימוש.
    6. שטוף את הרואידים פעמיים עם 1 מ ל של קרח קר 1x PBS.
    7. מתיז רוב הPBS 1x (עוזב כ 100 μL בשלב זה הוא מעשי לטיפול spheroids).
    8. הכינו את הפיפטה 20 μL על ידי חיתוך קצה הפיפטה בשיפוע כדי לקבל טיפ מחודד עם חור גדול יותר (ראה איור).
      הערה: החלק הבא צריך להיעשות במהירות כדי להבטיח העברת ספרואיד אופטימלית כדי למנוע מיצוק של ג'ל טיפה. אם אין בלוק חימום זמין, מומלץ תחילה לתפוס את spheroids ולאחר מכן לעשות את הירידה agarose (כלומר, מיתוג את הסדר של נקודות 6.2.9 ו 6.2.10).
    9. לעשות טיפה ג'ל העלה על שקופית המיקרוסקופ. מניחים את השקופית על בלוק חימום חם כדי למנוע את הצמח מתוך מיצוק.
    10. באמצעות העצה בצנרת ששונתה (ראה 6.2.8), לתפוס כמו spheroids רבים ככל האפשר בנפח של 15-20 μL.
    11. בזהירות להזריק 15-20 μL ספרואיד המכיל 1x PBS למרכז טיפה ג'ל agarose מבלי לגעת בשקופית המיקרוסקופ.
      הערה: . זו נקודה קצת קשה הרורואידים יאבדו אם טיפ הפיפטה ייגע במגלכי המיקרוסקופ בעת הזרקת הספרואידים לתוך טיפת הג'ל. מומלץ לתרגל את כל התהליך של ביצוע הירידה והזרקת הספרואידים על ידי הזרקת נוזל צבעוני לתוך הירידה. זה יאפשר ויזואליזציה של חדירה פוטנציאלית דרך הירידה, כמו נוזל צבעוני יהיה דולף החוצה אל השקופית.
    12. אפשר agarose ג'ל טיפה הרדן על ידי הדגירה עבור 5-10 דקות ב RT או ב 4 ° c. לאחר שטיפת ג'ל התחזק במקצת (אבל הוא עדיין רך למדי), בזהירות לדחוף את טיפת ג'ל מן המיקרוסקופ מחליק לתוך קלטת רקמת פלסטיק עם אזמל.
    13. כסו את קלטות רקמת הפלסטיק ב-70% אתנול.
      הערה: בשלב זה ניתן להשתמש בspheroids באופן ישיר או מאוחסן במשך חודשים.
    14. להטביע את agarose-מוטבע ספרואיד ב פרפין, קטע לתוך 2-3 יקרומטר שכבה עבה שקופיות כתם עם המטאוקסילין ו אאוזין או בכפוף להכתמים היסטולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצמיחה ספרואיד המבוססת על פרוטוקול היווצרות ספרואיד מומחש באיור 1A ו איור 1B, שימשו נקודת התחלה לניתוח של ההשפעות של תרופות נגד סרטן בגידול תלת מימד הגדרה מחקה. הקלות שבה נוצרות הספרואידים היא קו התאים הספציפי, וקווי תאים מסוימים דורשים תוספת עם rBM על מנת ליצור מספרי משוב קוהרנטיים22. ריכוז rBM שנוסף יכול להשפיע עמוקות על המבנה של הספרואידים. כפי שמוצג באיור 1C ובאיור 1, שינוי הריכוז של rbm בין 0 ל-4% משנה את הקומפקטיות ואת המבנה של הספרואידים באופן תלוי בסוג תא. איור 1 C מדגים כיצד התוספת של עד 2.5% rbm מאפשר היווצרות ספרואיד ב skbr-3 סרטן השד תאים, עם השפעה נוספת בריכוזים מעל 2.5% rbm. לעומת זאת, BxPC3 הלבלב אדנוקרצינומה (PDAC) תאים, אשר מוצג מורפולוגיה אפיתל, באופן ספונטני הטופס קטן, spheroids קומפקטי (איור 1D, העליון, הפאנל השמאלי). בסוג תא זה, הגדלת ריכוז rBM ל-1.5% או לעיל מעורר שינוי מורפולוגי מובהק מספרואיד למבנים מפותלים יותר עם בליטות ואינפלסיות, המזכירה של היווצרות המבנה הצינורי של דוטל. לעומת זאת, התוספת של rBM לשני קווים אחרים PDAC תאים, MiaPaCa ו Panc-1, אשר יש הפנוטיפ יותר mesenchymal, מאפשר את האגרגטים הסלולריים רופף להיות הדוקה יותר וטופס spheroids קומפקטי יותר (איור 1D, האמצע והתחתון חלוניות). תוצאות אלה מראות כי כמות מדויקת של rBM וכתוצאה מכך היווצרות ספרואיד אופטימלית חייב להיות מטוטרל עבור כל קו תא ותנאי.

