Summary
Hier stellen wir mehrere einfache Methoden zur Beurteilung der Lebensfähigkeit und des Todes in 3D-Krebszellsphäroiden vor, die die physikalisch-chemischen Gradienten von In-vivo-Tumoren viel besser imitieren als die 2D-Kultur. Das Sphäroid-Modell ermöglicht daher die Bewertung der Wirksamkeit des Krebsmedikaments mit verbesserter Übersetzung in In-vivo-Bedingungen.
Abstract
Dreidimensionale Sphäroide von Krebszellen sind wichtige Werkzeuge sowohl für Krebsmedikamenten-Screens als auch für den Gewinn mechanistischer Einblicke in die Krebszellbiologie. Die Kraft dieses Präparats liegt in seiner Fähigkeit, viele Aspekte der In-vivo-Bedingungen von Tumoren zu imitieren, während es schnell, billig und vielseitig genug ist, um ein relativ hohes Durchsatzscreening zu ermöglichen. Die Sphäroid-Kulturbedingungen können die physikalisch-chemischen Gradienten in einem Tumor rekapitulieren, einschließlich der zunehmenden extrazellulären Säure, erhöhtem Laktat und abnehmender Glukose- und Sauerstoffverfügbarkeit, von der Sphäroid-Peripherie bis zu ihrem Kern. Auch die mechanischen Eigenschaften und Zell-Zell-Wechselwirkungen von In-vivo-Tumoren werden teilweise von diesem Modell nachgeahmt. Die spezifischen Eigenschaften und damit die optimalen Wachstumsbedingungen von 3D-Sphäroiden unterscheiden sich stark zwischen den verschiedenen Arten von Krebszellen. Darüber hinaus erfordert die Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroiden Methoden, die sich zum Teil von denen unterscheiden, die für 2D-Kulturen verwendet werden. Hier beschreiben wir mehrere Protokolle zur Herstellung von 3D-Sphäroiden von Krebszellen und für die Verwendung solcher Kulturen zur Bewertung der Zelllebensfähigkeit und des Todes im Zusammenhang mit der Bewertung der Wirksamkeit von Krebsmedikamenten.
Introduction
Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroid-Modellen in der Krebsbiologie ist mehrere Jahrzehnte alt1,2, hat aber in den letzten Jahren erhebliche Dynamik gewonnen. Dies spiegelt zum großen Teil das erhöhte Bewusstsein dafür wider, wie stark der Phänotyp von Krebszellen von ihrer Mikroumgebung und spezifischen Wachstumsbedingungen abhängig ist. Die Mikroumgebung bei soliden Tumoren unterscheidet sich grundlegend von der in entsprechenden normalen Geweben. Dazu gehören physikalisch-chemische Bedingungen wie pH, Sauerstoffspannung, sowie interstitielle Druck, Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren wie Nährstoffe, Abfallprodukte, und sezernierte Signalverbindungen (Wachstumsfaktoren, Zytokine). Darüber hinaus umfasst es die Organisation der extrazellulären Matrix (ECM), Zell-Zell-Wechselwirkungen und interzelluläre Signalisierung, und andere Aspekte der jeweiligen dreidimensionalen (3D) Architektur des Tumors3,4, 5,6. Die spezifischen mikroökologischen Bedingungen, in denen Krebszellen existieren, beeinflussen ihr Genexpressionsprofil und ihre funktionellen Eigenschaften tiefgreifend, und es ist klar, dass der Phänotyp von 3D-Sphäroiden im Vergleich zu den in 2D angebauten Zellen viel stärker imitiert. die von In-vivo-Tumoren7,8,9,10,11. 2D-Modelle, selbst wenn sie Hypoxie, sauren pH-Wert und hohe Laktatkonzentrationen verwenden, um bekannte Aspekte der Tumormikroumgebung zu imitieren, erfassen immer noch nicht die Gradienten physikalisch-chemischer Parameter, die in Tumoren entstehen, sowie deren 3D-Tumor architektur. Auf der anderen Seite sind Tiermodelle kostspielig, langsam und ethisch problematisch und haben im Allgemeinen auch Mängel in ihrer Fähigkeit, menschliche Tumorbedingungen zu rekapitulieren. Folglich wurden 3D-Sphäroide als Zwischenkomplexitätsmodell in Studien zu einer Vielzahl von Eigenschaften der meisten soliden Krebsartenangewendet 9,11,12,13, 14,15,16,17.
Eine weit verbreitete Verwendung von 3D-Sphäroide ist in Screening-Assays der Anti-Krebs-Therapie Wirksamkeit9,18,19,20. Behandlungsreaktionen sind besonders empfindlich auf die Tumormikroumgebung und spiegeln sowohl die Auswirkungen der Tortuosität, die eingeschränkte Diffusion, den hohen interstitiellen Druck und den sauren Umwelt-pH-Wert auf die Arzneimittelabgabe als auch die Auswirkungen von Hypoxie und anderen Aspekte der Mikroumgebung auf der Zelltodreaktion9,17. Da die Umgebung innerhalb von 3D-Sphäroiden von Natur aus alle diese Eigenschaften entwickelt7,8,9,10,11, mit 3D-Zellkulturen können die Übersetzung der Ergebnisse in in vivo-Bedingungen erheblich zu verbessern, ermöglichen jedoch ein effizientes und erschwingliches Hochdurchsatz-Screening des Nettowachstums. Die große Mehrheit der Studien über die medikamentöse Reaktion von Krebszellen wird jedoch immer noch unter 2D-Bedingungen durchgeführt. Dies spiegelt wahrscheinlich wider, dass, während einige Assays relativ leicht für 3D-Zellkulturen implementiert werden können, viele, wie Lebensfähigkeits-Assays, Western-Blotting und Immunfluoreszenz-Analyse, viel bequemer in 2D als in 3D durchgeführt werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, leicht zugängliche Assays und präzise Protokolle für Analysen der Wirkung der Behandlung mit Krebsmedikamenten auf die Lebensfähigkeit und das Überleben von Krebszellen in einem 3D-Tumor zu liefern, der eine Nachahmung simmiert. Insbesondere bieten und vergleichen wir drei verschiedene Methoden zur Sphäroidbildung, gefolgt von Methoden zur qualitativen und quantitativen Analyse von Wachstum, Lebensfähigkeit und Arzneimittelreaktion.
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Protocol
1. Erzeugung von Sphäroiden
- Vorbereitung von Zellsuspensionen für die Sphäroidbildung
HINWEIS: Verschiedene Zelllinien haben sehr unterschiedliche Haftungseigenschaften und es muss jeweils das am besten geeignete Sphäroidbildungsprotokoll eingerichtet werden. Wir haben festgestellt, dass MCF-7 und BxPC-3 Zellen für die spontane Sphäroidbildung geeignet sind, während MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 und MiaPaCa die Zugabe von rekonstituierten Kellermembranen erfordern, um erfolgreich Sphäroide zu bilden. Nur MDA-MB-231 und BxPC-3-Zellen wurden für das Hängende-Tropfen-Protokoll verwendet, aber andere Zelllinien sind sicherlich anwendbar.- Wachsen Sie Zellen als Monolayer bis 70-80% Konfluenz.
