Summary
Burada, 2D kültürden çok daha iyi in vivo tümörlerin fiziko-kimyasal degradelerini taklit eden 3D kanser hücresi kürelerinin içinde canlanıyor ve ölümü değerlendirmek için birkaç basit yöntem sunuyoruz. Bu nedenle, küroid modeli, kanser ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için gelişmiş çeviri ile in vivo koşullara izin verir.
Abstract
Kanser hücrelerinin üç boyutlu kürüler hem kanser ilaç ekranları için önemli araçlar ve kanser hücresi biyoloji içine mekanik fikir kazanmak için. Bu preparatın gücü, hızlı, ucuz ve nispeten yüksek verim taramasına izin verecek kadar çok yönlü olmakla beraber, tümörün in vivo koşullarının birçok yönünü taklit etme yeteneğiyle yatıyor. Küroid kültürü koşulları, bir tümördeki fiziko-kimyasal degradeleri, artan ekstrellüler asitliği, artan lakdamak, ve glikoz ve oksijen kullanılabilirliğini azaltarak, küre çevresinden çekirdeğine kadar tekrar edebilir. Ayrıca, in vivo tümörlerin mekanik özellikleri ve hücre hücre etkileşimleri kısmen bu model tarafından taklit edilmiştir. Özel özellikleri ve sonuç olarak en iyi büyüme koşulları, 3D kürler, farklı kanser hücrelerinin türleri arasında farklıdır. Ayrıca, 3D Kürklerde hücre cancılığı ve ölümün değerlendirilmesi, 2D kültürler için istihdam edenler kısmen farklılık yöntemleri gerektirir. Burada kanser hücrelerinin 3D kürleri hazırlamak için çeşitli protokoller açıklamak ve antikanser ilaçların etkinliğini değerlendirmek bağlamında hücre canlılığı ve ölüm değerlendirmek için bu tür kültürler kullanmak için.
Introduction
Kanser biyolojisinde çok hücreli küre modellerinin kullanımı birkaç yıl eski1,2, ama son yıllarda önemli momentum kazanmıştır. Büyük ölçüde, bu kanser hücrelerinin phenoype onların mikroçevre ve spesifik büyüme koşullarına bağlı olduğu ne kadar güçlü farkındalığını arttırmaktadır. Solid tümörlerde mikroçevre, karşılık gelen normal dokularda temelde farklıdır. Bu pH gibi fiziko-kimyasal koşulları içerir, oksijen gerilimi, yanı sıra interstisyel basınç, besin gibi çözünür faktörlerin konsantrasyon degradeler, atık ürünler, ve salgılanmış sinyalizasyon bileşikleri (büyüme faktörleri, sitokinler). Ayrıca, hücre içi matris (ECM), hücreli hücre etkileşimleri ve hücresel sinyalizasyon organizasyonu ve tümör3,4, belirli üç boyutlu (3D) mimarisi diğer yönlerini içerir 5,6. Kanser hücrelerinin mevcut olduğu spesifik mikroçevresel koşullar, gen ifade profilini ve fonksiyonel özelliklerini derinden etkiler ve 2D 'de yetiştirilen hücrelerle karşılaştırıldığında, 3D kürelerinin fenotipini çok daha yakından taklit ettiği açıktır. In vivo tümörleri7,8,9,10,11. 2D modelleri, hipotoksi, Asidik pH ve yüksek laktat konsantrasyonları tümör mikroortamın bilinen yönlerini taklit etmek bile, hala tümör içinde doğan fizico-Kimyasal parametrelerin degradeleri yakalamak için başarısız, yanı sıra onların 3D tümör Mimari. Öte yandan, hayvan modelleri, pahalı, yavaş ve etik problemli, ve genellikle, aynı zamanda insan tümörü koşullarını tekrar etme yeteneğinde eksiklikleri vardır. Sonuç olarak, 3D Kürtler en katı kanserlerin çoğu özellikleri geniş bir yelpazede çalışmalarda bir ara karmaşıklık modeli olarak uygulanmıştır9,11,12,13, 14,15,16,17.
3B kürlerin yaygın olarak istihdam edilmesi, antikanser terapisi etkinliğini9,18,19,20' ye göre taramasında yer almaktadır. Tedavi tepkiler özellikle tümör mikroortama duyarlıdır, hem tortuların etkisini yansıtan, kısıtlı difüzyon, yüksek interstisyel basınç, ve ilaç teslim asidik çevresel pH, ve hipoksi ve diğer etkisi hücre ölüm tepkisi üzerinde mikroçevre yönleri9,17. 3D küre içerisindeki çevre, tüm bu özellikleri7,8,9,10,11olarak geliştirdiğinden, 3D hücre kültürlerini istihdam edebilir sonuçların in vivo koşullarına çevirisini önemli ölçüde iyileştirebilir, ancak net büyümenin verimli ve uygun maliyetli yüksek verim taramasına izin verir. Ancak, kanser hücrelerinin ilaç tepkisi üzerinde çalışmaların büyük çoğunluğu hala 2D koşullar altında gerçekleştirilir. Bu büyük olasılıkla, bazı deneyleri nispeten kolayca 3D hücre kültürler için uygulanabilir iken, birçok, gibi canlılığı gibi, Batı blotting, ve immünofluorescence analizi, çok daha uygun 2D 3D daha yapılır.
Mevcut çalışmanın amacı, Anti-kanser ilaçları ile tedavinin etkisinin analiz edilmesi için, 3 boyutlu bir tümördeki ayarı taklit eden kanser hücresi kalabilirlik ve hayatta kalma konusunda kolayca sağlamlık ve hassas protokoller sağlamaktır. Özellikle, biz sağlamak ve küresel oluşumu için üç farklı yöntemler karşılaştırmak, büyüme, canlılığı ve ilaç tepkisi nitel ve niceliksel analizler için yöntemler izledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kürler üretimi
- Hücre süspansiyonları için küroid oluşumu hazırlanması
Not: farklı hücre hatları çok farklı yapışma özelliklerine sahiptir ve her durumda en uygun küroid oluşumu Protokolü kurulmalıdır. Biz MCF-7 ve BxPC-3 hücrelerin spontan küre oluşumu için uygun olduğunu bulduk, MDA-MB-231, SKBr-3, panc-1 ve MiaPaCa başarıyla küroidler oluşturmak için reconstituted Bodrum membran ilavesi gerektirir. Asılı bırakma protokolü için yalnızca MDA-MB-231 ve BxPC-3 hücreleri kullanıldı, ancak diğer hücre hatları kesinlikle uygulanabilir.- % 70-80 konfluency kadar hücreleri tek tabakalı olarak büyütün.
- Fosfat tamponlu tuz ile yıkama hücreleri (1x PBS, 5 ml için 25 cm2 veya 10 ml için bir 75 cm2 Flask), hücre ayrışma enzim ekleyin (0,5 ml için bir 25 cm2 veya 1 ml için bir 75 cm2 Flask) ve bir hücre inküserle 2-5 min için 37 °c % 5 CO2 ve 95% nem cinsinden.
- Bir mikroskop altında hücre dekolmanı kontrol edin ve büyüme orta ekleyerek hücre dağılma enzim nötralize (6-10% serum hücre hattına bağlı olarak) Toplam hacmine 5 mL bir 25 cm2 veya 10 ml için bir 75 cm2 Flask.
- Hücreleri saymak ve hücre hazırlama başına Oda 8 kareler saymak için bir BüRkEr odası kullanın kürelerin boyutunun yüksek bir yeniden üretilebilirliği elde etmek.
Not: Her bir küroid oluşumu için farklı bir yöntem açıklayan üç protokol aşağıda sunulmuştur. Protokol 1,2 ve 1,3, sunulan tüm sonraki analitik protokoller için kullanılabilir, protokol 1,4 en iyi gömme ve lysate preparatları için uygundur. Hücre hattına bağlı olarak, kullanılan yönteme bakılmaksızın, küroid oluşumu 2-4 gün sürer.
- Spontan küroid oluşumu
- 1.1.1-1.1.4 arasındaki adımları gerçekleştirin.
- 0.5-2 x 104 hücre/ml (her hücre hattı için en uygun hücre yoğunluğunun belirlenmesi gerekir) elde etmek Için 15 ml tüpte hücre süspansiyonunu seyreltin (Şekil 1a (ii)).
- Kalan kuyuların buharlaşma azaltmak için 1x PBS veya büyüme ortamı ile kuyuların dış yüzük doldurun. Hücre süspansiyonunu steril bir rezervuar olarak aktarın ve çok kanallı pipet kullanarak 200 μL/Well 'i Ultra düşük ataşman 96-kuyu yuvarlak alt plakalara yerleştirin (Şekil 1a (III)).
- 5% CO2, 95% nem Ile 37 °c ' de bir kuluçte plakayı inkübe et.
- Her 2-3 gün, kürlerin hafif mikroskobik görüntülerini elde ederler.
Not: Bu kağıttaki resimler, bu protokoller kullanılarak hazırlanan çoğu küre için uygun olan 11.5 x büyütmede alınır. - Her 2-3 gün (görüntü aldıktan sonra) 100 μL orta yerine (harcanan orta 100 μL kaldırın ve yeni orta 100 μL ile değiştirin.
Not: Orta değiştirirken küratörlerin kaldırılmasını önlemek için, bu plaka biraz eğmek için tavsiye edilir yavaş orta kaldırarak ve onu atarak önce görünür kürler için ipuçları emişli orta incelemek.
- Reconstituted Bodrum membran-aracılı küroid oluşumu.
Not: laktoz dehidrogenaz yükseltme virüsü (LDEV)-ücretsiz azaltılmış büyüme faktörü reconstituted Bodrum membran (rBM) kullanıldı. rBM sıcaklığa duyarlıdır ve her zaman buzda tutulmalıdır, çünkü 15 °C ' ye ulaşırsa pıhtısı olacaktır. RBM 'yi buzda bir gecede 4 °C ' de ya da kaplama öncesi oda sıcaklığında (RT) 2-4 h olarak çözün.- Buz üzerinde çözme rBM (bkz. malzeme tablosu).
- Kullanmadan önce buzun üzerinde plaka ve rezervuar (ayrı olarak sarılmış ise) tutun.
- 1.1.1-1.1.4 arasındaki adımları gerçekleştirin.
- Kalan kuyuların buharlaşma azaltmak için 1x PBS veya büyüme ortamı ile kuyuların dış yüzük doldurun. 0.5-2 x 104 hücre/ml (her hücre hattı için en uygun hücre yoğunluğunun belirlenmesi gerekir) elde etmek Için 15 ml tüpte hücre süspansiyonunu seyreltin (Şekil 1a (ii)).
- Seyreltilmiş hücre süspansiyonunu içeren 15 mL tüpü buzun üzerine yerleştirin (örn. cam kabı içinde) (Şekil 1A (IIa)).
- Soğutulmuş plakaları ve rezervuar kaputu aktarın. Plastik kapları durulayın, buzla doldurun ve plakaların ve rezervuar tüm prosedür sırasında buzun üzerine yerleştirilmesine izin vermek için kaput içine aktarın.
- Homojen bir jel sağlamak için hafifçe resuspend rBM.
- % 1-2 rBM Ekle (her hücre hattı için optimum konsantrasyon belirlenmesi gerekir) soğutulmuş hücre süspansiyonları (Şekil 1A (IIb)).
- Süspansiyonu plakaya dağıtmadan önce rBM ve hücre süspansiyonunun uygun şekilde karıştırılmasını sağlamak için 15 mL tüpünü tersine çevirin.
- RBM içeren hücre süspansiyonunu steril bir rezervuar olarak aktarın ve 200 μL/Well 'i çok kanallı pipet kullanarak soğutulmuş Ultra düşük ataşman 96-kuyu plakalarına dağıtın (Şekil 1a (III)).
Not: Birkaç hücre süspansiyonları (örn., birden fazla hücre hattı) ile çalışıyorsanız, erken jellenme önlemek için rBM ek hemen sonra her hücre süspansiyon dağıtmak için esastır. - Plaka Santrifüjü 15 dakika 750 x g ' yumuşak terbiyeli ' kullanarak/frenleme (mümkünse, 4 °c ' de santrifüjler, RBM sıvısını daha uzun tutmak için ancak başarılı bir küroid oluşumu için bir gereksinim değil), RBM olduğunda hücrelerin birlikte kümelenmesini sağlamak için tek bir küroid oluşumunu kolaylaştırarak sertleşir.
- Plakayı bir kuluçte (37 °C,% 5 CO2, 95% nem) ile inkübe et.
- Her 2-3 gün küroid büyümesini değerlendirmek için ışık mikroskobik görüntüler elde.
- Her 2-3 gün 100 μL orta yerine (100 μL kaldırın ve 100 μL taze orta ile değiştirin).
- Asılı damla kürler.
- Adım 1.1.1-1.1.4 gerçekleştirin.
- Uygun bir seyreltme elde etmek için hücreleri seyreltin. Pratik bir seyreltme 50.000 hücreler/mL 'dir.
- 10 cm2 hücreli kültür çanak kapağını çıkarın ve yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Yemek için 6 mL 1x PBS ekleyin (Şekil 1B (ı)).
- Hücre süspansiyonunu steril bir rezervuar halinde dökün ve çok kanallı pipet (Şekil 1B (ii)) kullanarak hücre kültürü çanak kapağına 40 μL hücre süspansiyonunun 30 damla kadar dikkatle yerleştirin ve 2.000 hücre/damla konsantrasyonu ile sonuçlanır. Bu damlalar aşağıdaki adımda kapak ters zaman yüzey gerilimi kaybetmek daha olasıdır gibi çok kapak kenarına yakın damla yerleştirerek kaçının.
- Kapağı hızlı ama kontrollü bir hareketle tersine çevirin ve onu 1x PBS içeren hücre kültürü çanak üstüne yerleştirin (Şekil 1B (III)).
- Çanağı 37 °C ' de,% 5 CO2 ve% 95 nem ile bir kuluçla yerleştirin ve onları 4-6 gün boyunca büyümeye bırakın.
- Eğer protein endoglikozidazları veya gömme için kullanılmak üzere, havuz küreler kapağı kaldırarak ve eğim, ısıtılmış orta 1 ml ile damla yıkamak için. Elde edilen orta içeren kürleri bir 1,5 mL tüpüne aktarın ve tüpün altına yerleşmelerine izin verin. 4,4 içinde açıklandığı gibi devam edin ve 6.2.2 protein endoglikozidazları ve katıştırma için sırasıyla.
2. kürlerin ilaç tedavisi
Not: Uzun vadeli ilaç tedavisi, bir ilaç ilgi etkileri için ekran için kürler uygulanabilir. İlaç tedavisi başlatmadan önce, deneysel tedavi için uygun bir doz bulmak için, ilaç (ler) bir doz yanıtı deneyi gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Dozlar bu değerin 0.2 x-10X civarında belirlenen ıC50/kı ilaç ve aralığı dayalı olmalıdır.
- 1,2 veya 1,3 ' de açıklandığı gibi istenilen koşul başına 6-12 küre ayarlayın ve 2 gün boyunca kuluçko (37 °C,% 5 CO2,% 95 nem) olarak yerleştirin.
- 2. gün, kürlerin hafif mikroskobik görüntülerini alın.
- İlk tedavi dozlarını hazırlayın (görüntüleri aldıktan sonra).
Not: İlk tedavi konsantrasyonu, iyi içeren 100 μL ortamına ek olarak 1:2 seyreltilmiş olacak şekilde istenilen son konsantrasyon iki katı olmalıdır. Önerilen ilaç tedavi aralıkları (ilaç yarı ömrü bağlıdır): gün 2, 4 ve 7. - Çok kanallı bir pipet kullanarak, 100 μL 'i yavaşça çıkarın ve 100 μL ilaç içeren medyası ile değiştirin.
- 96-kuyu plakasını, 37 °C ' de% 5 CO2 ve% 95 nem ve tekrar 2,3 ve 2,4 tedavi sırasında, ancak şimdi doz ikiye katlayarak doğru son doz elde etmek için
- Protokol/tedavi zamanlamanın son gününde, aşağıdaki kuraldan biri veya birkaçı gerçekleştirilebilir.
3. kürler için hücre viability tahlil
- 1,2 veya 1,3 ' de açıklandığı gibi istenilen koşul başına 4-6 küre ayarlayın ve% 5 CO2 ve% 95 nem Ile 37 °c ' de kuluçla yerleştirin.
Not: Bu durumda, hücre canlılığı tahlil gün yapılmıştır 7 veya 9, sonra izlenen küroid büyüme her 2-3 gün ışık mikroskobu tarafından yukarıda açıklandığı gibi (nokta 1.2.5 ve 1.3.13). - Çözünme testi reakajının çözülmesi ( malzeme tablosunabakın) ve kullanım öncesinde RT 'ye doğrultma edelim.
- Homojen bir çözüm elde etmek için tersine çevirme ile yavaşça karıştırın.
- Tahlil yapmadan önce, kültür ortamının% 50 'ini kürlerden (100 μL) çıkarın.
- Her bir iyi bir 1:3 oranı iyi bir hücre canlılığı reaktif ekleyin (Şekil 2a (ı)) bir 96-kuyu plaka için, 50 μL reaktif, 100 μL orta için ekleyin.
- Hücre Lizi (Şekil 2A (ii)) için 5 dakika boyunca şiddetle içeriği karıştırın.
- Luminesans sinyalini stabilize etmek için RT 'de 25 dakika boyunca inküye yapın (Şekil 2A (III)).
- Işıksaçan sinyali kaydedin (Şekil 2A (iv)).
4.3D küre kültürler Batı blotting için protein Lysates hazırlanması
Not: Kürleri topladığınızda, bir P200 pipet kullanmak ve daha büyük bir açılış ve dolayısıyla kendi yapısını rahatsız etmeden kürelerinin daha kolay bir yakalama sağlamak için ucunun sonunu kesmek için tavsiye edilir.
- Her koşul için, havuz en az 12, ideal 18-24 küre (küroid boyutuna bağlı olarak) bir 1,5 mL tüp (önlemek 2 mL tüpler, sonraki adımlar daha az sivri alt nedeniyle daha zor hale gelecek gibi).
Not: Eğer orta miktarı, tüm kürler toplanan önce 1,5 mL aşıyor, toplanan kürlerin alt yerleşmek için izin (çok hızlı olur, santrifüjleme gerekli değildir) ve toplama devam etmeden önce tüp yarı hacminin atmak kalan kürler. - Boru buzun üzerine yerleştirin ve kürlerin 1,5 mL tüpünün altına yerleşmesine izin verin.
- Steril hücre laboratuvarından düzenli laboratuvara taşıyın.
- 1 mL buz soğuk 1x PBS içinde iki kez yıkayın küreler. Her yıkama adımı arasında 1x PBS çıkarmadan önce küreler yerleşmek edelim.
- Kürleri rahatsız etmeden veya çıkarmadan mümkün olduğunca fazla 1x PBS aspirate.
- Fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile 5 μL ısıtmalı liziz tamponu (LB) ekleyin (örn., 10 küroid = 50 μL LB).
- Girdap tekrarı aralıkları, kürler çözülene kadar aşağı doğru spin ile takip edilir. 30 s santrifüjleme (bir masa santrifüj kullanarak hızlı bir spin yeterli) için 10 s için yaklaşık 5-10 dk boyutuna bağlı olarak ve kürlerin kompaktum için vortekslenir bir döngü gerçekleştirin.
Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Bir standart 2D protein lysate protokolü olarak sonication, homojenizasyon ve protein belirlenmesi devam edene kadar-20 °c ' de endoglikozidazları tutun, standart protokolleri kullanarak Batı Blot izledi.
5. propidium Iodide (PI) kürlerin boyama
- 1,2 veya 1,3 ' de açıklandığı gibi istenilen koşul başına 3-6 küre ayarlayın ve% 5 CO2 ve% 95 nem Ile 37 °c ' de kuluçla yerleştirin.
- Steril bir hücre kültürü laboratuarında, 1x PBS-37 °C sıcaklığa sahiptir.
- 1x PBS 'de stok çözeltisi seyreltilerek 4 μM ' lik bir PI çözeltisi yapın: 1x PBS 'de 1 mg/mL sulu stokunun PI 1:350 seyreltilmesi.
Not: Bu konsantrasyon, 2 μM. 100 μL 'ye son konsantrasyon veren kuyulara çözümün eklenmesi üzerine daha da yarıya inecektir.
Dikkat: Propidium iyodide (PI) bir duman kaputu ve eldiven giyen ele alınmalıdır. PI hafif duyarlıdır. İşlerken ışığa karşı koruyun. - 100 μL 'den, 96-kuyu plakasının her bir kuyunda kürleri kaldırmadan çıkarın.
- Tüm kuyulara 100 μL ısıtmalı 1x PBS ekleyerek, kuyularda 100 μL sıvının kaldırılmasını sağlayarak kalan ortamı yıkayın. Bu yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
- Her bir kuyu için PI çözeltisi 100 μL ekleyin, plakayı alüminyum folyoyla Kapla ve 37 °C ' de% 5 CO2 ve% 95 nem ile 10-15 min.
- 4,5 'de açıklanan 3 yıkama adımını, görüntüleme sırasında arka plan sinyalini azaltmak için PI çözümünü yıkamak üzere tekrarlayın.
- Kürleri görüntü için bir epifluorescence mikroskop kullanın. Küre çekirdeğindeki hücrelerin canlılığı değerlendirmek için z-yığınlar kürid değişen derinliklerinde görüntüleri almak için almak.
Not: Küroid boyutuna bağlı olarak her dilim arasında 18-35 μm civarında bir adım boyutu tavsiye edilir, her küroid başına yaklaşık 11-18 yığınları verir. Z-yığınları ımagej 'de, tüm z-yığınlarını bir son resme birleştirebilir ve bu amaçla ımagej 'nin kullanımı hakkında daha fazla kılavuz için (https://imagej.net/Z-functions) görmek suretiyle, bir final resmine birleştirmek için z-projeksiyon fonksiyonunu kullanarak işlenebilir.
6.3B kürlerin gömülmesi
-
(Yalnızca gerekli ilk kez protokol gerçekleştirirken) kürlerin gömülü olduğu agaroz jel hazırlayın.
- 1 gr bactoagar Mix 50 mL ddH2O.
- Bactoagar çözünmüş ve homojen bir jel meydana gelene kadar mikrodalga fırında yavaşça ısı. Jelin kaynatmasına izin verme.
- 60 °C ' de su banyosundan bactoagar sıcak tutun.
- Deneyler arasında 4 °C ' de tutun.
-
Kürlerin gömülmesi.
- Gün 1, her koşul için, havuz bir 1,5 mL tüp en az 12 kürler.
- 1 mL buz soğuk 1x PBS ile bir kez yıkayın.
- Kürleri düzeltmek için 1 mL% 4 paraformaldehyde ekleyin.
Not: Paraformaldehitin işlenmesi bir duman kaputu içinde yapılmalıdır. - Onları RT 24 saat için inkük edelim.
- 2. gün, agaroz jelini bir mikrodalga fırınında su dolu bir beber içine yerleştirerek dikkatlice ısıtın. Jel kaynatmadığından emin olun! 60 °C ' de kullanıma kadar sıcak bir Isıtma plakasında ısınmaya devam edin.
- 1 mL buz soğuk 1x PBS ile iki kez yıkayın.
- 1x PBS 'nin çoğunu aspirate (Bu noktada yaklaşık 100 μL bırakarak, kürelerin işlenmesi için pratiktir).
- Daha büyük bir delik ile sivri bir uç elde etmek için bir eğim içinde Pipet ucunu keserek 20 μL pipet hazırlayın (resme bakın).
Not: Bir sonraki bölümde optimum küroid transferini sağlamak ve jel damlası katılaşma önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Isıtma bloğu mevcut değilse, ilk önce kürleri yakalamak ve sonra agaroz damlası (yani, 6.2.9 ve 6.2.10 noktalarının sırasını değiştirme) yapmak için tavsiye edilir. - Bir mikroskop slayt üzerinde agaroz jel damla olun. Agaroz 'nin katılaşma yapılmasını önlemek için slaytı sıcak bir Isıtma bloğuna yerleştirin.
- Değiştirilmiş Pipet ucunu kullanarak (bkz 6.2.8), 15-20 μL hacminde mümkün olduğunca çok sayıda kürü yakalayın.
- 15-20 μl küroid içeren 1x PBS 'i, mikroskop kaydırağı dokunmadan agaroz jel damlası merkezine dikkatle enjekte etmek.
Not: Bu biraz zor bir nokta. Pipet Ucu, kürleri jel damlası içine enjekte ederken mikroskop kaydırağı dokunursa, kürler kaybolacak. Bu agaroz damla yapma ve damla içine renkli bir sıvı enjekte ederek kürler enjekte tüm süreci pratik tavsiye edilir. Renkli sıvı slayt üzerine sızdıracak gibi bu, damla yoluyla potansiyel bir penetrasyon görselleştirme izin verecektir. - RT 'de veya 4 °c ' de 5-10 dk için inkübe ederek agaroz jel damla sertleşmesine izin verin. Jel damlası biraz (ama hala oldukça yumuşak) katılaştırılmış bir kez, dikkatle bir neşter ile bir plastik doku kaseti içine mikroskop slayt jel damla itin.
- 70% etanol içinde plastik doku kasetleri kapak.
Not: Bu noktada kürler doğrudan kullanılabilir veya aylar boyunca depolanabilir. - Parafin içinde agarose gömülü küre katıştırmak, 2-3 μm kalınlığında katman slaytlar içine bölüm ve hematokslin ve eozin ile leke veya immüno-histolojik boyama tabi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A ve Şekil 1B'de şematik olarak gösterilen küroid oluşumu protokolüne dayalı olarak küre büyüme, Anti-kanser ilaç tedavilerinin 3D tümördeki etkilerini analiz etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır. ayar taklit. Hangi kürler oluşturulur kolaylığı hücre hattına özeldir ve bazı hücre hatları tutarlı kürler22oluşturmak Için RBM ile takviyesi gerektirir. Eklenen rBM konsantrasyonu, kürlerin morfolojisini derinden etkileyebilmektedir. Şekil 1C ve Şekil 1D'de gösterildiği gibi, 0 ile% 4 arasında RBM konsantrasyonunun değişen bir hücre tipi bağımlı bir şekilde kürlerin kompakte ve morfolojisi değiştirir. Şekil 1 C 2,5% RBM 'ye kadar Ilavenin skbr-3 meme kanseri hücrelerinde küroid oluşumuna nasıl izin vereceğini,% 2,5 RBM 'nin üzerindeki konsantrasyonlarda daha fazla etkisi olmadığını gösterir. Buna karşılık, BxPC3 pankreatik duktal adenokarsinoma (PDAC) hücreleri, epitelyal bir morfoloji sergiler, kendiliğinden küçük form, kompakt küreler (Şekil 1D, üst, sol panel). Bu hücre türünde, rBM konsantrasyonunu% 1,5 veya üzeri olarak arttırmak, duktal tübüler yapısının oluşumunu anımsatan, protrüsiyonlar ve invaginasyonlar ile daha konik yapılara kadar farklı bir morfolojik değişikliği ortaya çıkarır. Buna karşılık, diğer iki PDAC hücre hattına rBM eklenmesi, MiaPaCa ve panc-1, daha mesenkimal fenotip var, gevşek hücresel agregaların daha sıkı hale gelmesine izin verir ve daha kompakt kürler formu (Şekil 1D, orta ve alt panelleri). Bu sonuçlar, optimal küroid oluşumuna neden olan rBM 'nin kesin miktarının her hücre hattı ve durumu için titrasyona neden olması gerektiğini göstermektedir.
Anti-kanser ilaç tedavilerinin etkisini değerlendirmek için ilaç tedavisi üzerine kürlerin içindeki hücre canlandırılabilirliği ile ilgili nicel bir değerlendirme gereklidir. Tahlil burada açıklanan bir Luciferin-luciferase-tabanlı tahlil, hangi önlemler ATP canlı hücrelerden içinde kürler içinde serbest. Testin prensibi Şekil 2A'da gösterilmiştir. Bu tahlil içinde oluşturulan Işıksaçan sinyal kolayca bir plaka okuyucu tarafından kaydedilir (Şekil 2a) ve diğer yöntemler tarafından ölçülen canlılığı ile iyi ilişkilendirir23. İlgili konsantrasyon aralığında ATP konsantrasyonu ve ışıldama arasındaki doğrusal ilişki Şekil 2B'de gösterilen, Şekil 2C ile tedavi 3D kürler hücre ölümü değerlendirmek için tahlil yeteneğini gösterir iken Anti-kanser terapisi. İlgili aralıktaki testin doğrusallığını daha da değerlendirmek için, hücrelerin sayısının bir fonksiyonu olarak Işıksaçan sinyalin standart eğrilerini kurmaya yönelik deneyler yapılmıştır (Şekil 2D ve Şekil 2E ). Bu sonuçlar, tahlil 3D küresel kültürlerde hücre canlılığı tahmin için uygun olduğunu ve hücre canlılığı ilaç kaynaklı kaybı araştırılması için geçerli olduğunu gösterir.
Her iki üç günde bir alınan ışık mikroskobik görüntülerin bir arada, tedavi süresi ve hücre canlılığı son kantitatif değerlendirmesi yanı sıra optimum tedavinin değerlendirilmesi, küroid büyüme ve morfoloji yakın gözetim sağlar Doz. İkincisi Şekil 3a ve Şekil 3B, burada bir doz-yanıt deneyi, MDA-MB-231 meme kanseri küratörlerinde% 50 azaltılmış hücre canlılığı için gerekli dozu belirlemek için gerçekleştirilen örneklenmiştir. Küroid morfolojisi üzerinde tedavi etkileri Şekil 3C ve ŞEKIL 3D MDA-MB-231 ve MCF-7 kürler için sırasıyla görselleştirildi. Seçilen kemoterapötik kokteyl ile tedavi sırasında, MDA-MB-231 kürülerin kompaktörlüğü artar, Tamoxifen ile tedavi sırasında, MCF-7 kürler giderek yıpranmış ve düzensiz hale. Her iki durumda da, 7 (MDA-MB-231) veya 9 (MCF-7) tedavi günlerini (Şekil 3E ve Şekil 3F) sonra hücre canlılığı açık bir düşüş görülebilir. Bu, hem görsel hem de tedavi aracılı etkilerini küratif hücre canlılığı ve morfoloji üzerinde hem de bu parametrelerin son derece hücre ve tedavi tipi spesifik olan bir niceliksel değerlendirme ihtiyacını gösterir.
Hücre canlılığı tahlil için bir ek olarak, PI ile ölü hücrelerin boyama, hangi membranı geçemez ve bu nedenle sadece lekeler nekrotik veya geç apoptotik hücreler tehlikeye membran bütünlüğü ile, ölü hücrelerin hızlı bir uzamsal değerlendirilmesi için izin verir tedavi tepkisi, katıştırma zaman alıcı protokolü olmadan, sekleme ve ıHC. Şekil 4' te gösterildiği gibibir inhibitör artan konsantrasyon üzerine ölü hücrelerin uzamsal düzenlemesi, bu durumda, na+/h+ eşanjör 1 (NHE1) inhibitörü 5-(n-etil-n-isopropilleri)-amilorid (EIPA), olabilir Görünür. Görüldüğü gibi, kontrol kürleri sınırlı nekrotik/geç apoptotik çekirdek gösterirken, EıPA konsantrasyonunun artması gibi ölü hücreler kürüm boyunca dağıtılır.
Farklı tedavilerin ardından apoptotik stresin göreli indüksiyonu ölçmek için, küreler lysed ve tam uzunluklu ve parçalanabilen Poly (ADP-riboz) polimeraz (PARP) için sds-page Jel Elektroforez ve Batı lekeye maruz kalmıştır. Temsili sonuçlar Şekil 4B ve Şekil 4C'de gösterilir. Bu deneyde, kürler MDA-MB-231 hücrelerinden hazırlanmış olan lakdamak-proton cotransporter MCT4 veya na+, HCO3- cotransporter NBCn1 siRNA kullanarak aşağı düştü. Nakavt MCT4 ve NBCn1 (yayımlanmamış veriler) için Batı Blot tarafından değerlendirildi. Görüldüğü gibi, MCT4 'in nakavt, ancak NBCn1, sağlam artar PARP bölünme, önceki gösteri ile tutarlı MDA-MB-231 hücrelerinde MCT4 istikrarlı nakavt, tümör büyümesini azaltır vivo24.
Tedavinin etkilerini daha fazla analiz etmek ve belirli sinyalizasyon hakkında bilgi elde etmek için-, büyüme tutuklama, ve ölüm yolları aktive, kürüler Batı leke analizine ek olarak gömülü olabilir ve immünhistokimya (IHC) analizine tabi. Küroid bölümlerinin IHC analizi, spesifik antikorlar veya hücre proliferasyonu, hücre döngüsü ve programlanmış hücre ölümü belirteçleri kullanımını sağlar ve küratif proliferatif ve apoptotik hücrelerin uzamsal düzenlemesi bir görselleştirme kolaylaştırır.
Şekil 5a' da, kürlerin IHC analizi için gömme protokolünün şematik bir figürü sunulmuştur. Gömülü bir kürünün yaklaşık 3 μm kalınlığında mikrotome bölümünün temsili bir ışık mikroskopik görüntüsü Şekil 5B'de gösterilir ve tümör bastırıcı protein p53 için lekelenmiş bir kürünün immünofluoresesans görüntüsü (çekirdekler lekeli kullanarak DAPı), Şekil 5Colarak gösterilir. Hücre proliferasyonu Marker ki-67 veya p53 için lekelenmiş olan DMSO ve kemoterapi tedavi edilen kürler örnekleri sırasıyla Şekil 5D ve Şekil 5E'de gösterilir. Kemoterapi tedavisinin antiproliferatif etkisi ile tutarlı olan ki-67 pozitif hücrelerin sayısı, DMSO kontrolünde kemoterapi tedavisi gören kürodan daha büyüktür (Şekil 5D). Buna karşılık, hücre stres, apoptoz ve büyüme tutuklanması koşullarında p53 ifadesi artar ve dolayısıyla p53-lekelenmiş hücrelerin sayısı DMSO kontrollerine kıyasla kemoterapi tedavi edilen kürlerde önemli ölçüde daha yüksektir (Şekil 5 E).
Bu sonuçlar, 3D kürlerde uyuşturucu tedavisi etkileri hakkında nasıl dağınık şekilde çözüldüğünü (PI boyama, ıHC) veya nicel (Batı lekeleme) bilgilerinin elde edilebilir örnekleri gösterilmektedir.
Şekil 1 : Spontan ve rBM-aracılı küroid oluşumu. (A) ultra düşük ek 96 kullanarak küroid oluşumunun şematik temsili-kuyu yuvarlak alt plakalar, RBM isteğe bağlı kullanımı ile. (I-III) tarafından işaretlenmiş bireysel adımlar. (B) asılı bırakma yöntemini kullanarak küroid oluşumunun şematik temsili. Bireysel adımlar (i-iii) (C) skbr-3 hücrelerinin RBM-aracılı küroid oluşumunun temsili görüntülerine göre işaretlenir. Hücreler Ultra düşük ek 96-iyi yuvarlak alt plakalar rBM konsantrasyonları artan ve 9 gün boyunca yetiştirilen ile tohumlandı. Ölçek çubuğu 100 μm. (n = 3). (D) bxpc-3, miapaca ve panc-1 hücrelerinin temsilcisi görüntüleri Ultra düşük ek 96-iyi yuvarlak alt plakaları RBM konsantrasyonu ile 0.5-2.5% içinde küroid oluşumu için seribaşı. Kürler 4 gün boyunca büyüdü. Ölçek çubuğu = 250 μm. (n = 3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : İlke ve hücre canlılığı tahlil değerlendirilmesi. (A) 3D hücre canlılığı tahlil şematik temsili. (I-IV) tarafından belirtilen bireysel adımlar. (B) ATP konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak Işıksaçan sinyal. ATP 'nin dilüsyonları bir 96-Well plaka ve hücre canlılığı reaktif her iyi eklenen kaplanmış. Luminescence 405 nm 'de 30 dakika sonra kaydedildi. 1 n. (C) viability, Luminesans olarak ölçülen, kontrol ve kemoterapi tedavi MCF-7 kürler. MCF-7 hücreleri Ultra-düşük ataşman yuvarlak alt plakaları ile tohumlandı ve 7 gün boyunca büyüdü. 2 ve 4. gün kemoterapi tedavisi (5 μM Cisplatin, 5 μM Doxorubicin ve 30 nM 5-FU) uygulandı. Çubuklar, SD ile ortalama değerleri temsil eder. 1 n. (D) MCF-7 hücrelerinin sayısının fonksiyonu olarak Işıksaçan sinyal. MCF-7 hücreler belirtilen hücre numarası 96-Well plakaları içinde tohumlandı ve 48 h için büyümek için izin, hücre canlılığı ölçülmüştür sonra. Hata çubukları SD. 1 n. (E) MDA-MB-231 hücreler için D 'de açıklandığı gibi temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Tedavi rejimlerinin küroid Morfoloji ve hücre viability üzerinde etkileri. (A) 2, 4 ve 7. gün MDA-MB-231 kürlerin temsili görüntüleri. MDA-MB-231 hücreleri Ultra düşük ataşman yuvarlak alt 96-Well plakaları ile tohumlandı. Artan doz kemoterapi ile tedavi gün 2, hangi zaman tüm küroidler benzer boyutta oldu başlatıldı. Satırlar kemoterapi dozları artan küreler göstermek, ve sütunlar gün 2, 4 ve 7 belirtilen dozda küroidler temsilcisi gösterir. En düşük doz 18,75 nM Cisplatin oldu, 18,75 nM Doxorubicin, 0,0625 nM 5-fluorourasil (5-FU) ve bu doz gösterilen her görüntü için iki katına çıktı, maksimal doz sonuçlanan 0,3 μM Cisplatin, 0,3 μM Doxorubicin ve 2 nM 5-FU. Ölçek çubuğu = 100 μm. (2 n). (B) MDA-MB-231 küre, 7 gün kemoterapötik tedavi sonrasında Luminesans olarak ölçülmüştür. Çubuklar, SEM ile ortalama değerleri temsil eder. 2 n. (c, D) MDA-MB-231 (c)ve MCF-7 küre (d) gün 2, 4, 7 ve MCF-7 kürler 9 temsili görüntüler. (A) olarak üretilen ve 2, 4 ve 7 (D) gün içinde kemoterapi (chemo, 18,75 nm cisplatin, 18,75 nm Doxorubicin, 0,0625 Nm 5-Fu) ile tedavi edilen hücreler (A) ve 2 ΜM Tamoxifen (tam) ile, 2 ve 4 (C) olarak değerlendirilmiştir. Ölçek çubuğu = 100 μm. (4 n ve 3 n), sırasıyla. (E, F) Gün 7 ve 9 için (C) ve (D), sırasıyla Luminescence olarak ölçülen viability. Koşullar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark test etmek için eşleştirilmemiş bir öğrencinin t-testi yapıldı. gösterir p < 0,0001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Propidium iyodide boyama ve kürlerin Batı leke analizi. (A) 9 günlük TEDAVI sonrasında PI-LEKELI MCF-7 kürlerin temsili görüntüleri. MCF-7 hücreleri Ultra-düşük eki 96-Well plakaları 9 gün boyunca yetiştirilen ve günde 2, 4 ve 7 EıPA konsantrasyonları artan ile tedavi edilmiştir. 9. günde, kürler PI ile lekelenmişti ve görüntüler bir epifluorescence mikroskobu üzerinde elde edildi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (1 n.) (B) asit-baz taşımacıkların nakavt/geri attıktan sonra MDA-MB-231 hücrelerinin temsilcisi Batı lekesi. NHE1, MDA-MB-231 hücrelerinde Crispr/Cas9 tarafından yıkıldı ve hücreler daha sonra MCT4 veya NBCn1 karşı siRNA ile aktarıldı ve bir antikor kullanarak Batı Blot maruz önce ve 9 gün boyunca kürler olarak yetiştirilen Total ve parçalanabilen (c) PARP tanıma. (C) cparp 'nin PARP protein düzeyine oranı, yükleme kontrolüne normalleştirilmiş (β-aktik). (1 n). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Kürlerin sabitleme, gömme ve immünhistokimya analizi. (A) kürlerin gömülmesi için protokolün şematik temsili. Bireysel adımlar (ı-VII) olarak işaretlenir. (B) katıştırılmış MDA-MB-231 küroid görüntüsü. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C) p-53 karşı antikorlar Ile IHC analizine maruz KEMOTERAPI tedavi MDA-MB-231 küroid temsili görüntü. Kesikli çizgiler, kürlerin çevresini gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D, E) DMSO-veya kemoterapi-tedavi (üst ve alt paneller, sırasıyla) temsılcı görüntüleri MDA-MB-231 kürler. MDA-MB-231 hücreler, 7 gün boyunca yetiştirilen ve 2 ve 4. gün kemoterapi ile tedavi edilen Ultra-düşük ataşman 96-Well plakaları ile kaynatıldı. 7. gün, kürler, ki-67 (D) ve p53 (E) karşı primer antikorlar ile IHC tarafından analiz takip gömülü edildi. Beyaz kutular yakınlaştırma görüntülerini temsil eder. Ölçek çubuğu = her iki büyütmelerde 20 μm (n = 3). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3D kanser hücresi kürüler kullanımı sadece antikanser ilaç taraması için değerli ve çok yönlü bir araç kanıtlanmıştır, aynı zamanda tümör bu taklit koşullar altında kanser hücresi ölüm ve canlılığı düzenlenmesi içine mekanik fikir kazanmak için Mikro. Bu özellikle erişilebilirlik, hücresel alımı ve kemoterapötik ilaçların hücre içi etkileri gibi tümör, pH, oksijen gerilimi, tortuluk ve fiziksel ve fiziko-kimyasal koşullar tarafından derinden etkilenir çok önemlidir kimyasal hücre-hücre etkileşimleri9,17. Örneğin, birçok katı tümörün25,26,27,28,29' da 6-6.5 kadar düşük değerlere ulaşabilen ekstrsellüler pH asitliği, zayıf temel kemoterapötik nedenleri bileşikler, Doxorubicin gibi, mitoksantron ve zwitterion paclitaxel, şarj edilecek. Bu, tümör hücrelerine alımı azaltır ve p-glikoprotein gibi multiilaç direnci proteinleri etkinliğini etkileyebilir30,31,32. Ayrıca, en kemoterapötik bileşiklerin etkisi için önemli olan hücre proliferasyonu, genellikle 2D koşullara kıyasla 3D azalır ve bu nedenle muhtemelen daha iyi 2D hücre kültürü daha tümör kürleri taklit edilir8,33 ,34. Son olarak, yoğun tümör mikroçevre hücre büyüme, hayatta kalma ve ölüm düzenleyen hücreler arası sinyal yolları yönlendiren çok sayıda fiziksel ve çözünmüş sinyalizasyon ipuçları orijini olduğunu. Böylece, ilaç etkinliğini analiz ederken, 3D kültür sistemleri in vivo modellerde başlamadan önce önemli bir adımdır. 3D kültürünün büyük bir dezavantajı, ancak, 2D kültürü ile karşılaştırıldığında analiz artan karmaşıklığı olduğunu. Biz burada tarif ettik basit ve nispeten ucuz teknikler kanser hücre türleri çeşitli kullanarak küroid oluşumu için. Her hücre tipi için nasıl küroid oluşumunun optimize edilmesi gerektiğini ve bu tür alanlarda hücre canlandırılabilirliği, hücre ölümü ve ilişkili sinyal yolları hakkında niceliksel verilerin nasıl elde edileceği hakkında örnekler gösterdik. Burada açıklanan üç model arasında belirgin bir büyüme veya morfolojik farklar yoktur. Bizim elimizde, morfolojideki varyasyon asılı bırakma yöntemi kullanılarak biraz daha büyük olabilir, ancak bu yöntemin bir avantajı rBM gerekli değildir. Burada tek bir kanser hücresinden üretilen kürler üzerinde duruldu. Küroid modeli, ancak, aynı zamanda co-Culture için, fibroblastlar, monosit/makrofajları, endotel hücreler ve/veya adipositler35,36,37ile kanser hücrelerinin örneği için de imkan sağlar. Bu modelin diğer gelişmiş uygulamaları arasında, yarı geçirgen bir membrandan dozajlama sağlayan 3D baskılı fluidik cihazlar ile kombinasyonu ve ardından niceliksel proteomik profil38için hasat yapılır.
Süre, yukarıda belirtildiği gibi, 3D kürelere yetiştirilen hücrelerin fenotipi genellikle in vivo tümörler çok 2D yetiştirilen hücreler çok daha iyi taklit, bu tür küroidlerin aslında ilgili modelleri ilgili içinde vivo tümörler bağlıdır çok sayıda faktörler ve dikkatle değerlendirilmelidir. Bu tür kürlerin in vivo durumunun ne kadar iyi taklit ettiğini etkileyen parametreler, tümör ve göreli ECM bileşiminin hücresel bileşimine dahil edilir. Örneğin, burada sağlanan protokollerde ECM olarak istihdam ettiğimiz rBM, epitel kanserlerinin erken aşamalarında taklit etmek için iyi bir seçimdir, Bodrum membranı ihlal ederken, diğer ECM bileşimleri belirli tümörlerle daha alakalı olacaktır türleri ve-aşamaları. Ayrıca, hücre-hücre yapışması için kapasite yaygın kanser hücresi hatları arasında farklıdır, kendi ifadesine bağlı olarak hücre hücresi ve hücre-matris yapışma proteinleri gibi cadherinler ve integrinler22.
Burada açıklandığı gibi, küroid büyüme ve morfoloji kolayca ve non-invazif düşük büyütme optik ve geniş bir görüş alanı ile bir ışık mikroskop kullanarak her 2-3 gün izlenebilir. Ancak, kemoterapi tedavisi gibi sitotokezik stres, küroid morfolojisini çok farklı etkileyen ve hücre türü ve tedavi planına bağlı olarak, bir şekilde, bu Morfoloji ve çevre tek başına değerlendirmek için yeterli değildir tedavi etkisi. Örneğin, kürler tedavi ve gelişen hücre ölümü ile daha gevşek hale gelebilir, ya da tüm ölüm nekrotik çekirdeğin içinde meydana gelebilir, yüzey algılanamayacak şekilde etkilenmez. Her iki durumda da, sonuç, kürodeki canlı hücrelerin sayısının tedavi tarafından azaltılan hatalı bir izlenim olabilir. Nicel-ve tüm küratif teknikler bu nedenle tedavi etkisini değerlendirmek için önemlidir. Hücre ölümün nicel değerlendirilmesi için, adı olarak sitosolik asit fosfataz aktivitesini önlemler anlamına gelen asit fosfataz tahlil, istihdam edilmiştir21. Ancak, bizim ellerimizde, bu tahlil genellikle güzel hücrelerin sayısını yansıtan iken, yeterli hızlı tedavi kaynaklı hücre ölümü yakalamak değil (veri gösterilmez), çünkü asit fosfataz hücre ölümünden sonra bir süre için aktif kalır muhtemelen. Ayrıca, bu tahlil, özellikle kırılgan, kemoterapi tedavi edilen kürler ile hata artar orta, tam kaldırılması gerektirir. Hücre canlılığı tahlil burada açıklanan, hangi hücresel ATP içeriğine dayanmaktadır, onun basit ve zaman verimli protokol ve yüksek reproducibility dayalı seçildi. Ayrıca, bu tahlil kültür orta tam kaldırılması gerektirmeyen bir avantaj olan kürler ile çalışırken. Temsili sonuçlarında gösterildiği gibi, bu tahlil iyi hem hücre numarası ve beklenen kemoterapi tedavisi etkileri yakalar. Ancak, bu tekniğin bir tuzakı, belli ki, hücre içi ATP içeriğini azaltan metabolik değişikliklerin hatalı bir şekilde daha düşük bir telefon numarası olarak kaydedilmesine neden olabilir. Bu nedenle, küroid hacmi ve morfoloji veya PI boyama paralel değerlendirme sonuçları doğrulamak için tavsiye edilir.
Batı şişme tarafından izlenen küroid lizis sinyalizasyon süreçleri, hücre ölümü-, büyüme-ve canlılığı yolları devlet içine yarı nicel fikir sağlayabilir. Bu lysate protein içeriğinin önemli bir kısmını oluşturur ve daha da önemlisi, onun fraksiyonel katkısı azalan hücresel içerik ile artacaktır çünkü Batı Blot kullanımı, RBM, kürleri hazırlamak için kullanıldığında karmaşık kemoterapötik hücre ölümü sırasında. RBM 'nin santrifüjleme ile kaldırılması prensip olarak mümkündür; Ancak, tüm rBM tamamen kaldırmak zor olduğu için bu kritik bir adımdır ve bu koşullar arasında niceliksel karşılaştırma önleyen. Bu tür alanlarda ve genel olarak, ölüm yollarının ve ilgili sinyalizasyon parametrelerinin dağınık bir şekilde çözülmesi için, gömme ve ıHC güçlü araçlardır. Diğer yaklaşımlar göz önünde bulundurulabilir: (nispeten küçük) bozulmamış küreler39canlı Konfokal görüntüleme. Kürelerin bir başka ilginç özelliği, onların oldukça düzenli "top" şekli verilen, onlar matematiksel modelleme ve ıslak laboratuar denemeleri arasında yineleme için kendilerini ödünç, yukarıda bahsedilen önemini anlayış artırmak için Oksijen degradeleri, pH, ve küreler içinde besin, ve, Extrapolation tarafından, tümörler40,41. Böylece, çok daha fazla karmaşıklık önemli 3D tümör modelleri ortaya çıkıyor, karmaşık biyolojik yanı sıra inert iskeleler dayalı organotypic ve nevuslardır kültürler geniş bir yelpazede dahil olmak üzere, ve, en azından, hasta tarafından türetilen ksenogreft42, küroidler, göreli kullanım kolaylığı ile birlikte 2B kültüre kıyasla üstün biyolojik alaka nedeniyle önemli bir araç olarak kalır.
Özetle, burada anti-kanser tedavisi kaynaklı değişikliklerin analiz için basit yöntemler bir dizi mevcut kanser hücre canlılığı ve 3D kültürde ölüm. Kürlerin bileşimi, istihdam edilen hücrelerin özelliklerine ve biyolojisine bağlı olarak değiştirilebilir ve sunulan nicel ve niteliksel analizler, hem doz-yanıt ilişkilerini değerlendirmek hem de bilgi kazanmak için yararlıdır. sinyalizasyon-ve ölüm yolları dahil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.
Acknowledgments
Biz Katrine Franklin Mark ve Annette Bartels için mükemmel teknik yardım ve Asbjørn Nøhr-Nielsen şekil 1D deneyler gerçekleştirmek için minnettarız. Bu çalışma Einar Willumsen Vakfı, Novo Nordisk Vakfı ve Fondation Juchum (tüm SFP için) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