הערכה כמותית של הכדאיות התאית בתוך הספרואידים על הטיפול בסמים היה הכרחי כדי להעריך את ההשפעה של טיפול תרופתי נגד סרטן. הבקשה המתוארת כאן היא שיטת לוציפראב-לוציפראז, המודד ATP ששוחרר מתאים חיים בתוך spheroids. עקרון השיטת הדעת מומחש באיור 2א. האות הזורח שנוצר בתוך שיטה זו נרשם בקלות על ידי קורא לוחית (איור 2א) ומתואם היטב עם הכדאיות הנמדדת על ידי שיטות אחרות23. הקשר הליניארי בין ריכוז ATP לבין לומינציה בטווח הריכוז הרלוונטי מוצג באיור 2ב, בעוד שאיור 2C מציג את יכולת הטיפול בהערכת מוות של תאים בספרואידים תלת-ממדיים שטופלו טיפול נגד סרטן. כדי להעריך עוד יותר את יניאריות של הצורך בטווח הרלוונטי, ניסויים להקמת עקומות סטנדרטיות של האות זורח כפונקציה של מספר התאים בוצעו (איור 2D ואיור 2E ). תוצאות אלה מצביעות על כך שהכדאיות מתאימה להערכת יכולת התאמת תאים בתרביות ספרואיד תלת-ממדית והיא ישימה לחקירת אובדן החלות בסמים של הכדאיות התאית.

שילוב של דימויים מיקרוסקופיים אור שנרכשו כל יומיים עד שלושה ימים, במהלך תקופת הטיפול והערכה כמותית הסופי של הכדאיות התאית מאפשר פיקוח צמוד של צמיחה ספרואיד מורפולוגיה, כמו גם הערכה של טיפול אופטימלי מנה. האחרון הוא לדוגמה באיור 3A ו- איור 3B, שבו בוצעה ניסוי תגובה מינון כדי לקבוע את המינון הדרוש עבור 50% מופחת הכדאיות תא מד א-MB-231 סרטן השד הסטרואידים. השפעות הטיפול על מורפולוגיה ספרואיד הם דמיינו באיור 3C ואיור 3D עבור מד א-MB-231 ו mcf-7 spheroids, בהתאמה. במהלך הטיפול עם קוקטייל כימותרפיות נבחר, את הקומפקטיות של מד א-MB-231 spheroids גדל, בעוד במהלך הטיפול עם טממוקסיפן, MCF-7 spheroids להיות שחוקים יותר ויותר ומחוספס. בשני המקרים, ירידה ברורה בכדאיות התא נראה לאחר 7 (מד א-MB-231) או 9 (MCF-7) ימי טיפול (איור 3E ואיור 3F). זה מדגים את הצורך הן חזותית הערכה כמותית של טיפול בתיווך השפעות על הכדאיות תא ספרואיד מורפולוגיה, כמו גם כי פרמטרים אלה הם מאוד תא-וטיפול-סוג ספציפי.