- Waschzellen mit phosphatgepufferter Mittellinie (1x PBS, 5 ml für 25 cm2 oder 10 ml für einen 75 cm2 Kolben), das Zelldissoziationsenzym (0,5 ml für 25 cm2 oder 1 ml für einen 75 cm2 Kolben) hinzufügen und die Zellen für 2-5 min bei 37 °C inkubieren in 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit.
- Überprüfen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie das Zelldissoziationsenzym, indem Sie einem Gesamtvolumen von 5 ml in einem 25 cm2 oder 10 ml für einen 75 cm2 Kolben ein Wachstumsmedium (6-10% Serum je nach Zelllinie) hinzufügen.
- Verwenden Sie eine Bürker-Kammer, um Zellen zu zählen und 8 Quadrate in der Kammer pro Zellpräparat zu zählen, um eine hohe Reproduzierbarkeit der Größe der Sphäroide zu erhalten.
HINWEIS: Im Folgenden werden jeweils drei Protokolle vorgestellt, die eine andere Methode zur Sphäroidbildung beschreiben. Protokoll 1.2 und 1.3 können für alle nachfolgenden Analyseprotokolle verwendet werden, während Protokoll 1.4 am besten zum Einbetten und Lysatieren von Zubereitungen geeignet ist. Je nach Zelllinie dauert die Sphäroidbildung 2-4 Tage, unabhängig von der verwendeten Methode.
- Spontane Sphäroidbildung
- Führen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4 aus.
- Verdünnen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Rohr, um 0,5-2 x 104 Zellen/ml zu erhalten (für jede Zelllinie muss eine optimale Zelldichte bestimmt werden) (Abbildung 1A (ii)).
- Füllen Sie den äußeren Ring von Brunnen mit 1x PBS oder Wachstumsmedium, um die Verdunstung von den verbleibenden Brunnen zu reduzieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reservoir und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 200 l/well in ultraniedrige Befestigung96-gut runde Bodenplatten (Abbildung 1A (iii)).
- Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator bei37 °C mit 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit.
- Alle 2-3 Tage erfassen sie lichtmikroskopische Bilder der Sphäroide.
HINWEIS: Die Bilder in diesem Papier werden mit 11,5-facher Vergrößerung aufgenommen, was für die meisten Sphäroide geeignet ist, die mit diesen Protokollen hergestellt werden. - Alle 2-3 Tage (nach dem Erfassen von Bildern) ersetzen Sie 100 l Medium (entfernen Sie 100 l des verbrauchten Mediums und ersetzen Sie durch 100 l frisches Medium.
HINWEIS: Um das Entfernen von Sphäroiden beim Austausch von Medium zu vermeiden, ist es ratsam, die Platte ein wenig zu kippen, während langsam das Medium entfernt und das angesaugte Medium in den Spitzen auf sichtbare Sphäroide untersucht wird, bevor sie verworfen wird.
- Rekonstituierte Kellermembran-vermittelte Sphäroidbildung.
HINWEIS: Lactose Dehydrogenase Elevating Virus (LDEV)-freie reduzierte Wachstumsfaktor rekonstituierte Kellermembran (rBM) wurde verwendet. rBM ist temperaturempfindlich und sollte immer auf Eis gehalten werden, da es gerinnt, wenn es 15 °C erreicht. Die rBM entweder über Nacht bei 4 °C oder 2-4 h bei Raumtemperatur (RT) vor der Beschichtung auf Eis auftauen.- Tauen rBM auf Eis (siehe Tabelle der Materialien).
- Platten und Reservoirs (falls einzeln verpackt) vor Gebrauch auf Eis aufbewahren.
- Führen Sie die Schritte 1.1.1-1.1.4 aus.
- Füllen Sie den äußeren Ring von Brunnen mit 1x PBS oder Wachstumsmedium, um die Verdunstung von den verbleibenden Brunnen zu reduzieren. Verdünnen Sie die Zellsuspension in einem 15 ml-Rohr, um 0,5-2 x 104 Zellen/ml zu erhalten (für jede Zelllinie muss eine optimale Zelldichte bestimmt werden) (Abbildung 1A (ii)).
- Legen Sie das 15 ml-Rohr mit der verdünnten Zellsuspension auf Eis (z. B. in Glasbecher) (Abbildung 1A (iia)).
- Die gekühlten Platten und Reservoirs auf die Haube übertragen. Kunststoffbehälter spülen, mit Eis füllen und in die Haube geben, damit die Platten und Reservoirs während des gesamten Vorgangs auf Eis gelegt werden können.
- Resuspend rBM sanft, um ein homogenes Gel zu gewährleisten.
- Fügen Sie 1-2% rBM (optimale Konzentration muss für jede Zelllinie bestimmt werden) zu den gekühlten Zellsuspensionen hinzu (Abbildung 1A (iib)).
- Invertieren Sie das 15 ml-Rohr, um das richtige Mischen von rBM und Zellsuspension zu gewährleisten, bevor die Suspension in die Platte gegeben wird.
- Übertragen Sie die rBM-haltige Zellsuspension in ein steriles Reservoir und geben Sie 200 l/well in gekühlte ultra-niedrige Befestigungsplatten 96-Well-Platten mit einer Mehrkanalpipette ab (Abbildung 1A (iii)).
HINWEIS: Bei der Arbeit mit mehreren Zellsuspensionen (z. B. mehr als einer Zelllinie) ist es wichtig, jede Zellsuspension unmittelbar nach rBM-Zugabe zu verteilen, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern. - Zentrifugieren Sie die Platte für 15 min bei 750 x g mit 'soft decent'/no braking (wenn möglich, Zentrifuge bei 4 °C, um die rBM-Flüssigkeit länger zu halten, aber keine Voraussetzung für eine erfolgreiche Sphäroidbildung), um sicherzustellen, dass die Zellen zusammengepfert werden, wenn die rBM verhärtet, was die Bildung eines einzigen Sphäroids erleichtert.
- Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2, 95% Luftfeuchtigkeit).
- Alle 2-3 Tage erhalten sie leichte mikroskopische Bilder zur Bewertung des Sphäroidwachstums.
- Alle 2-3 Tage 100 l Medium ersetzen (100 l entfernen und durch 100 l frisches Medium ersetzen).
- Hängende Tropfensphäroide.
- Führen Sie Schritt 1.1.1-1.1.4 aus.
- Verdünnung der Zellen, um eine geeignete Verdünnung zu erhalten. Eine praktische Verdünnung beträgt 50.000 Zellen/ml.
- Entfernen Sie den Deckel einer 10 cm2 Zellkulturschale und legen Sie ihn so aufwärts. Fügen Sie 6 ml 1x PBS in die Schale ein (Abbildung 1B (i)).