כתוספת היכולת הכדאיות התא, כתמי של תאים מתים עם PI, אשר לא יכול לחצות את הקרום ולכן רק כתמי נמק או מאוחר בתאי האפוטוטיק עם שלמות ממברנה פרוצים, מאפשר הערכה מרחבית מהירה של תאים מתים ב תגובה לטיפול, ללא הפרוטוקול הגוזלת זמן של הטבעה, שיבוץ ו-IHC. כמו מומחש באיור 4 הסדר המרחבי של תאים מתים על ריכוז גובר של מעכב, במקרה זה, Na+/H+ מחליף 1 (NHE1) מעכב 5-(N-אתיל-n-איזופרופיל)-amiloride (eipa), יכול להיות דמיינו. כפי שנראה, spheroids שליטה להראות מוגבלת נקרוטיק/מאוחר ליבה האפוטוטית, בעוד תאים מתים מופצים ברחבי ספרואיד כמו ריכוז של EIPA הוא גדל.

על מנת לכמת את היחס היחסי של מתח האפוטוטיק לאחר טיפולים שונים, spheroids היו לאחר ונחשפו SDS-ג'ל ג ' ל העמוד המערבי עבור באורך מלא וביקקה פולי (ADP-ribose) פולימראז (PARP). תוצאות מייצגות מוצגות באיור 4B ובאיור 4ג. בניסוי זה, spheroids הוכנו מ מד א-MB-231 תאים בהם לקטט-פרוטון coטרנספורטר MCT4 או Na+, hco3- coטרנספורטר NBCn1 היו הפילו באמצעות sirna. הנוק-אין הוערך על ידי בלוק מערבי עבור MCT4 ו NBCn1 (נתונים שלא פורסמו). כפי שנראה, את הנוק של MCT4, אבל לא של NBCn1, מכבש מגביר את המחשוף parp, עקבי עם ההדגמה הקודמת שלנו כי הנוק-אין יציב של MCT4 ב מד א-MB-231 תאים מקטין את צמיחת הגידול בvivo24.

כדי לנתח עוד יותר את ההשפעות של הטיפול ולקבל מידע על איתות מסוים, מעצר גדילה, ומסלולים המוות מופעל, spheroids יכול בנוסף ניתוח כתמי המערבי להיות מוטבע ונתון לניתוח האימונוהיסטוכימיה (IHC). ניתוח IHC של הסעיפים ספרואיד מאפשר שימוש בנוגדנים או סמנים ספציפיים של הפצת תאים, מחזור התא ומוות תאים מתוכנת, ומאפשר ויזואליזציה של הסידור המרחבי של תאים מתרבים ואפוטוטיים ב ספרואיד.

דמות סכמטית של פרוטוקול ההטמעה לניתוח IHC של הספרואידים מוצגת באיור 5א. דמות מיקרוסקופית אור מיקרוסקופיים של כ. 3 יקרומטר חלק מיקרוטומה עבה סעיף של ספרואיד מוטבע מוצג באיור 5B, ואת התמונה immunofluorescence של מוכתם ספרואיד עבור חלבון מדכא הגידול p53 (גרעינים מוכתם באמצעות DAPI), מוצג כאיור 5C. דוגמאות של DMSO וכימותרפיה מטופלים spheroids ויטראז ' סמן התפשטות התא קי-67 או עבור p53 מוצגים באיור 5D ואיור 5E, בהתאמה. תואם את ההשפעה האנטי מתרבים של טיפול כימותרפיה, מספר קי-67 תאים חיוביים הם גדולים יותר בשליטה DMSO מאשר בטיפול כימותרפיה ספרואיד (איור 5ד). לעומת זאת, ביטוי p53 הוא גדל במהלך התנאים של מתח התא, אפופטוזיס ומעצר גדילה, וכתוצאה מכך, מספר התאים p53 מוכתם גבוה באופן משמעותי בטיפול כימותרפיה מטופלים לעומת DMSO פקדים (איור 5 E).

תוצאות אלה מתארות דוגמאות לאופן הפענוח של החומר (PI כתמים, ihc) או כמותי (בלוק מערבי) על תופעות לטיפול בתרופות ב-מרחב 3d ניתן להשיג.

Figure 1
איור 1 : היווצרות ספונטנית ו-rBM-תיווך ספרואיד. (א) ייצוג סכמטי של היווצרות ספרואיד באמצעות קובץ מצורף אולטרה-נמוך 96-הצלחות התחתונה עגול, עם שימוש אופציונלי של rbm. צעדים בודדים המסומנים על ידי (i-iii). (ב) ייצוג סכימטי של היווצרות ספרואיד באמצעות שיטת השחרור התלויה. צעדים בודדים מסומנים על ידי (i-iii) (C) הדמויות הנציגה של rbm-תיווך ספרואיד היווצרות של skbr-3 תאים. תאים שופרה באולטרה-נמוך קובץ מצורף 96-היטב הצלחות התחתונה עגול עם ריכוזים גוברת של rBM וגדל עבור 9 ימים. סרגל בקנה מידה 100 μm. (n = 3). (ד) דמויות מייצגות של BxPC -3, MiaPaCa ו panc-1 תאים שנזרע עבור היווצרות ספרואיד הקובץ המצורף נמוך במיוחד 96-היטב הלוחות התחתונות עגול עם ריכוזים של rbm מ 0.5-2.5%. הספרואידים גדלו במשך 4 ימים. סרגל בקנה מידה = 250 μm. (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : עקרון והערכה של שיטת הכדאיות התאית. (A) ייצוג סכמטי של שיטת הכדאיות של התא התלת-ממדי. צעדים בודדים מסומנים על-ידי (i-iv). (ב) אות זורח כפונקציה של ריכוז ATP. דילול של ATP היו מצופים בצלחת 96-באר ויכולת הכדאיות של התא נוספו לכל באר. הומינסנציה נרשמה לאחר 30 דקות ב 405 ננומטר. 1 n. (ג) הכדאיות, נמדד כאור, של שליטה וכימותרפיה מטופלים mcf-7 spheroids. תא MCF-7 היתה שופרה לוחות מצורף במיוחד התחתון עגול, גדלו במשך 7 ימים. טיפול כימותרפיה (5 μM Cisplatin טינית, 5 μM דוקסורוביצין ו 30 ננומטר 5-פו) הוחל ביום 2 ו 4. בארים מייצגים ערכים מרעים באמצעות SD. 1 n. (ד) אות זורח כפונקציה של מספר התאים mcf-7 שנזרע. תא MCF-7 שופרה ב 96-היטב צלחות במספר התא שצוין ומותר לצמוח עבור 48 h, לאחר איזו הכדאיות התא נמדד. קווי שגיאה מייצגים את SD. 1 n. (ה) כמתואר D עבור תאים מד א-MB-231. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : ההשפעות של הטיפול משטרי על מורפולוגיה ספרואיד ואת הכדאיות התאית. (א) תמונות מייצגות של מד א-MB-231 spheroids ביום 2, 4 ו -7. מד א-MB-231 תאים הופרה בתחתית אולטרה נמוכה החלק התחתון 96-טוב צלחות. טיפול עם מינונים גוברת של כימותרפיה החלה ביום 2, בו הזמן כל spheroids היו בגודל דומה. השורות מציגות spheroids במינונים הגוברת של כימותרפיה, ועמודות להראות הנציג spheroids של גודל ביום 2, 4, ו 7 על המינון שצוין. המינון הנמוך ביותר היה 18.75 ננומטר Cisplatin טינית, 18.75 nM דוקסורוביצין, 0.0625 nM 5-Fluorouracil (5-FU) ומינון זה הוכפל עבור כל תמונה המוצגת, וכתוצאה מכך מינון מקסימאלי של 0.3 μM Cisplatin טינית, 0.3 μM דוקסורוביצין ו 2 ננומטר 5-FU. סרגל בקנה מידה = 100 μm. (2 n). (ב) הכדאיות של מד א-MB-231 spheroids, נמדד כמו לומינציה, לאחר 7 ימים של טיפול כימותרפיות. העמודות מייצגות ערכים מושמעות עם SEM. 2 n. (c, D) מייצגים תמונות של מד א-MB-231 (c) ו-mcf-7 Spheroids (D) ביום 2, 4, 7 ועבור mcf-7 spheroids 9. תאים שנזרע כמו ב (א) ומטופלים עם כימותרפיה (כימותרפיה, 18.75 ננומטר Cisplatin טינית, 18.75 nm דוקסורוביצין, 0.0625 nm 5-FU) ביום 2 ו-4 (ג) או עם 2 Μm Tamoxifen (Tam) ביום 2, 4 ו -7 (ד). סרגל קנה מידה = 100 μm. (4 n ו-3 n), בהתאמה. (E, F) יכולת הכדאיות, הנמדדת כאור השמש, ביום 7 ו -9 עבור (ג) ו-(ד), בהתאמה. כדי לבדוק הבדל משמעותי סטטיסטית בין התנאים הבדיקה t לזווג סטודנט בוצעה. מציין p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : צביעת Propidium יודיד וניתוח כתמים מערביים של הספרואידים. (א) תמונות מייצגות של PI-מוכתם מטוסי מקאפ 7 לאחר 9 ימי טיפול. התאים MCF-7 היו מצורף אולטרה נמוך 96-צלחות ובכן גדלו עבור 9 ימים וטיפל בריכוזים הגוברת של EIPA ביום 2, 4 ו -7. ביום 9, הספרואידים היו מוכתמים ב-PI והתמונות נרכשו על מיקרוסקופ אפיפייתי. סרגל בקנה מידה = 200 μm. (1 n.) (ב) הנציג הכלים מערבי של מד א-MB-231 תאים לאחר הסתרה/הסתרה של שנאים חומצה בסיס. NHE1 היה הפיל על ידי CRISPR/Cas9 בתוך מד א-MB-231 תאים 12 ואת התאים היו לאחר מכן מנוכר בעבר עם SIRNA נגד MCT4 או NBCn1, וגדל כמו spheroids עבור 9 ימים לפני להיות מדוכא ונתון לחסום המערבי באמצעות נוגדן זיהוי סה כ וביקח (ג) PARP. (ג) כימות היחס של cparp לרמת חלבון parp, מנורמל כדי טעינת בקרת (β-actin). (1 n). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : תיקון, הטבעה וניתוח אימונוהיסטוכימיה של הספרואידים. (א) ייצוג סכימטי של הפרוטוקול להטבעת הספרואידים. צעדים בודדים מסומנים כ (i-vii). (ב) תמונה של מד א-מוטבע-MB-231 ספרואיד. סרגל בקנה מידה: 50 μm. (ג) דמות מייצגת של כימותרפיה מטופלת מד א-MB-231 ספרואיד נתון לניתוח ihc עם נוגדנים נגד p-53. קווים מקווקווים מציגים את ההיקף של הספרואיד. סרגל קנה מידה = 20 μm. (ד, ה) תמונות מייצגות של dmso-או כימותרפיה מטופלים (לוחות העליון והתחתון, בהתאמה) מד א-MB-231 spheroids. מד א-MB-231 תאים שופרה באולטרה מצורף נמוכה 96-טוב צלחות, גדל במשך 7 ימים מטופלים עם כימותרפיה ביום 2 ו-4. ביום 7, הספרואידים הוטבעו ואחריו ניתוח של IHC עם נוגדנים עיקריים נגד קי-67 (ד) ו P53 (E). תיבות לבנות מייצגות תמונות מרחק מתצוגה. סרגל בקנה מידה = 20 יקרומטר בשתי האגציות, (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש של הסרטן 3D spheroids הוכיחה כלי רב ערך רב-תכליתי לא רק לסינון תרופות נגד סרטן, אלא גם לקבלת תובנה מכניסטית לתוך הרגולציה של מוות תא סרטן הכדאיות בתנאים לחקות את אלה בגידול מיקרואקולוגיה. זה חיוני במיוחד כמו נגישות, ספיגת הסלולר, תופעות תאיים של תרופות כימותרפיות מושפעים עמוקות על ידי התנאים פיזיקאלית-כימיים בגידול, כולל pH, מתח החמצן, tortuosity, פיזית ו אינטראקציות כימיות של תאי תא9,17. לדוגמה, החומציות של חומציות החילוץ, אשר יכול להגיע לערכים נמוך כמו 6-6.5 בגידולים מוצקים רבים25,26,27,28,29, גורם בסיסי חלש כימותרפיה תרכובות, כגון דוקסורוביצין, mitoxantrone ו-zwitterion paclitaxel, להיות טעונה. זה מפחית את ספיגת שלהם לתוך התאים הסרטניים והוא יכול להשפיע על הפעילות של חלבונים ההתנגדות רב הסמים כגון p-גליקופרוטאין30,31,32. גם את התפשטות התא, אשר הוא מרכזי לאפקט של רוב תרכובות כימותרפיות, מופחת בדרך כלל 3d לעומת תנאים 2d ולכן הוא כנראה לחיקוי טוב יותר בגידולים הסרטניים מאשר בתרבות תא 2d8,33 ,34. בסופו של דבר, מיקרו הסביבה הגידול צפוף הוא המקור של מספר רב של רמזים מסיסים פיזיים, מסיסי מכוון מסלולים מאותת תאיים המסדיר צמיחת תאים, הישרדות ומוות. כך, כאשר ניתוח יעילות התרופה, מערכות התרבות 3D הם צעד מרכזי לפני היציאה במודלים vivo. החיסרון העיקרי של תרבות תלת-ממדית הוא, עם זאת, מורכבות מוגברת של ניתוח לעומת זה של התרבות הדו. תיארנו כאן טכניקות פשוטות וזולות יחסית עבור היווצרות ספרואיד באמצעות מגוון סוגי תאים סרטניים. הצגנו דוגמאות של איך היווצרות ספרואיד חייב להיות ממוטב עבור כל סוג תא למדו ותיאר כיצד להשיג נתונים כמותיים על הכדאיות התא, מוות תאים, ומסלולים הקשורים איתות, ב-spheroids כגון. אין הבדלים ברורים של צמיחה או מורפולוגית בין שלושת הדגמים המתוארים כאן. בידינו, הווריאציה במבנה עשויה להיות מעט גדולה יותר באמצעות שיטת השחרור התלויה, ובכל זאת יתרון של שיטה זו הוא כי אין צורך ב-rBM. אנחנו מתמקדים כאן על spheroids המיוצרים מסוג אחד תא הסרטן. מודל ספרואיד הוא, עם זאת, גם מקלה לתרבות שיתוף, למשל תאים סרטניים עם פיברותקיעות, מונוציטים/מקרופאגים, תאים אנדותל, ו/או אדיפוציטים35,36,37. יישומים מתקדמים אחרים של מודל זה כוללים את השילוב עם מכשירים flu, 3D המודפס מודפס המאפשר מינון דרך קרום למחצה חדיר, ואחריו קציר עבור הפרופיל הכמותי פרוטאומית38.