- Gießen Sie die Zellsuspension in ein steriles Reservoir und legen Sie mit einer Mehrkanalpipette (Abbildung1B (ii), was zu einer Konzentration von 2.000 Zellen/Tropfen führt, vorsichtig bis zu 30 Tropfen von 40 l Zellsuspension auf den Deckel der Zellkulturschale. Vermeiden Sie es, die Tropfen zu nah an den Rand des Deckels zu legen, da diese Tropfen eher Oberflächenspannung verlieren, wenn sie den Deckel im folgenden Schritt umkehren.
- Invertieren Sie den Deckel in einer schnellen, aber kontrollierten Bewegung und legen Sie ihn auf die 1x PBS-haltige Zellkulturschale (Abbildung 1B (iii)).
- Legen Sie die Schale in einen Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit, ohne die Tropfen zu stören und lassen Sie sie für 4-6 Tage wachsen.
- Wenn für Proteinlysate oder Einbettung verwendet werden soll, Pool Spheroide durch Entfernen des Deckels und kippen Sie ihn, um die Tropfen mit 1 ml beheiztem Medium zu waschen. Übertragen Sie das resultierende Medium, das Sphäroide enthält, auf ein 1,5 ml-Rohr und lassen Sie es sich an der Unterseite des Rohres absetzen. Gehen Sie wie in 4.4 bzw. 6.2.2 für Proteinlysate bzw. Einbettungen beschrieben vor.
2. Medikamentöse Behandlung von Sphäriden
HINWEIS: Langfristige medikamentöse Behandlung kann auf die Sphäroide angewendet werden, um auf Die Wirkung eines Medikaments von Interesse zu überprüfen. Vor Beginn der medikamentösen Behandlung ist es ratsam, ein Dosis-Reaktions-Experiment des Medikaments durchzuführen, um eine geeignete Dosis für die experimentelle Behandlung zu finden. Die Dosen sollten auf dem ermittelten IC50/Ki des Arzneimittels basieren und von etwa 0,2x-10x dieses Wertes reichen.
- Richten Sie 6-12 Sphäroide gemäß dem gewünschten Zustand ein, wie in 1.2 oder 1.3 beschrieben, und legen Sie sie 2 Tage lang im Inkubator (37 °C, 5%CO2, 95% Luftfeuchtigkeit) auf.
- Nehmen Sie am 2. Tag lichtmikroskopische Bilder der Sphäroide auf.
- Bereiten Sie die ersten Behandlungsdosen vor (nach dem Erfassen von Bildern).
HINWEIS: Die erste Behandlungskonzentration muss doppelt so hoch sein wie die gewünschte Endkonzentration, da die Lösung nach Zugabe des 100-L-Mediums 1:2 verdünnt wird. Empfohlene Behandlungsintervalle für Medikamente (hängt von der Halbwertszeit des Arzneimittels ab): Tag 2, 4 und 7. - Mit einer Mehrkanalpipette, entfernen Sie vorsichtig 100 l Medium und ersetzen Sie es durch 100 l Medikament enthaltendes Medium.
- Legen Sie die 96-Well-Platte wieder in den Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit und wiederholen Sie 2,3 und 2,4 an den gewählten Behandlungstagen, aber jetzt ohne die Dosis zu verdoppeln, um die richtige Enddosis zu erhalten.
- Am letzten Tag des Protokolls/Behandlungsplans können eine oder mehrere der folgenden Tests durchgeführt werden.
3. Zellviabilityntest für Sphäroide
- Richten Sie 4-6 Sphäroide nach dem gewünschten Zustand ein, wie in 1.2 oder 1.3 beschrieben, und legen Sie sie bei 37 °C bei 37 °C mit 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit in den Inkubator.
HINWEIS: In diesem Fall wurde der Zelllebensfähigkeitstest am Tag 7 oder 9 durchgeführt, nachdem das Sphäroidwachstum alle 2-3 Tage durch Lichtmikroskopie wie oben beschrieben überwacht wurde (Punkt 1.2.5 und 1.3.13). - Tauen Sie das Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz (siehe Materialtabelle) und lassen Sie es vor der Verwendung mit RT ausdemieren.
- Mischen Sie vorsichtig, indem Sie sich umkehren, um eine homogene Lösung zu erhalten.
- Entfernen Sie vor der Durchführung des Assays 50 % des Kulturmediums aus den Sphäroiden (100 l).
- Fügen Sie jedem Bohrkörper ein Zelllebenswiederaufnahmereagenz in einem Verhältnis von 1:3 zu der im Brunnen vorhandenen Mediummenge hinzu (Abbildung 2A (i)) Für eine 96-Well-Platte 50 l Reagenz auf 100 l Medium hinzufügen.
- Mischen Sie den Inhalt kräftig für 5 min, um Zelllyse zu induzieren (Abbildung 2A (ii)).
- 25 min bei RT inkubieren, um das Leuchtsignal zu stabilisieren (Abbildung 2A (iii)).
- Zeichnen Sie das Leuchtsignal auf (Abbildung 2A (iv)).
4. Herstellung von Proteinlysaten für Western Blotting aus 3D Sphäroidkulturen
HINWEIS: Beim Sammeln der Sphäroide ist es ratsam, eine P200 Pipette zu verwenden und das Ende der Spitze zu schneiden, um eine größere Öffnung und damit eine einfachere Erfassung der Sphäroide zu ermöglichen, ohne ihre Struktur zu stören.
- Für jede Bedingung, Pool ein Minimum von 12, idealerweise 18-24 Sphäroide (abhängig von Sphäroidgröße) in einem 1,5 ml Rohr (vermeiden Sie 2 ml Rohre, da die nächsten Schritte werden schwieriger aufgrund ihrer weniger spitzen Boden).
HINWEIS: Wenn die Menge des Mediums 1,5 ml übersteigt, bevor alle Sphäroide gesammelt wurden, lassen Sie die gesammelten Sphäroide am Boden absetzen (passiert sehr schnell, Zentrifugation nicht notwendig) und entsorgen Sie die Hälfte des Volumens des Rohres, bevor Sie die verbleibenden Sphäroiden. - Rohre auf Eis legen und die Sphäroide am Boden des 1,5 ml-Rohres absetzen lassen.
- Wechseln Sie vom sterilen Zelllabor in das reguläre Labor.
- Sphäroide zweimal in 1 ml eiskaltem 1x PBS waschen. Lassen Sie Sphäroide sich absetzen, bevor Sie 1x PBS zwischen jedem Waschschritt entfernen.
- Aspirieren Sie so viel 1x PBS wie möglich, ohne die Sphäroide zu stören oder zu entfernen.
- Fügen Sie 5 l erhitzten Lysepuffer (LB) mit Phosphatase- und Proteaseinhibitoren pro Sphäroid hinzu (z. B. 10 Sphäroide = 50 l LB).