אמנם, כפי שצוין לעיל, את הפנוטיפ של תאים גדל spheroids תלת-ממד בדרך כלל מחקה את זה של גידולים vivo הרבה יותר טוב מאשר תאים הגדלים ב 2D, במידה שבה spheroids כאלה הם למעשה מודלים רלוונטיים של המקבילה בגידולים vivo תלויה רבים גורמים ויש להעריך בקפידה. פרמטרים אשר ישפיעו כמה טוב spheroids לחקות את המצב vivo כוללים את הרכב הסלולר של הגידול ואת הרכב ECM היחסי שלה. למשל, rBM אשר יש לנו מועסקים כמו ECM בפרוטוקולים המסופקים כאן היא בחירה טובה עבור חיקוי בשלבים המוקדמים של סרטן אפיתל, בסביבות הזמן של הפריצה קרום המרתף, הקומפוזיציות ECM אחרים יהיה רלוונטי יותר עבור גידול מסוים סוגים ושלבים. יתר על כן, היכולת של הדבקה תא התא שונה באופן נרחב בין קווי התאים הסרטניים, בהתאם לביטוי שלהם תא תא תאים מטריקס הדבקה של תאים כגון קדהרנים ו אינטנס22.

כפי שמתואר כאן, צמיחה ספרואיד מורפולוגיה יכול בקלות ולא פולשני להיות מנוטרים בכל 2-3 ימים באמצעות מיקרוסקופ אור עם אופטיקה הגדלה נמוכה שדה גדול של נוף. עם זאת, בגלל הלחץ ציטוטוקסיים, כגון טיפול כימותרפיה, משפיע על מורפולוגיה ספרואיד מאוד שונה, באופן, בהתאם לסוג התא ואת ערכת הטיפול, זה לא מספיק כדי להסתמך על המבנה ואת היקף לבד להערכת אפקט הטיפול. למשל, הספרואידים יכול להיות משוחרר יותר עם טיפול ומוות תאים המתעוררים, או כל המוות עלול להתרחש בליבת נמק, בעוד פני השטח לא מושפע במקרה. בשני המקרים, התוצאה עשויה להיות רושם שגוי, כי מספר התאים החי בספרואיד אינו מופחת על ידי הטיפול. שיטות כמותיים-ושלמות-ספרואיד חיוניות לפיכך להערכת אפקט הטיפול. עבור הערכה כמותית של מוות התאים, את השפעת פוספספטאז חומצה, אשר כפי שרומז השם מודד את הפעילות של חומצת ציטוזה פוספאטאז המועסקים21. עם זאת, בידינו, בעוד שהנתון הזה בדרך כלל יפה משקף את מספר התאים שנזרע, זה לא מתאים ללכוד מהיר המושרה לטיפול מוות תא (נתונים לא מוצגים), כנראה כי החומצה פוספספטאז נשאר פעיל זמן מה לאחר מוות התאים. יתר על כן, הטיפול הזה דורש הסרה מלאה של המדיום, אשר מגדיל את השגיאה במיוחד עם שברירי, כימותרפיה שטופלו spheroids. שיטת הכדאיות התאית המתוארת כאן, המבוססת על תוכן ה-ATP התאי, נבחרה בהתבסס על הפרוטוקול הפשוט והחסכוני שלה והיכולת הגבוהה ביותר. יתרה מזאת, שיטת העבודה אינה דורשת הסרה מלאה של מדיום התרבות, המהווה יתרון כשעובדים עם הספרואידים. כפי שמוצג תוצאות הנציג, הטיפול הזה לוכדת היטב גם מספר התא ואפקטים צפויים לטיפול כימותרפיה. עם זאת, מכשול של טכניקה זו הוא, כמובן, כי שינויים מטבולית הפחתת תוכן ATP תאיים עשוי בטעות להיות מוקלט כמספר תא נמוך יותר. מכאן, הערכה מקבילה של אמצעי אחסון ומורפולוגיה של ספרואיד, או מכתים PI, מומלץ לאמת תוצאות.