- Wiederholen Sie die Wirbelintervalle, gefolgt von einer Drehung, bis Sphäroide aufgelöst sind. Führen Sie einen Wirbelzyklus für 30 s durch, gefolgt von zentrifugieren (ein schnelles Spinnen mit einer Tischzentrifuge ist ausreichend) für 10 s für ca. 5-10 min je nach Größe und Kompaktheit der Sphäroide.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Halten Sie die Lysate bei -20 °C, bis sie mit der Beschallung, Homogenisierung und Proteinbestimmung wie in einem Standard-2D-Proteinlysatprotokoll fortfahren, gefolgt von Western Blotting mit Standardprotokollen.
5. Propidium Iodid (PI) Färbung von Sphäroiden
- Richten Sie 3-6 Sphäroide pro gewünschtem Zustand ein, wie in 1.2 oder 1.3 beschrieben, und legen Sie sie bei 37 °C bei 37 °C mit 5%CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit in den Inkubator.
- In einem sterilen Zellkulturlabor 1x PBS auf 37 °C erhitzen.
- Machen Sie eine PI-Lösung von 4 M durch Verdünnen der Lagerlösung in 1x PBS: Verdünnen Sie einen 1 mg/ml wässrigen Bestand an PI 1:350 in 1x PBS.
HINWEIS: Diese Konzentration wird nach Zugabe der Lösung zu den Brunnen weiter halbiert, was eine Endkonzentration von 2 m ergibt. 100 l dieser Lösung werden für jeden Brunnen benötigt, der ein Sphäroid enthält.
ACHTUNG: Propidiumiodid (PI) muss mit einer Dunstabzugshaube und Handschuhen behandelt werden. PI ist lichtempfindlich. Schützen Sie sich vor Licht bei der Handhabung. - Entfernen Sie 100 l des Mediums aus jedem Brunnen in der 96-Well-Platte, ohne die Sphäroide zu entfernen.
- Waschen Sie das restliche Medium aus, indem Sie 100 l erhitzten 1x PBS zu allen Brunnen hinzufügen, gefolgt von der Entfernung von 100 l der Flüssigkeit in den Brunnen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3 Mal.
- Fügen Sie jedem Brunnen 100 l der PI-Lösung hinzu, bedecken Sie die Platte in Aluminiumfolie und legen Sie sie in einen Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit für 10-15 min.
- Wiederholen Sie die 3 in 4.5 beschriebenen Waschschritte, um die PI-Lösung auszuwaschen, um das Hintergrundsignal bei der Bildgebung zu verringern.
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenzmikroskop, um die Sphäroide abzubilden. Um die Lebensfähigkeit von Zellen im Sphäroidkern zu bewerten, nehmen Sie Z-Stacks, um Bilder mit unterschiedlichen Tiefen des Sphäroids zu erhalten.
HINWEIS: Je nach Sphäroidgröße ist eine Schrittgröße von etwa 18-35 m zwischen jeder Scheibe ratsam, was etwa 11-18 Stapel pro Sphäroid ergibt. Z-Stacks können in ImageJ mit der Z-Projektionsfunktion verarbeitet werden, die alle Z-Stacks zu einem fertigen Bild kombinieren kann, was einen Überblick über die Färbung im gesamten Sphäroid gibt (weitere Richtlinien zur Verwendung von ImageJ zu diesem Zweck finden Sie unter (https://imagej.net/Z-functions).
6. Einbetten von 3D-Sphäroiden
-
Bereiten Sie das Agarose-Gel vor, in das die Sphäroide eingebettet sind (nur zum ersten Mal beim Ausführen des Protokolls erforderlich).
- 1 g Bactoagar in 50 ml ddH2O mischen.
- Im Mikrowellenherd langsam erhitzen, bis sich der Bactoagar aufgelöst hat und sich ein homogenes Gel gebildet hat. Lassen Sie das Gel nicht kochen.
- Den Bactoagar in einem Wasserbad bei 60 °C warm halten.
- Zwischen den Experimenten bei 4 °C aufbewahren.
-
Einbettung von Sphäroiden.
- Am ersten Tag, für jede Bedingung, Pool ein Minimum von 12 Sphäroide in einem 1,5 ml Rohr.
- Einmal mit 1 ml eiskaltem 1x PBS waschen.
- Um die Sphäroide zu fixieren, fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd hinzu.
HINWEIS: Die Handhabung von Paraformaldehyd sollte in einer Dunstabzugshaube erfolgen. - Lassen Sie sie für 24 h bei RT brüten.
- Am 2. Tag erhitzen Sie das Agarose-Gel sorgfältig, indem Sie es in einen wassergefüllten Becher in einen Mikrowellenherd stellen. Stellen Sie sicher, dass das Gel nicht kocht! Warm halten in einer Tischheizungsplatte, bei 60 °C bis zum Gebrauch.
- Sphäroide zweimal mit 1 ml eiskaltem 1x PBS waschen.
- Aspirieren Sie die meisten der 1x PBS (lassen Sie an dieser Stelle ca. 100 l übrig, ist praktisch für den Umgang mit den Sphäroiden).
- Bereiten Sie eine 20-L-Pipette vor, indem Sie die Pipettenspitze an einer Steigung schneiden, um eine Spitze mit einem größeren Loch zu erhalten (siehe Abbildung).
HINWEIS: Der nächste Teil muss schnell durchgeführt werden, um eine optimale Sphäroidübertragung zu gewährleisten und eine Erstarrung des Geltropfens zu vermeiden. Wenn kein Heizblock verfügbar ist, wird empfohlen, zuerst die Sphäroide zu fangen und dann die Agarose fallen zu lassen (d. h. die Reihenfolge der Punkte 6.2.9 und 6.2.10 zu wechseln). - Machen Sie einen Agarose-Gel-Tropfen auf einem Mikroskop-Dia. Legen Sie die Rutsche auf einen warmen Heizblock, um eine Erstarrung der Agarose zu verhindern.
- Fangen Sie mit der modifizierten Pipettenspitze (siehe 6.2.8) so viele Sphäroide wie möglich in einem Volumen von 15-20 l.
- Injizieren Sie den 15-20 L Sphäroid-haltigen 1x PBS vorsichtig in die Mitte des Agarose-Geltropfens, ohne das Mikroskop-Dia zu berühren.
HINWEIS: Das ist ein etwas schwieriger Punkt. Die Sphäroide gehen verloren, wenn die Pipettenspitze das Mikroskop-Dia berührt, wenn die Sphäroide in den Geltropfen injiziert werden. Es ist ratsam, den gesamten Prozess der Herstellung der Agarose Tropfen und Injektion der Sphäroide durch Injektion einer farbigen Flüssigkeit in den Tropfen zu üben. Dies ermöglicht die Visualisierung einer möglichen Penetration durch den Tropfen, da die farbige Flüssigkeit auf die Folie austritt. - Lassen Sie das Agarose-Gel durch Inkubieren für 5-10 min bei RT oder bei 4 °C aushärten. Sobald sich der Geltropfen etwas verfestigt hat (aber immer noch ziemlich weich ist), schieben Sie den Geltropfen vorsichtig aus dem Mikroskop in eine Kunststoff-Gewebekassette mit einem Skalpell.
- Bedecken Sie die Kunststoff-Gewebekassetten mit 70% Ethanol.
HINWEIS: An dieser Stelle können die Sphäroide direkt verwendet oder monatelang gelagert werden. - Einbetten Sie das agarose-eingebettete Sphäroid in Paraffin, abschnittin 2-3 m dicke Schichtrutschen und färben Sie mit Hämatoxylin und Eosin oder unterliegen sie einer immunhistologischen Färbung.
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Representative Results
Sphäroide Wachstumsassays auf Basis des sphäroiden Bildungsprotokolls, das in Abbildung 1A und Abbildung 1Bschematisch dargestellt ist, wurden als Ausgangspunkt für die Analyse der Auswirkungen von Anti-Krebs-Medikamentenbehandlungen in einem 3D-Tumor verwendet. Imitieren Einstellung. Die Leichtigkeit, mit der Sphäroide gebildet werden, ist Zelllinienspezifisch, und einige Zelllinien erfordern eine Supplementierung mit rBM, um kohärente Sphäroide zu bilden22. Die Konzentration von rBM hinzugefügt kann die Morphologie der Sphäroide tiefgreifend beeinflussen. Wie in Abbildung 1C und Abbildung 1Ddargestellt, verändert die Variation der rBM-Konzentration zwischen 0 und 4% die Kompaktheit und Morphologie der Sphäroide zelltypabhängig. Abbildung 1 C zeigt, wie die Zugabe von bis zu 2,5% rBM die Sphäroidbildung in SKBr-3 Brustkrebszellen ohne weitere Wirkung bei Konzentrationen über 2,5% rBM ermöglicht. Im Gegensatz dazu bilden BxPC3 Pankreasduktaladenokarzinomzellen (PDAC), die eine epitheliale Morphologie aufweisen, spontan kleine, kompakte Sphäroide (Abbildung1D, oberes, linkes Panel). Bei diesem Zelltyp führt die Erhöhung der rBM-Konzentration auf 1,5 % oder mehr zu einer deutlichen morphologischen Veränderung von Sphäroid zu verworreneren Strukturen mit Vorsprüngen und Invaginationen, die an die bildung duktaler Röhrenstruktur erinnern. Umgekehrt ermöglicht die Zugabe von rBM zu zwei anderen PDAC-Zelllinien, MiaPaCa und Panc-1, die einen eher mesenchymalen Phänotyp haben, die losen zellulären Aggregate enger zu werden und kompaktere Sphäroide zu bilden (Abbildung1D, Mittel- und Unterformung Panels). Diese Ergebnisse zeigen, dass die genaue Menge an rBM, die zu einer optimalen Sphäroidbildung führt, für jede Zelllinie und Bedingung titriert werden muss.
Eine quantitative Bewertung der Zelllebensfähigkeit innerhalb der Sphäroide bei der medikamentösen Behandlung war notwendig, um die Wirkung von Krebsmedikamentenzubehandlungen zu bewerten. Der hier beschriebene Assay ist ein luziferin-luziferase-basierter Assay, der ATP misst, die aus lebenden Zellen in Sphäroiden freigesetzt wird. Das Prinzip des Assays ist in Abbildung 2Adargestellt. Das in diesem Test erzeugte Leuchtsignal wird leicht von einem Plattenleser aufgezeichnet (Abbildung 2A) und korreliert gut mit der mit anderen Methoden gemessenen Lebensfähigkeit23. Die lineare Beziehung zwischen ATP-Konzentration und Lumineszenz im relevanten Konzentrationsbereich ist in Abbildung 2Bdargestellt, während Abbildung 2C die Fähigkeit des Assays zeigt, den Zelltod in 3D-Sphäroiden zu bewerten, die mit Anti-Krebs-Therapie. Um die Linearität des Assays im relevanten Bereich weiter zu bewerten, wurden Experimente zur Ermittlung von Standardkurven des Leuchtsignals in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen durchgeführt (Abbildung2D und Abbildung 2E ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Test zur Schätzung der Zelllebensfähigkeit in 3D-Sphäroidkulturen geeignet ist und dass er für die Untersuchung des medikamentös induzierten Verlusts der Zelllebensfähigkeit geeignet ist.
Eine Kombination von lichtmikroskopischen Bildern, die alle zwei bis drei Tage während des Behandlungszeitraums aufgenommen werden, und eine abschließende quantitative Bewertung der Zelllebensfähigkeit ermöglichen eine genaue Überwachung des Sphäroidwachstums und der Morphologie sowie die Bewertung einer optimalen Behandlung. dosis. Letzteres wird in Abbildung 3A und Abbildung 3Bveranschaulicht, wo ein Dosis-Wirkungs-Experiment durchgeführt wurde, um die Dosis zu bestimmen, die für eine 50% reduzierte Zelllebensfähigkeit bei MDA-MB-231 Brustkrebssphäroiden erforderlich ist. Behandlungseffekte auf sphäroide Morphologie werden in Abbildung 3C und Abbildung 3D für MDA-MB-231 bzw. MCF-7 Sphäroide visualisiert. Während der Behandlung mit dem gewählten Chemotherapeutikumscocktail erhöht sich die Kompaktheit der MDA-MB-231 Sphäroide, während während der Behandlung mit Tamoxifen MCF-7 Sphäroide zunehmend ausgefranst und ungleichmäßig werden. In beiden Fällen ist nach 7 (MDA-MB-231) oder 9 (MCF-7) Behandlungstagen ein deutlicher Rückgang der Zelllebensfähigkeit sichtbar (Abbildung 3E und Abbildung 3F). Dies zeigt, dass sowohl eine visuelle als auch eine quantitative Bewertung der behandlungsvermittelten Wirkungen auf die Lebensfähigkeit und Morphologie von Sphäroidzellen erforderlich ist und dass diese Parameter sehr zell- und behandlungsspezifisch sind.
Als Ergänzung zum Zelllebensfähigkeitstest ermöglicht die Färbung abgestorbener Zellen mit PI, die die Membran nicht kreuzen können und daher nur nekrotische oder spätapoptotische Zellen mit beeinträchtigter Membranintegrität färben, eine schnelle räumliche Bewertung abgestorbener Zellen in Reaktion auf die Behandlung, ohne das zeitaufwändige Protokoll der Einbettung, Schnittund IHC. Wie in Abbildung 4A dargestellt, kann die räumliche Anordnung abgestorbener Zellen bei einer zunehmenden Konzentration eines Inhibitors, in diesem Fall des Na+/H+ Exchanger 1 (NHE1)-Inhibitors 5-(N-ethyl-N-Isopropyl)-Amilorid (EIPA), Visualisiert. Wie gesehen, zeigen Kontrollsphäride einen begrenzten nekrotischen/späten apoptotischen Kern, während die abgestorbenen Zellen im Sphäroid verteilt sind, wenn die Konzentration von EIPA erhöht wird.
Um die relative Induktion von apoptotischem Stress nach verschiedenen Behandlungen zu quantifizieren, wurden Sphäroide lysiert und SDS-PAGE-Gelelektrophorese und Western Blotting für die Polymerase (PARP) von Full-Length und Cleaved Poly (ADP-Ribose) unterzogen. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 4B und Abbildung 4Cdargestellt. In diesem Experiment wurden Sphäroide aus MDA-MB-231-Zellen hergestellt, in denen der Laktat-Protonen-Cotransporter MCT4 oder der Na+, HCO3- Cotransporter NBCn1 mit siRNA niedergeschlagen wurden. Der Knockdown wurde durch Western Blotting für MCT4 und NBCn1 (unveröffentlichte Daten) bewertet. Wie gesehen, erhöht der Knockdown von MCT4, aber nicht von NBCn1, die PARP-Spaltung robust, im Einklang mit unserer vorherigen Demonstration, dass ein stabiler Knockdown von MCT4 in MDA-MB-231-Zellen das Tumorwachstum in vivo24verringert.
Um die Auswirkungen der Behandlung weiter zu analysieren und Informationen über die spezifischen Signal-, Wachstums- und Todeswege zu erhalten, können die Sphäroide zusätzlich zur Western-Blot-Analyse eingebettet und einer Immunhistochemie-Analyse (IHC) unterzogen werden. Die IHC-Analyse der Sphäroidabschnitte ermöglicht die Verwendung spezifischer Antikörper oder Marker der Zellproliferation, des Zellzyklus und des programmierten Zelltodes und ermöglicht eine Visualisierung der räumlichen Anordnung proliferativer und apoptotischer Zellen im Sphäroid.
Eine schematische Abbildung des Einbettungsprotokolls für die IHC-Analyse von Sphäroiden ist in Abbildung 5Adargestellt. In Abbildung 5Bist ein repräsentatives lichtmikroskopisches Bild eines ca. 3 m dicken Mikrotomseines dargestellt, und ein Immunfluoreszenzbild eines Sphäroids, das für das Tumorsuppressorprotein p53 (Kerne mit DAPI) wird als Abbildung 5Cdargestellt. Beispiele für DMSO und chemotherapiebehandelte Sphäroide, die für den Zellproliferationsmarker Ki-67 bzw. für p53 gebeizt wurden, sind in Abbildung 5D bzw. Abbildung 5Edargestellt. In Übereinstimmung mit der antiproliferativen Wirkung der Chemotherapie ist die Anzahl der Ki-67-positiven Zellen in der DMSO-Kontrolle größer als beim mit Chemotherapie behandelten Sphäroid (Abbildung 5D). Im Gegensatz dazu wird die P53-Expression während der Bedingungen von Zellstress, Apoptose und Wachstumsstillstand erhöht, und folglich ist die Anzahl der p53-gefärbten Zellen in den mit Chemotherapie behandelten Sphäroiden wesentlich höher als bei DMSO-Kontrollen (Abbildung5 E).
Diese Ergebnisse veranschaulichen Beispiele dafür, wie räumlich gelöste (PI-Färbung, IHC) oder quantitative (westliche Slotting) Informationen über arzneimittele Behandlungseffekte in 3D-Sphäroiden erhalten werden können.
Abbildung 1 : Spontane und rBM-vermittelte Sphäroidbildung. (A) Schematische Darstellung der Sphäroidbildung mit ultraniedriger Befestigung 96-gut rund bodenplatten, mit optionaler Verwendung von rBM. Einzelne Schritte, die durch (i-iii) gekennzeichnet sind. (B) Schematische Darstellung der Sphäroidbildung mit der Hangdrop-Methode. Einzelne Schritte sind durch (i-iii) (C) repräsentative Bilder der rBM-vermittelten Sphäroidbildung von SKBr-3-Zellen gekennzeichnet. Die Zellen wurden in ultra-niedriger Befestigung 96-gut runde Bodenplatten mit zunehmenden Konzentrationen von rBM gesät und für 9 Tage angebaut. Schuppenstange 100 m .m. (n=3). (D) Repräsentative Bilder von BxPC-3-, MiaPaCa- und Panc-1-Zellen, die zur Sphäroidbildung in ultraniedriger Befestigung 96-well rund bodenplatten mit Konzentrationen von rBM von 0,5-2,5 % gesät wurden. Sphäroide wurden 4 Tage lang angebaut. Skalenstange = 250 m .m. (n=3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Prinzip und Bewertung des Zelllebensfähigkeits-Assays. (A) Schematische Darstellung des 3D-Zell-Lebensfähigkeits-Assays. Einzelne Schritte, die mit (i-iv) bezeichnet werden. (B) Leuchtsignal in Abhängigkeit von der ATP-Konzentration. Verdünnungen von ATP wurden in einer 96-Well-Platte und Zelllebensfähigkeit Reagenz zu jedem Brunnen hinzugefügt plattiert. Lumineszenz wurde nach 30 min bei 405 nm aufgezeichnet. 1 n. (C) Lebensfähigkeit, gemessen als Lumineszenz, von Kontroll- und Chemotherapie behandelten MCF-7 Sphäroiden. MCF-7-Zellen wurden in ultra-niedrigen Befestigungs-Rundbodenplatten gesät und 7 Tage lang angebaut. Am 2. und 4. Tag wurde eine Chemotherapie (5 M Cisplatin, 5 m Doxorubicin und 30 nM 5-FU) angewendet. Balken stellen Mittelwerte mit SD. 1 n. (D) Leuchtsignal als Funktion der Anzahl der ausgesäten MCF-7-Zellen dar. MCF-7-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit der angegebenen Zellzahl gesät und erlaubt, für 48 h zu wachsen, nach dem die Zelllebensfähigkeit gemessen wurde. Fehlerbalken stellen SD. 1 n. (E) Darm. Wie in D für MDA-MB-231-Zellen beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Auswirkungen von Behandlungsschemas auf sphäroide Morphologie und Zelllebensfähigkeit. (A) Repräsentative Bilder von MDA-MB-231 Sphäroiden am Tag 2, 4 und 7. MDA-MB-231-Zellen wurden in ultra-niedriger Befestigung rund unter 96-Well-Platten gesät. Die Behandlung mit zunehmenden Dosen von Chemotherapie wurde am 2. Tag begonnen, zu diesem Zeitpunkt waren alle Sphäroide von ähnlicher Größe. Reihen zeigen Sphäroide bei zunehmenden Dosen der Chemotherapie, und Spalten zeigen Sphäroide repräsentativ für die Größe an Tag 2, 4, und 7 bei der angegebenen Dosis. Die niedrigste Dosis war 18,75 nM Cisplatin, 18,75 nM Doxorubicin, 0,0625 nM 5-Fluorouracil (5-FU) und diese Dosis wurde für jedes gezeigte Bild verdoppelt, was zu einer maximalen Dosis von 0,3 m Cisplatin, 0,3 m Doxorubicin und 2 nM 5-FU führte. Skala bar = 100 m .m. (2 n). (B) Lebensfähigkeit von MDA-MB-231 Sphäroiden, gemessen als Lumineszenz, nach 7 Tagen Chemotherapie. Die Balken stellen Mittelwerte mit SEM. 2 n. (C,D) repräsentative Bilder von MDA-MB-231 (C) und MCF-7 Sphäroide (D) am Tag 2, 4, 7 und für MCF-7 Sphäroide 9 dar. Zellen, die wie in (A) gesät und entweder mit Chemotherapie behandelt werden (Chemo, 18,75 nM Cisplatin, 18,75 nM Doxorubicin, 0,0625 nM 5-FU) am Tag 2 und 4 (C) oder mit 2 M Tamoxifen (Tam) am Tag 2, 4 und 7 (D). Skalenbalken = 100 m (4 n bzw. 3 n). (E,F) Lebensfähigkeit, gemessen als Lumineszenz, am Tag 7 und 9 für (C) bzw. (D). Um auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Bedingungen zu testen, wurde ein ungepaarter Schüler-T-Test durchgeführt. bezeichnet p < 0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Propidiumiodidfärbung und Western-Blot-Analyse von Sphäroiden. (A) Repräsentative Bilder von PI-befleckten MCF-7-Sphäroiden nach 9 Tagen Behandlung. MCF-7-Zellen wurden in ultraniedriger Befestigung 96-Well-Platten für 9 Tage angebaut und mit zunehmenden Konzentrationen von EIPA an Tag 2, 4 und 7 behandelt. Am 9. Tag wurden die Sphäroide mit PI befleckt und Bilder auf einem Epifluoreszenzmikroskop aufgenommen. Skalenstange = 200 m . (1 n.) (B) Repräsentative westliche Flecken von MDA-MB-231-Zellen nach Knockout/Knockdown von Säure-Basen-Transportern. NHE1 wurde von CRISPR/Cas9 in den MDA-MB-231-Zellen 12 ausgeschlagen und die Zellen wurden anschließend vorübergehend mit siRNA gegen MCT4 oder NBCn1 transfiziert und 9 Tage lang als Sphäroide angebaut, bevor sie mit einem Antikörper lysiert und einer westlichen Blotung unterzogen wurden. Erfassung von Gesamt- und Spalten (c)PARP. (C) Quantifizierung des Verhältnisses von cPARP zu PARP-Proteinspiegel, normalisiert zur Ladekontrolle (-actin). (1 n). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5 : Fixierung, Einbettung und immunhistochemische Analyse von Sphäroiden. (A) Schematische Darstellung des Protokolls zum Einbetten von Sphäroiden. Einzelne Schritte sind als (i-vii) gekennzeichnet. (B) Bild des eingebetteten MDA-MB-231 Sphäroids. Scale bar: 50 m. (C) Repräsentatives Bild des mit Chemotherapie behandelten MDA-MB-231 Sphäroids, das einer IHC-Analyse mit Antikörpern gegen p-53 unterzogen wird. Gestrichelte Linien zeigen den Umfang des Sphäroids an. Skala bar = 20 m . (D,E) Repräsentative Bilder von DMSO- oder Chemotherapie-behandelten (obere und untere Panels) MDA-MB-231 Sphäroide. MDA-MB-231-Zellen wurden in ultra-niedriger Aufsatz 96-Well-Platten gesät, für 7 Tage angebaut und mit Chemotherapie am Tag 2 und 4 behandelt. Am 7. Tag wurden die Sphäroide eingebettet, gefolgt von einer Analyse durch IHC mit primären Antikörpern gegen Ki-67 (D) und p53 (E). Weiße Felder stellen Zoombilder dar. Skalenbalken = 20 m in beiden Vergrößerungen, (n=3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Verwendung von 3D-Krebszellsphäroiden hat sich als wertvolles und vielseitiges Werkzeug nicht nur für das Screening von Krebsmedikamenten erwiesen, sondern auch für den Gewinn mechanistischer Einblicke in die Regulierung des Krebszellsterbens und der Lebensfähigkeit unter Bedingungen, die diejenigen im Tumor imitieren. Mikroumgebung. Dies ist besonders wichtig, da die Zugänglichkeit, zelluläre Aufnahme und intrazelluläre Wirkung von Chemotherapeutika durch die physikalisch-chemischen Bedingungen im Tumor, einschließlich pH-Wert, Sauerstoffspannung, Tutuosität und chemische Zell-Zell-Wechselwirkungen9,17. Zum Beispiel verursacht der Säuregehalt des extrazellulären pH-Wertes, der bei vielen soliden Tumoren Werte von bis zu 6-6,5 erreichen kann,25,26,27,28,29, schwach grundlegende Chemotherapeutikum Verbindungen wie Doxorubicin, Mitoxantron und zwitterion paclitaxel, aufzuladen. Dies reduziert ihre Aufnahme in die Tumorzellen und kann die Aktivität von multiresistenten Proteinen wie p-Glykoprotein30,31,32beeinflussen. Auch die Zellproliferation, die für die Wirkung der meisten chemotherapeutischen Verbindungen entscheidend ist, ist in der Regel in 3D im Vergleich zu 2D-Bedingungen reduziert und ist daher wahrscheinlich besser in Tumorsphäroiden nachgeahmt als in 2D-Zellkultur8,33 ,34. Schließlich ist die dichte Tumormikroumgebung der Ursprung zahlreicher physikalischer und löslicher Signalhinweise, die intrazelluläre Signalwege leiten, die Das Zellwachstum, Überleben und Tod regulieren. Bei der Analyse der Wirksamkeit von Arzneimitteln sind 3D-Kultursysteme ein entscheidender Schritt, bevor sie sich auf In-vivo-Modelle einlassen. Ein großer Nachteil der 3D-Kultur ist jedoch die zunehmende Komplexität der Analyse im Vergleich zur 2D-Kultur. Wir haben hier einfache und relativ kostengünstige Techniken für die Sphäroidbildung mit einer Vielzahl von Krebszelltypen beschrieben. Wir haben Beispiele gezeigt, wie die Sphäroidbildung für jeden untersuchten Zelltyp optimiert werden muss, und wir haben beschrieben, wie quantitative Daten über die Zelllebensfähigkeit, den Zelltod und die damit verbundenen Signalwege in solchen Sphäroiden zu erhalten sind. Es gibt keine offensichtlichen wachstums- oder morphologischen Unterschiede zwischen den drei hier beschriebenen Modellen. In unseren Händen kann die Variation in der Morphologie mit der Hangdrop-Methode etwas größer sein, aber ein Vorteil dieser Methode ist, dass rBM nicht benötigt wird. Wir haben uns hier auf Sphäroide konzentriert, die aus einem einzelnen Krebszellentyp hergestellt werden. Das Sphäroidmodell ist jedoch auch für die Kokultur geeignet, z.B. von Krebszellen mit Fibroblasten, Monozyten/Makrophagen, Endothelzellen und/oder Adipozyten35,36,37. Weitere fortschrittliche Anwendungen dieses Modells sind die Kombination mit 3D-gedruckten Fluidi-Geräten, die eine Dosierung durch eine semipermeable Membran ermöglichen, gefolgt von der Ernte für quantitative proteomische Profilierung38.
Während, wie oben erwähnt, der Phänotyp von Zellen, die in 3D-Sphäroiden angebaut werden, im Allgemeinen den von In-vivo-Tumoren viel besser imitiert als Zellen, die in 2D angebaut werden, hängt das Ausmaß, in dem solche Sphäroide tatsächlich relevante Modelle der entsprechenden In-vivo-Tumoren sind, von zahlreichen Faktoren und muss sorgfältig bewertet werden. Parameter, die beeinflussen, wie gut solche Sphäroide die in vivo Bedingung imitieren, umfassen die zelluläre Zusammensetzung des Tumors und seine relative ECM-Zusammensetzung. Zum Beispiel ist die rBM, die wir als ECM in den hier bereitgestellten Protokollen eingesetzt haben, eine gute Wahl für die Nachahmung früher Stadien von Epithelkrebs, um die Zeit des Durchbrechens der Kellermembran, andere ECM-Zusammensetzungen werden für bestimmte Tumoren relevanter sein Typen und -stufen. Darüber hinaus unterscheidet sich die Fähigkeit zur Zell-Zell-Adhäsion zwischen den Krebszelllinien stark, abhängig von ihrer Expression von Zell-Zell- und Zellmatrix-Adhäsionsproteinen wie Cadherinen und Integrinen22.
Wie hier beschrieben, können Sphäroidwachstum und Morphologie alle 2-3 Tage mit einem Lichtmikroskop mit geringer Vergrößerungsoptik und einem großen Sichtfeld einfach und nicht-invasiv überwacht werden. Da der zytotoxische Stress, wie z. B. die Chemotherapie, die Sphäroidmorphologie sehr unterschiedlich beeinflusst, reicht es jedoch je nach Zelltyp und Behandlungsschema nicht aus, sich allein auf die Morphologie und den Umfang zu verlassen, um Behandlungseffekt. Zum Beispiel können Sphäroide mit der Behandlung und dem neu auftretenden Zelltod lockerer werden, oder der gesamte Tod kann im nekrotischen Kern auftreten, während die Oberfläche nicht nachweisbar beeinflusst wird. In beiden Fällen kann das Ergebnis ein irriger Eindruck sein, dass die Anzahl der lebenden Zellen im Sphäroid durch die Behandlung nicht reduziert wird. Quantitative und Vollsphäroid-Techniken sind daher für die Bewertung des Behandlungseffekts unerlässlich. Für die quantitative Bewertung des Zelltodes wurde der Säurephosphatase-Assay verwendet, der, wie der Name schon sagt, die Aktivität der Cytosolsäurephosphatase misst21. Jedoch, in unseren Händen, während dieser Test in der Regel schön spiegelt die Anzahl der Zellen gesät, es nicht ausreichend erfassen schnelle Behandlung-induzierten Zelltod (Daten nicht gezeigt), wahrscheinlich, weil die Säurephosphatase bleibt für einige Zeit nach dem Zelltod aktiv. Darüber hinaus erfordert dieser Test eine vollständige Entfernung des Mediums, was insbesondere bei zerbrechlichen, mit Chemotherapie behandelten Sphäroiden zu einer Verwechsslernführt wird. Der hier beschriebene Zelllebensfähigkeitstest, der auf zellulären ATP-Inhalten basiert, wurde aufgrund seines einfachen und zeiteffizienten Protokolls und der hohen Reproduzierbarkeit ausgewählt. Darüber hinaus erfordert dieser Test keine vollständige Entfernung von Kulturmedium, was ein Vorteil bei der Arbeit mit Sphäroiden ist. Wie in repräsentativen Ergebnissen gezeigt, erfasst dieser Assay sowohl die Zellzahl als auch die erwarteten Chemotherapie-Behandlungseffekte. Eine Falle dieser Technik ist jedoch offensichtlich, dass metabolische Veränderungen, die den intrazellulären ATP-Gehalt reduzieren, fälschlicherweise als niedrigere Zellzahl erfasst werden können. Daher ist eine parallele Bewertung des Sphäroidvolumens und der Morphologie oder PI-Färbung ratsam, um die Ergebnisse zu validieren.
Sphäroidlyse gefolgt von Western Blotting kann semiquantitative Einblicke in den Zustand von Signalprozessen, Zelltod-, Wachstums- und Lebensfähigkeitspfaden liefern. Die Verwendung von Western Blotting ist kompliziert, wenn rBM zur Herstellung der Sphäroide verwendet wird, da dies einen wesentlichen Bruchteil des Lysatproteingehalts ausmachen wird, und noch wichtiger ist, dass sein fraktionierter Beitrag mit abnehmendem Zellgehalt zunehmen wird. während des chemotherapeutischen Zelltodes. Grundsätzlich ist es möglich, die rBM durch Zentrifugation zu entfernen; Dies ist jedoch ein kritischer Schritt, da es schwierig ist, alle rBM vollständig zu entfernen, und dies wird einen quantitativen Vergleich zwischen den Bedingungen ausschließen. Für solche Sphäroide und generell für die räumlich aufgelöste Bewertung von Todeswegen und relevanten Signalparametern sind Einbettung und IHC starke Werkzeuge. Andere Ansätze können in Betracht gezogen werden: live konfokale Bildgebung von (relativ kleinen) intakten Sphäroiden39. Eine weitere interessante Eigenschaft von Sphäroiden ist, dass sie sich angesichts ihrer eher regelmäßigen "Ball"-Form gut für die Iteration zwischen mathematischer Modellierung und Nasslaborexperimenten eignen, um das Verständnis der Bedeutung der oben genannten Gradienten von Sauerstoff, pH und Nährstoffen innerhalb von Sphäroiden und durch Extrapolation Tumoren40,41. Obwohl also wichtige 3D-Tumormodelle von viel größerer Komplexität entstehen, einschließlich einer breiten Palette von organotypischen und organoiden Kulturen, die auf komplexen biologischen und inerten Gerüsten basieren, und nicht zuletzt patientenabgeleiteten Xenografts42, Sphäroide bleiben aufgrund ihrer überlegenen biologischen Relevanz im Vergleich zur 2D-Kultur ein wichtiges Werkzeug, kombiniert mit relativeinfacher Handhabung.
Zusammenfassend stellen wir hier eine Reihe einfacher Methoden zur Analyse von krebsbehandlungsbedingten Veränderungen der Lebensfähigkeit von Krebszellen und des Todes in der 3D-Kultur vor. Die Zusammensetzung der Sphäroide kann je nach Denkeigenschaften und Biologie der eingesetzten Zellen verändert werden, und die vorgestellten quantitativen und qualitativen Analysen sind sowohl für die Beurteilung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen als auch für die Gewinnung von Einblicken in die Signal- und Todeswege beteiligt.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken Katrine Franklin Mark und Annette Bartels für die hervorragende technische Unterstützung und Asbjarn N'hr-Nielsen für die Durchführung der Experimente in Figur 1D. Diese Arbeit wurde von der Einar Willumsen Foundation, der Novo Nordisk Foundation und der Fondation Juchum (alle an SFP) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
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