הליזה ספרואיד ואחריו הכתמים המערביים יכולים לספק תובנה חצי כמותית למצב של תהליכי איתות, מוות תאים, צמיחה והכדאיות. השימוש בכתמים המערביים הוא מסובך כאשר rBM משמש להכנת spheroids, מאז זה יהיה שבריר משמעותית של התוכן חלבון lysate וחשוב יותר, התרומה החלקי שלה יגדל עם הפחתת תוכן הסלולר במהלך מוות תאי כימותרפיה. בעיקרון ניתן להסיר את rBM על ידי צנטריפוגה; עם זאת, זהו צעד קריטי, כפי שקשה להסיר לחלוטין את כל rBM, וזה יהיה למנוע השוואה כמותית בין התנאים. עבור הספרואידים כאלה, ובאופן כללי עבור הערכה הפתרון הפתור של מסלולים מוות ופרמטרים הרלוונטיות של איתות, הטבעה ו-IHC הם כלים חזקים. גישות אחרות ניתן לראות: הדמיה מיקוד חי של (קטן יחסית) spheroids שלמים39. תכונה מעניינת נוספת של הספרואידים היא כי בהינתן הצורה הרגילה שלהם "ball", הם מלווים את עצמם היטב לאיטרציה בין מידול מתמטי וניסויים במעבדה רטובה, כדי להגדיל את ההבנה של החשיבות של האמור לעיל מעברי צבע של חמצן, pH, וחומרים מזינים בתוך spheroids, ועל ידי אומדן, גידולים40,41. Thus, למרות חשוב 3D מודלים הגידול של המורכבות הרבה יותר המתעוררים, כולל מגוון רחב של תרבויות אורגאותמית ואורגנואיד המבוסס על ביולוגי מורכב, כמו גם התלויים פיגומים, ו, לא לפחות, החולה נגזר xenografts תלי42, spheroids להישאר כלי חשוב בגלל הרלוונטיות הביולוגית שלהם מעולה לעומת התרבות הדו, בשילוב עם קלות יחסי של טיפול.

לסיכום, אנו מציגים כאן סדרה של שיטות פשוטות לניתוח שינויים נגד סרטן המושרה הטיפול בכדאיות של תאים סרטניים ומוות בתרבות תלת-ממד. הרכב הספרואידים יכול להיות שונה בהתאם למאפיינים וביולוגיה של התאים המועסקים, ואת הניתוחים כמותיים ואיכותניים שהוצגו שימושיים הן להערכת קשרי מינון-תגובה ולקבלת תובנה לתוך ה מסלולי איתות ומוות מעורבים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לקאטרין פרנקלין מארק ואנט ברלטלין לקבלת סיוע טכני מעולה, וכדי לבצע את הניסויים באיור 1D. העבודה הזאת ממומנת על ידי קרן איינר וילומסן, קרן נובו נורדיסק ופונפה ג'צ'אם (כולם לבית הSFP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) Invitrogen # C10595  For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU) Sigma-Aldrich #F6627 Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) Life Technologies #E3111 Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP Cell signaling #9542 Used in western blotting
Antibody against Ki-67 Cell signaling #9449 Used for IHC
Antibody against p53 Cell Signaling  #2524  Used for IHC
Antibody against β-actin Sigma  A5441 Used in western blotting
Bactoagar BD Bioscience #214010 Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder Invitrogen #10747-012 Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit Bio-Rad Laboratories #500-0113, #500-0114, #500-0115   Used for protein determination from lysates
Bürker chamber Marienfeld 610311 For cell counting 
BX63 epifluoresence microscope Olympus Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega #G9681 Used for the cell viability assay
Cisplatin Sigma-Aldrich #P4394  Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile Corning #4520 Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile Corning #7007 Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels Bio-Rad 5671025 Used for SDS-PAGE
Doxorubicin Abcam #120629 Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader BMG Labtech Used for recording luminescence 
Formaldehyde  VWR Chemicals  #9713.1000  Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Gibco #A1413202 Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS Sigma #F9665 Serum for growth media
ImageJ NIH Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette Medim Histotechnologie 10-0114 Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics GmBH  # 11836153001 Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope Leica Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer  Invitrogen #NP0007 Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate Thermo scientific #32106 Used for western blotting
Ponceau S Sigma-Aldrich #P7170-1L Used for protein band staining
Prism 6.0 Graphpad Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) Invitrogen  P3566 Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannel SPL lifesciences 21002 Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide  Menzel-Gläser #J3800AMNZ Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen Sigma-Aldrich #T5648 Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes Bio-Rad #170-4159 Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer  Bio-Rad  #161 0732 Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution Sigma #T4174  Cell dissociation enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  2. Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
  3. Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
  4. Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
  5. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  6. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
  7. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  8. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
  9. Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
  10. Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
  11. Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
  12. Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
  13. Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
  14. Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
  15. Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
  16. Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
  17. Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
  18. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
  19. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  20. Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
  21. Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
  22. Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
  23. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
  24. Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
  25. Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
  26. Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
  27. Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
  28. Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
  29. Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
  30. Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
  31. Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
  32. Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
  33. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  34. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
  35. Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
  36. Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
  37. Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
  38. LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
  39. Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
  40. Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
  41. Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
  42. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).

Tags

מחקר הסרטן סוגיה 148 Spheroids 3D תרבות התאים ירידה תלויה הכדאיות התא סרטן השד סרטן הלבלב טיפול נגד סרטן טיפול בסמים כימותרפיה מחדש קרום המרתף propidium יודיד אימונוהיסטוכימיה
הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rolver, M. G., Elingaard-Larsen, L.More

Rolver, M. G., Elingaard-Larsen, L. O., Pedersen, S. F. Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (148), e59714, doi:10.3791/59714 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter