Summary
Her presenterer vi flere enkle metoder for å evaluere levedyktighet og død i 3D kreftcelle spheroids, som etterligner fysikalsk-kjemiske graderinger av in vivo svulster mye bedre enn 2D kulturen. Den spheroid modellen tillater derfor evaluering av effekten av kreft stoffet med forbedret oversettelse til in vivo-forhold.
Abstract
Tredimensjonale spheroids av kreftceller er viktige verktøy for både kreft narkotika skjermer og for å få mekanistisk innsikt i kreftcelle biologi. Kraften i dette preparatet ligger i sin evne til å etterligne mange aspekter av in vivo forhold av svulster, samtidig som rask, billig og allsidig nok til å tillate relativt høy gjennomstrømming screening. Spheroid kultur forhold kan recapitulate fysikalsk-kjemiske graderinger i en svulst, inkludert den økende ekstracellulære Surhet, økt melkesyre, og redusere glukose og oksygen tilgjengelighet, fra spheroid periferi til kjernen. Også mekaniske egenskaper og celle-celle interaksjoner av in vivo svulster er delvis etterlignet av denne modellen. De spesifikke egenskaper og følgelig de optimale vekstforhold, av 3D spheroids, varierer mye mellom ulike typer kreftceller. Videre krever vurderingen av celle levedyktighet og død i 3D-spheroids metoder som avviker delvis fra de som er ansatt for 2D-kulturer. Her beskriver vi flere protokoller for å forberede 3D-spheroids av kreftceller, og for å bruke slike kulturer for å vurdere celle levedyktighet og død i sammenheng med å evaluere effekten av anticancer legemidler.
Introduction
Bruken av flercellede spheroid modeller i kreft biologi er flere ti år gammel1,2, men har fått betydelig momentum de siste årene. I stor grad, dette reflekterer økt bevissthet om hvor sterkt fenotype av kreftceller er avhengig av deres mikromiljøet og spesifikke vekstforhold. Mikromiljøet i solide svulster er fundamentalt forskjellig fra det i tilsvarende normalt vev. Dette inkluderer fysikalsk forhold som pH, oksygen spenninger, samt interstitiell trykk, konsentrasjon graderinger av løselige faktorer som næringsstoffer, avfallsprodukter, og utskilles signalering forbindelser (vekstfaktorer, cytokiner). Videre omfatter det organiseringen av ekstracellulære Matrix (ECM), celle-celle interaksjoner og intercellulære signalering, og andre aspekter av den spesielle tredimensjonale (3D) arkitektur av tumor3,4, 5,6. Den spesifikke microenvironmental forhold der kreftceller eksisterer, dypt påvirke deres genuttrykk profil og funksjonelle egenskaper, og det er klart at, sammenlignet med celler dyrket i 2D, fenotype av 3D spheroids mye nærmere etterligner at av in vivo svulster7, 8,9,10,11. 2D-modeller, selv om de ansetter hypoksi, syrlig pH, og høy melkesyre konsentrasjoner å etterligne kjente aspekter av tumor mikromiljøet, fortsatt ikke klarer å fange graderinger av fysikalsk-kjemiske parametre som oppstår innenfor svulster, så vel som deres 3D svulst Arkitektur. På den annen side, dyremodeller er kostbare, langsom, og etisk problematisk, og generelt, har også svakheter i sin evne til å recapitulate menneskelige tumor forhold. Følgelig har 3D spheroids blitt brukt som en mellomliggende kompleksitet modell i studier av et bredt spekter av egenskaper av de fleste solide kreft9,11,12,13, 14,15,16,17.
En utbredt bruk av 3D spheroids er i screening analyser av anticancer terapi effekt9,18,19,20. Behandlings responsen er spesielt følsomme for tumor mikromiljøet, som reflekterer både virkningen av tortuosity, begrenset diffusjon, høyt interstitiell trykk, og sure miljømessige pH på narkotika levering, og virkningen av hypoksi og andre aspekter av mikromiljøet på cellen død respons9,17. Fordi miljøet innen 3D spheroids iboende utvikler alledisse egenskapene7,8,9,10,11, ansette 3D cellekulturer kan vesentlig forbedre oversettelsen av resultatene til in vivo forhold, men likevel tillate effektiv og rimelig høy gjennomstrømming screening av netto vekst. Imidlertid er det store flertallet av studier på stoffet responsen av kreftceller fortsatt utført under 2D forhold. Dette gjenspeiler sannsynligvis, mens noen analyser relativt lett kan implementeres for 3D cellekulturer, mange, slik som levedyktighet analyser, vestlig blotting, og immunofluorescence analyse, er mye mer praktisk gjort i 2D enn i 3D.
Målet med dagens arbeid er å gi lett mottagelig analyser og presise protokoller for analyser av effekten av behandling med anti-kreft narkotika på kreftcelle levedyktighet og overlevelse i en 3D svulst etterligne innstillingen. Nærmere bestemt gir vi og sammenligner tre ulike metoder for spheroid dannelse, etterfulgt av metoder for kvalitative og kvantitative analyser av vekst, levedyktighet og narkotika respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generering av Spheroids
- Klargjøre celle suspensjoner for spheroid dannelse
Merk: ulike cellelinjer har svært forskjellige vedheft egenskaper og den mest egnede spheroid formasjon protokollen må etableres i hvert enkelt tilfelle. Vi har funnet at MCF-7 og BxPC-3-celler er egnet for spontan spheroid formasjon, mens MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 og MiaPaCa krever tilsetning av rekonstituert kjeller membran for å kunne danne spheroids. Bare MDA-MB-231 og BxPC-3-celler har vært ansatt for hengende slipp-protokollen, men andre cellelinjer er sikkert aktuelt.- Dyrke celler som monolag inntil 70-80% confluency.
- Vask celler med fosfat bufret saltvann (1x PBS, 5 mL for en 25 cm2 eller 10 ml for en 75 cm2 kolbe), tilsett celle dissosiasjon enzym (0,5 ml for en 25 cm2 eller 1 ml for en 75 cm2 kolbe) og ruge cellene for 2-5 min ved 37 ° c i 5% CO2 og 95% fuktighet.
- Sjekk celle avløsning under et mikroskop og nøytralisere celle dissosiasjon enzym ved å legge vekstmedium (6-10% serum avhengig av cellelinje) til et total volum på 5 mL i en 25 cm2 eller 10 ml for en 75 cm2 kolbe.
- Bruk en Bürker kammer for å telle celler og telle 8 firkanter i kammeret per celle forberedelse for å få en høy reproduserbarhet av størrelsen på spheroids.
Merk: Nedenfor vises tre protokoller som hver beskriver en annen metode for spheroid formasjon. Protokoll 1,2 og 1,3 kan brukes for alle de påfølgende analytiske protokollene som presenteres, mens protokoll 1,4 egner seg best til innebygging og lysat av forberedelser. Avhengig av cellelinjen, spheroid formasjon tar 2-4 dager, uavhengig av hvilken metode som brukes.
- Spontan spheroid dannelse
- Utføre trinn 1.1.1-1.1.4.
- Fortynne celle fjæringen i et 15 mL rør for å oppnå 0,5-2 x 104 celler/ml (optimal celle tetthet må fastsettes for hver cellelinje) (figur 1a (II)).
- Fyll den ytre ringen av brønner med 1x PBS eller vekstmedium for å redusere fordampning fra de resterende brønnene. Overfør celle fjæringen til et sterilt reservoar og ved hjelp av en flerkanals pipette, dispensere 200 μL/brønn i Ultra-Low vedlegg 96-vel runde bunnplater (figur 1a (III)).
- Ruge platen i en inkubator ved 37 ° c med 5% CO2, 95% fuktighet.
- Hver 2-3 dager få lette mikroskopiske bilder av spheroids.
Merk: Bildene i dette papiret er tatt på 11,5 x forstørrelse, noe som er hensiktsmessig for de fleste spheroids utarbeidet ved hjelp av disse protokollene. - Hver 2-3 dag (etter å ha innhentet bilder) erstatter 100 μL av medium (Fjern 100 μL av det brukte mediet og erstatter med 100 μL av friskt medium.
Merk: For å unngå å fjerne spheroids når du skifter medium, er det tilrådelig å vippe platen litt mens langsomt fjerne mediet og inspisere pustende medium i tips for synlige spheroids før du forkaster den.
- Rekonstituert kjeller membran-mediert spheroid formasjon.
Merk: laktose dehydrogenase heve virus (LDEV)-gratis redusert vekstfaktor rekonstituert kjeller membran (rBM) ble brukt. rBM er temperatur følsom og bør alltid holdes på is, da det vil blodpropp hvis den når 15 ° c. Tin rBM på isen enten over natten ved 4 ° c eller 2-4 h ved romtemperatur (RT) før plating.- Tin rBM på is (se tabell over materialer).
- Oppbevar platene og reservoarene (hvis de er pakket enkeltvis) på is før bruk.
- Utføre trinn 1.1.1-1.1.4.
- Fyll den ytre ringen av brønner med 1x PBS eller vekstmedium for å redusere fordampning fra de resterende brønnene. Fortynne celle fjæringen i et 15 mL rør for å oppnå 0,5-2 x 104 celler/ml (optimal celle tetthet må fastsettes for hver cellelinje) (figur 1a (II)).
- Plasser 15 mL røret som inneholder den fortynnede celle fjæringen på is (f.eks. i glass beger) (figur 1A (IIA)).
- Overfør kjølt platene og reservoarer til panseret. Skyll plastbeholdere, fylle dem med is og overføre dem inn i panseret slik at platene og reservoarene skal plasseres på isen under hele prosedyren.
- Resuspend rBM forsiktig for å sikre en homogen gel.
- Legg 1-2% rBM (optimal konsentrasjon må fastsettes for hver cellelinje) til kjølt cellen suspensjoner (figur 1A (IIB)).
- Inverter 15 mL rør for å sikre riktig blanding av rBM og celle fjæring før utlevering av suspensjonen inn i platen.
- Overfør rBM som inneholder celle fjæringen, til et sterilt reservoar og dispensere 200 μL/brønn i kjølt ultra-lav feste 96-brønn plater ved hjelp av en flerkanals pipette (figur 1a (III)).
Merk: Hvis du arbeider med flere celle suspensjoner (f. eks, mer enn en cellelinje), er det viktig å dispensere hver celle suspensjon umiddelbart etter rBM tillegg for å hindre prematur gelling. - Sentrifuger platen for 15 min på 750 x g bruker ' myke anstendig '/no bremsing (hvis mulig, sentrifuger ved 4 ° c for å holde rBM væsken lenger, men ikke et krav for vellykket spheroid formasjon), for å sikre at cellene er gruppert sammen når rBM stivner, tilrettelegge dannelsen av en enkelt spheroid.
- Ruge platen i en inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% fuktighet).
- Hver 2-3 dager få lys mikroskopiske bilder for evaluering av spheroid vekst.
- Hver 2-3 dag erstattes 100 μL av medium (Fjern 100 μL og erstattes med 100 μL av friskt medium).
- Hengende dråpe spheroids.
- Utfør trinn 1.1.1-1.1.4.
- Fortynne celler for å få en passende fortynning. En praktisk fortynning er 50 000 celler/mL.
- Fjern lokket på en 10 cm2 cellekultur rett og plasser den slik at den vender oppover. Tilsett 6 mL 1x PBS til parabolen (figur 1B (i)).
- Hell celle fjæringen i et sterilt reservoar og plasser forsiktig opptil 30 dråper 40 μL av celle fjæring på lokket på cellekultur parabolen ved hjelp av en flerkanals pipette (figur 1B (II)), noe som resulterer i en konsentrasjon av 2 000 celler/dråpe. Unngå å plassere dråpene for nær kanten av lokket da disse dråpene er mer sannsynlig å miste overflatespenning når invertere lokket i følgende trinn.
- Vend lokket i en rask, men kontrollert bevegelse, og plasser det på toppen av den 1x PBS-inneholdende cellekultur parabolen (figur 1B (III)).
- Plasser fatet i en inkubator på 37 ° c med 5% CO2 og 95% fuktighet uten å forstyrre dråpene og la dem vokse i 4-6 dager.
- Hvis det skal brukes til protein lysater eller innebygging, Pool spheroids ved å fjerne lokket og vipp den, for å vaske ned dråpene med 1 mL oppvarmet medium. Overfør det resulterende mediet som inneholder spheroids til en 1,5 mL slange og la dem bosette seg til bunnen av røret. Fortsett som beskrevet i 4,4 og 6.2.2 for henholdsvis protein lysater og-innebygging.
2. behandling av Spheroids
Merk: Langtidsbehandling av legemidler kan anvendes på spheroids for å få en skjerm for virkningene av et legemiddel av interesse. Før igangsetting av narkotikabehandling, er det tilrådelig å utføre en dose respons eksperiment av stoffet (e), for å finne en passende dose for eksperimentell behandling. Dosene skal være basert på den bestemte IC50/K i av stoffet og spenner fra rundt 0,2 x-10x av denne verdien.
- Sett opp 6-12 spheroids i henhold til ønsket tilstand som beskrevet i 1,2 eller 1,3 og plasser i inkubator (37 ° c, 5% CO2, 95% fuktighet) i 2 dager.
- På dag 2, ta lette mikroskopiske bilder av spheroids.
- Klargjør de første behandlings dosene (etter å ha innhentet bilder).
Merk: Den første behandlings konsentrasjonen må være to ganger den ønskede endelige konsentrasjonen, da oppløsningen vil bli fortynnet 1:2 ved tillegg til brønnen som inneholder 100 μL-medium. Anbefalte behandlingsintervaller for narkotika (vil avhenge av narkotika halveringstiden): dag 2, 4 og 7. - Ved hjelp av en flerkanals pipette fjerner du 100 μL av medium forsiktig og erstatter den med 100 μL av stoff som inneholder medium.
- Plasser 96-platen tilbake i inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 og 95% luftfuktighet og Gjenta 2,3 og 2,4 på de valgte behandlings dagene, men nå uten å doble dosen for å få riktig slutt dose.
- På den siste dagen i protokoll/behandlings tidsplanen kan en eller flere av følgende analyser utføres.
3. Cell levedyktighet analysen for Spheroids
- Sett opp 4-6 spheroids i henhold til ønsket tilstand som beskrevet i 1,2 eller 1,3, og plasser i inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 og 95% fuktighet.
Merk: I dette tilfellet, cellen levedyktighet analysen ble utført på dag 7 eller 9, etter å ha overvåket spheroid vekst hver 2-3 dager ved lys mikroskopi som beskrevet ovenfor (punkt 1.2.5 og 1.3.13). - Tin den levedyktighet analysen reagens (se tabell over materialer) og la det LIKEVEKT til RT før bruk.
- Bland forsiktig ved invertere å få en homogen løsning.
- Før du utfører analysen, Fjern 50% av kultur mediet fra spheroids (100 μL).
- Legg celle levedyktighet reagens til hver brønn på et 1:3 forhold til mengden av medium til stede i brønnen (figur 2a (i)) for en 96-brønn plate, tilsett 50 μL av reagens til 100 μL av medium.
- Bland innholdet kraftig i 5 minutter for å indusere cellelyse (figur 2A (II)).
- Ruge for 25 min ved RT å stabilisere selvlysende signal (figur 2A (III)).
- Ta opp selvlysende signal (figur 2A (IV)).
4. forberede protein Lysater for vestlig blotting fra 3D spheroid kulturer
Merk: Når du samler inn spheroids, er det tilrådelig å bruke en P200 pipette og kutte enden av spissen for å tillate en større åpning og dermed en enklere fangst av spheroids uten å forstyrre deres struktur.
- For hver tilstand, Pool minimum 12, ideelt 18-24 spheroids (avhengig av spheroid størrelse) i en 1,5 mL Tube (unngå 2 mL rør, som de neste trinnene vil bli vanskeligere på grunn av deres mindre spisse bunnen).
Merk: Hvis mengden av medium overstiger 1,5 mL før de har samlet alle spheroids, la de innsamlede spheroids bosette seg på bunnen (skjer svært raskt, sentrifugering ikke nødvendig) og kaste halve volumet av røret før du fortsetter å samle gjenværende spheroids. - Plasser rørene på is og la spheroids bosette seg på bunnen av 1,5 mL røret.
- Beveg deg fra det sterile celle laboratoriet til det vanlige laboratoriet.
- Vask spheroids to ganger i 1 mL iskaldt 1x PBS. La spheroids bosette seg før du fjerner 1x PBS mellom hvert vasketrinn.
- Aspirer så mye 1x PBS som mulig uten å forstyrre eller fjerne spheroids.
- Tilsett 5 μL av oppvarmet lyseringsbuffer (LB) med fosfatase-og protease hemmere, per spheroid (f.eks. 10 spheroids = 50 μL LB).
- Gjenta intervaller på Vortex etterfulgt av spinn ned til spheroids er oppløst. Utfør en syklus av virvlingen for 30 s etterfulgt av sentrifugering (en rask spinn ved hjelp av en tabletop sentrifuge er tilstrekkelig) for 10 s for ca. 5-10 min, avhengig av størrelsen og kompakt av spheroids.
Merk: Protokollen kan stanses midlertidig her. Hold lysater ved-20 ° c til du fortsetter med sonikering, homogenisering og protein bestemmelse som i en standard 2D protein lysat protokoll, etterfulgt av vestlige blotting bruker standardprotokoller.
5. Propidium iodide (PI) farging av Spheroids
- Sett opp 3-6 spheroids per ønsket tilstand som beskrevet i 1,2 eller 1,3 og plasser i inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 og 95% fuktighet.
- I et sterilt cellekultur laboratorium kan du varme 1x PBS til 37 ° c.
- Lag en PI-løsning på 4 μM ved å fortynne lager løsningen i 1x PBS: fortynne en 1 mg/mL vandig lager av PI 1:350 i 1x PBS.
Merk: Denne konsentrasjonen vil bli ytterligere halvert ved tilsetning av oppløsningen til brønnene som gir en endelig konsentrasjon på 2 μM. 100 μL av denne løsningen er nødvendig for hver brønn som inneholder en spheroid.
Forsiktig: Propidium iodide (PI) må håndteres i en avtrekksvifte og ha på seg hansker. PI er lysfølsom. Beskyttes mot lys ved håndtering. - Fjern 100 μL av mediet fra hver brønn i 96-brønn platen uten å fjerne spheroids.
- Vask ut det resterende mediet ved å tilsette 100 μL av oppvarmet 1x PBS til alle brønner etterfulgt av å fjerne 100 μL av væsken i brønnene. Gjenta dette vaske trinnet 3 ganger.
- Tilsett 100 μL av PI-løsningen på hver brønn, dekkplaten i aluminiumsfolie og legg den i en inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 og 95% fuktighet i 10-15 min.
- Gjenta de 3 vaske trinnene som er beskrevet i 4,5 for å vaske ut PI-løsningen, for å redusere bakgrunns signalet ved bildebehandling.
- Bruk et epifluorescence mikroskop for å avbilde spheroids. For å evaluere levedyktigheten til cellene i den spheroid kjernen, ta z-stabler for å få bilder med varierende dybder i spheroid.
Merk: En skritt størrelse rundt 18-35 μm mellom hver skive avhengig av spheroid størrelse er tilrådelig, noe som gir ca 11-18 stabler per spheroid. Z-stabler kan behandles i ImageJ ved hjelp av z-projeksjon funksjon, som kan kombinere alle z-stabler i ett siste bilde, noe som gir en oversikt over flekker gjennom hele spheroid (for ytterligere retningslinjer om bruk av ImageJ for dette formålet, se (https://imagej.net/Z-functions).
6. innebygging av 3D-Spheroids
-
Forbered agarose gel der spheroids er innebygd (kun nødvendig første gang å utføre protokollen).
- Bland 1 g bactoagar i 50 mL ddH2O.
- Varm langsomt i mikrobølgeovnen til bactoagar er oppløst og en homogen gel har dannet. Ikke la gelen koke.
- Hold bactoagar varm i et vannbad ved 60 ° c.
- Oppbevares ved 4 ° c mellom eksperimenter.
-
Innebygging av spheroids.
- På dag 1, for hver tilstand, Pool minimum 12 spheroids i en 1,5 mL tube.
- Vask én gang med 1 mL iskald 1x PBS.
- For å fikse spheroids, tilsett 1 mL 4% paraformaldehyde.
Merk: Håndtering av paraformaldehyde skal utføres i en avtrekksvifte. - La dem ruge for 24 timer på RT.
- På dag 2, varme agarose gel forsiktig ved å plassere den i et vann fylt beger i en mikrobølgeovn. Sørg for at gelen ikke koke! Oppbevares varmt i en stasjonære varmeplate ved 60 ° c til bruk.
- Vask spheroids to ganger med 1 mL iskald 1x PBS.
- Aspirer mesteparten av 1x PBS (som etterlater ca 100 μL på dette punktet er praktisk for håndtering av spheroids).
- Forbered en 20 μL pipette ved å kutte dråpe spissen ved en helling for å få en pointier tupp med et større hull (se illustrasjon).
Merk: Den neste delen må gjøres raskt for å sikre optimal spheroid overføring og for å unngå herding av gel drop. Hvis ingen oppvarming blokk er tilgjengelig, er det anbefalt å først fange spheroids og deretter gjøre agarose drop (dvs. bytte rekkefølgen av punktene 6.2.9 og 6.2.10). - Lag en agarose gel dråpe på et mikroskop lysbilde. Plasser raset på en varm varme blokk for å hindre agarose fra solidifying.
- Bruk den modifiserte dråpe spissen (se 6.2.8), og Fang så mange spheroids som mulig i et volum på 15-20 μL.
- Injiser forsiktig 15-20 μL spheroid-inneholdende 1x PBS inn i midten av agarose gel drop uten å berøre mikroskopet lysbildet.
Merk: Dette er en litt vanskelig punkt. Spheroids går tapt hvis pipette spissen berører mikroskopet lysbildet når injisere spheroids inn i gel drop. Det er tilrådelig å praktisere hele prosessen med å gjøre agarose slipp og injisere spheroids ved å injisere en farget væske inn i drop. Dette vil tillate visualisering av en potensiell penetrasjon gjennom drop, som den fargede væsken vil lekke ut på lysbildet. - La det agarose gel drop herde av incubating for 5-10 min ved RT eller ved 4 ° c. Når gel drop har befestet noe (men er fortsatt ganske myk), forsiktig Skyv gel drop fra mikroskopet lysbildet i en plast vev kassett med en skalpell.
- Dekk til plast vevet kassetter i 70% etanol.
Merk: På dette punktet spheroids kan brukes direkte eller lagret i månedsvis. - Embed den agarose-embedded spheroid i parafin, del i 2-3 μm tykt lag lysbilder og beis med hematoksylin og eosin eller utsatt for Immuno-histologiske farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spheroid vekst analyser basert på den spheroid formasjon protokollen skjematisk illustrert i figur 1A og figur 1B, ble brukt som et utgangspunkt for analyse av virkningene av anti-kreft narkotika behandlinger i en 3D svulst innstilling. Den enkle som spheroids dannes er cellelinje spesifikke, og noen cellelinjer krever tilskudd med rBM for å danne sammenhengende spheroids22. Konsentrasjonen av rBM lagt kan dypt påvirke morfologi av spheroids. Som vist i figur 1C og figur 1D, vil varierende konsentrasjon av rBM mellom 0 og 4% gjøre spheroids kompakt og morfologi i en celle type avhengig måte. Figur 1 C demonstrerer hvordan tillegg av opptil 2,5% rBM tillater spheroid dannelse i SKBr-3 brystkreftceller, uten ytterligere effekt ved konsentrasjoner over 2,5% rBM. I kontrast, BxPC3 bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) celler, som viser en epitel morfologi, spontant form små, kompakte spheroids (figur 1D, øvre, venstre panel). I denne celle type, øker rBM konsentrasjon til 1,5% eller over utløser en distinkt morfologiske endring fra spheroid til mer convoluted strukturer med utstikkende og invaginations, minner om ductal rørformede struktur formasjon. Omvendt, tillegg av rBM til to andre PDAC cellelinjer, MiaPaCa og Panc-1, som har en mer mesenchymal fenotype, tillater løs mobilnettet aggregater for å bli strammere og danne mer kompakt spheroids (figur 1D, midtre og nedre paneler). Disse resultatene viser at den nøyaktige mengden av rBM resulterer i optimal spheroid formasjon må titrert for hver cellelinje og tilstand.
En kvantitativ vurdering av celle levedyktighet innen spheroids ved behandling av narkotika var nødvendig for å evaluere effekten av anti-kreft narkotika behandlinger. Analysen er beskrevet her er en luciferin-luciferase-basert analyse, som måler ATP løslatt fra levende celler innen spheroids. Prinsippet for analysen er illustrert i figur 2A. Den selvlysende signal som genereres i denne analysen er lett registreres av en plate leser (figur 2a) og relaterer godt med levedyktighet målt ved andre metoder23. Den lineære relasjonen mellom ATP-konsentrasjon og luminescence i det relevante konsentrasjons området er vist i figur 2B, mens figur 2C viser evnen til analysen til å vurdere celle død i 3D-spheroids behandlet med anti-kreft terapi. For å ytterligere evaluere linearitet av analysen i det aktuelle området, eksperimenter for å etablere standard kurver av selvlysende signal som en funksjon av antall celler ble utført (figur 2D og figur 2E ). Disse resultatene tyder på at analysen er egnet for å estimere celle levedyktighet i 3D-spheroid kulturer og at det er aktuelt for å undersøke narkotikaindusert tap av celle levedyktighet.
En kombinasjon av lys mikroskopiske bilder ervervet hver to til tre dager, i løpet av behandlingsperioden og en endelig kvantitativ vurdering av celle levedyktighet gir tett oppsyn av spheroid vekst og morfologi samt vurdering av optimal behandling Dose. Sistnevnte er et eksempel på Figur 3A og Figur 3B, hvor en dose-Response eksperiment ble utført for å fastslå den dosen som er nødvendig for 50% redusert celle levedyktighet i MDA-MB-231 brystkreft spheroids. Behandlingseffekter på spheroid morfologi er visualisere i Figur 3C og Figur 3D for MDA-MB-231 og MCF-7 spheroids, henholdsvis. Under behandling med den valgte kjemoterapeutiske cocktail, øker den kompakt av MDA-MB-231 spheroids, mens under behandling med Tamoxifen, MCF-7 spheroids blitt stadig slitt og ujevn. I begge tilfeller er et klart fall i celle levedyktighet synlig etter 7 (MDA-MB-231) eller 9 (MCF) dager med behandling (Figur 3E og Figur 3F). Dette demonstrerer behovet for både en visuell og en kvantitativ vurdering av behandlings-mediert effekter på spheroid celle levedyktighet og morfologi, samt at disse parametrene er svært celle-og behandling-type spesifikke.
Som et supplement til cellen levedyktighet analysen, farging av døde celler med PI, som ikke kan krysse membranen og derfor bare flekker nekrotisk eller sent apoptotisk celler med kompromittert membran integritet, åpner for en rask romlig evaluering av døde celler i respons på behandling, uten den tidkrevende protokoll for innebygging, snitting og IHC. Som illustrert i Figur 4A den romlige arrangement av døde celler på en økende konsentrasjon av en hemmer, i dette tilfellet, det na+/H+ veksler 1 (NHE1) inhibitor 5-(N-etanol-N-isopropylalkohol)-amilorid (EIPA), kan være Visualisert. Som sett, kontroll spheroids viser en begrenset nekrotisk/sen apoptotisk kjerne, mens de døde cellene er fordelt over hele spheroid som konsentrasjonen av EIPA økes.
For å kvantifisere den relative induksjon av apoptotisk stress etter ulike behandlinger, spheroids ble lysert og utsatt for SDS-side gel elektroforese og vestlige blotting for full lengde og kløyvde Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). Representative resultater er vist i Figur 4B og Figur 4C. I dette eksperimentet ble spheroids fremstilt fra MDA-MB-231 celler der melkesyre-Proton cotransporter MCT4 eller na+, HCO3- cotransporter NBCn1 ble slått ned med siRNA. Knockdown ble evaluert av vestlige blotting for MCT4 og NBCn1 (upubliserte data). Som sett, knockdown av MCT4, men ikke av NBCn1, robust øker PARP kløft, i samsvar med vår forrige demonstrasjon at stabile knockdown av MCT4 i MDA-MB-231 celler reduserer tumor vekst i vivo24.
For ytterligere å analysere virkningene av behandlingen og innhente informasjon om de spesifikke signalering-, vekst arrestasjon, og død trasé aktivert, kan spheroids i tillegg til Western Blot analyse bygges og utsettes for immunhistokjemi (IHC) analyse. IHC analyse av spheroid seksjoner tillater bruk av spesifikke antistoffer eller markører for celle spredning, celle syklus og programmert celle død, og forenkler en visualisering av den romlige arrangement av proliferativ og apoptotisk celler i spheroid.
En skjematisk figur av bygge protokollen for IHC analyse av spheroids er presentert i figur 5A. En representativ lys mikroskopisk bilde av en ca. 3 μm tykke mikrotomen delen av en innebygd spheroid er vist i figur 5B, og en immunofluorescence bilde av en spheroid beiset for tumor Suppressor protein p53 (kjerner farget med DAPI), vises som figur 5C. Eksempler på DMSO og kjemoterapi-behandlet spheroids beiset for cellen spredning markør KI-67 eller for p53 er vist i figur 5D og figur 5E, henholdsvis. I samsvar med den antiproliferative effekten av kjemoterapi behandling, antall KI-67 positive celler er større i DMSO-kontroll enn i kjemoterapi-behandlet spheroid (figur 5D). I kontrast p53 uttrykket økes under forhold av celle stress, apoptose og vekst arrest, og følgelig er antall p53-fargede celler vesentlig høyere i kjemoterapi-behandlet spheroids sammenlignet med DMSO-kontroller (figur 5 E).
Disse resultatene illustrerer eksempler på hvordan romlig løses (PI farging, IHC) eller kvantitativ (vestlig blotting) informasjon om behandling effekter i 3D spheroids kan fås.
Figur 1 : Spontan og rBM-mediert spheroid formasjon. (A) skjematisk fremstilling av spheroid formasjon ved hjelp av ultra-lav vedlegg 96-vel runde bunnplater, med valgfri bruk av rBM. Enkelt trinn preget av (i-III). (B) skjematisk fremstilling av spheroid formasjon ved hjelp av hengende dråpe metoden. Individuelle trinn er preget av (i-III) (C) representative bilder av rBM-mediert spheroid dannelse av SKBr-3 celler. Celler ble sådd i ultra-lav vedlegg 96-godt runde bunnplater med økende konsentrasjoner av rBM og vokst i 9 dager. Skala bar 100 μm. (n = 3). (D) representative bilder av BxPC-3, MiaPaCa og Panc-1-celler seeded for spheroid dannelse i ultra-lav vedlegg 96-vel runde bunnplater med konsentrasjoner av rBM fra 0,5-2,5%. Spheroids ble dyrket i 4 dager. Scale bar = 250 μm. (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Prinsipp og evaluering av celle levedyktighet analysen. (A) skjematisk fremstilling av 3D-cellen levedyktighet analysen. Enkelt trinn betegnet av (i-IV). (B) selvlysende signal som en funksjon av ATP-konsentrasjon. Fortynninger av ATP ble belagt i en 96-brønn plate og celle levedyktighet reagens lagt til hver brønn. Luminescence ble innspilt etter 30 min ved 405 NM. 1 n. (C) levedyktighet, målt som luminescence, av kontroll og kjemoterapi-behandlet MCF-7 spheroids. MCF-7 celler ble sådd i Ultra-Low vedlegg runde-Bottom plater og ble dyrket i 7 dager. Kjemoterapi behandling (5 μM Cisplatin, 5 μM doksorubicin og 30 nM 5-FU) ble brukt på dag 2 og 4. Barer representerer gjennomsnittet verdier med SD. 1 n. (D) selvlysende signal som funksjon av antall MCF-7 celler seeded. MCF-7 celler ble sådd i 96-brønn plater ved angitt celle nummer og lov til å vokse for 48 h, etter som celle levedyktighet ble målt. Feilfelt representerer SD. 1 n. (E) som beskrevet i D for MDA-MB-231-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Effekter av behandlingsregimer på spheroid morfologi og celle levedyktighet. (A) representative bilder av MDA-MB-231 spheroids på dag 2, 4 og 7. MDA-MB-231 celler ble sådd i ultra-lav vedlegg runde bunnen 96-brønn plater. Behandling med økende doser kjemoterapi ble startet på dag 2, da alle spheroids var av samme størrelse. Rader viser spheroids ved økende doser av kjemoterapi, og kolonnene viser spheroids representative for størrelsen på dag 2, 4 og 7 ved den angitte dosen. Den laveste dosen var 18,75 nM Cisplatin, 18,75 nM doksorubicin, 0,0625 nM 5-Fluorouracil (5-FU) og denne dosen ble doblet for hvert bilde som vises, noe som resulterer i en maksimal dose på 0,3 μM Cisplatin, 0,3 μM doksorubicin og 2 nM 5-FU. Scale bar = 100 μm. (2 n). (B) levedyktigheten til MDA-MB-231 spheroids, målt som luminescence, etter 7 dager med kjemoterapeutiske behandling. Stolpene representerer middelverdier med SEM. 2 n. (c, D) representative bilder av MDA-MB-231 (c) og MCF-7 spheroids (D) på dag 2, 4, 7 og for MCF-7 spheroids 9. Celler seeded som i (A) og behandlet med enten kjemoterapi (kjemoterapi, 18,75 NM Cisplatin, 18,75 NM doksorubicin, 0,0625 NM 5-Fu) på dag 2 og 4 (C) eller med 2 μM Tamoxifen (TAM) på dag 2, 4 og 7 (D). Scale bar = 100 μm. (4 n og 3 n), henholdsvis. (E, F) Levedyktighet, målt som luminescence, på dag 7 og 9 for (C) og (D), henholdsvis. For å teste for statistisk signifikant forskjell mellom vilkårene for en student t-test ble utført. betegner p < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Propidium iodide farging og Western Blot analyse av spheroids. (A) representative bilder av PI-beiset MCF-7 spheroids etter 9 dagers behandling. MCF-7 celler ble sådd i ultra-lav vedlegg 96-brønn plater vokst i 9 dager og behandlet med økende konsentrasjoner av EIPA på dag 2, 4 og 7. På dag 9, ble spheroids farget med PI og bilder ble kjøpt på en epifluorescence mikroskop. Scale bar = 200 μm. (1 n.) (B) representant vestlige BLOTS av MDA-MB-231 celler etter knockout/knockdown av syre-base transportører. NHE1 ble slått ut av CRISPR/Cas9 i MDA-MB-231 celler 12 og cellene ble senere midlertidig transfekterte med SIRNA mot MCT4 eller NBCn1, og vokst som spheroids i 9 dager før de ble lysert og utsatt for vestlig blotting ved hjelp av et antistoff gjenkjenne total og kløyvde (c) PARP. (C) kvantifisering av forholdet mellom CPARP til PARP protein nivå, normalisert til lasting kontroll (β-utgangen). (1 n). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Festing, innebygging og immunhistokjemi analyse av spheroids. (A) skjematisk representasjon av protokollen for innebygging av spheroids. Enkelt trinn er merket som (i-VII). (B) bilde av embedded MDA-MB-231 spheroid. Scale bar: 50 μm. (C) representativt bilde av kjemoterapi-behandlet MDA-MB-231 spheroid utsatt for IHC analyse med antistoffer mot p-53. Stiplede linjer viser omkretsen av spheroid. Skala bar = 20 μm. (D, E) representative bilder av DMSO-eller kjemoterapi-behandlet (øvre og nedre paneler, HENHOLDSVIS) MDA-MB-231 spheroids. MDA-MB-231 celler ble sådd i Ultra-Low vedlegg 96-brønn plater, dyrket i 7 dager og behandlet med kjemoterapi på dag 2 og 4. På dag 7 ble spheroids integrert etterfulgt av analyse av IHC med primære antistoffer mot KI-67 (D) og P53 (E). Hvite bokser representerer zoom bilder. Scale bar = 20 μm i begge forstørrelser, (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av 3D kreftcelle spheroids har vist en verdifull og allsidig verktøy ikke bare for anticancer narkotika screening, men også for å få mekanistisk innsikt i regulering av kreftcelledød og levedyktighet under forhold etterligne de i svulsten mikromiljøet. Dette er spesielt viktig ettersom tilgjengeligheten, mobil opptaket og intracellulære effekter av kjemoterapeutiske legemidler er dypt påvirket av de fysikalsk-kjemiske forholdene i svulsten, inkludert pH, oksygen spenninger, tortuosity og fysiske og kjemisk celle-celle interaksjoner9,17. For eksempel, Surhet av ekstracellulære pH, som kan nå verdier så lavt som 6-6.5 i mange solide svulster25,26,27,28,29, forårsaker svakt grunnleggende kjemoterapeutiske forbindelser, slik som doksorubicin, mitoksantron og zwitterion paklitaksel, som skal lades. Dette reduserer deres opptak i tumorceller og kan påvirke aktiviteten til multidrug resistens proteiner som p-glykoprotein30,31,32. Også celle spredning, som er avgjørende for effekten av de fleste kjemoterapeutiske forbindelser, er generelt redusert i 3D sammenlignet med 2D forhold og dermed er sannsynligvis bedre etterlignet i tumor spheroids enn i 2D cellekultur8,33 ,34. Til slutt, den tette tumor mikromiljøet er opprinnelsen til mange fysiske og løselig signalering signaler regi intracellulære signalering trasé regulere cellevekst, overlevelse og død. Dermed, når analysere narkotika effekt, 3D kultur systemer er et avgjørende skritt før du tar fatt på in vivo modeller. En stor ulempe med 3D-kulturen er imidlertid den økte kompleksiteten i analysen sammenlignet med 2D-kulturen. Vi har beskrevet her enkle og relativt rimelige teknikker for spheroid formasjon ved hjelp av en rekke kreftcelle typer. Vi har vist eksempler på hvordan spheroid formasjon må optimaliseres for hver celle type studert og har beskrevet hvordan du skaffer kvantitative data på celle levedyktighet, celle død, og tilhørende signalnettverk trasé, i slike spheroids. Det er ingen åpenbar vekst-eller morfologiske forskjeller mellom de tre modellene som er beskrevet her. I våre hender, variasjonen i morfologi kan være litt større ved hjelp av hengende dråpe metoden, men en fordel med denne metoden er at rBM ikke er nødvendig. Vi har fokusert her på spheroids produsert fra en enkelt kreftcelle type. Den spheroid modellen er imidlertid også mottagelig for co-kultur, for eksempel av kreftceller med fibroblaster, monocytter/makrofager, endothelial celler, og/eller adipocytter35,36,37. Andre avanserte anvendelser av denne modellen inkluderer kombinasjonen med 3D trykt fluidic innretninger som tillater dosering gjennom en semipermeable membran, etterfulgt av høsting for kvantitative Proteomikk profilering38.
Stund, idet bemerket over, fenotype av celler voksen inne 3D spheroids vanligvis etterligner det av inne vivo svulst mange bedre enn gjøre celler voksen inne 2D, i hvilken grad slik spheroids er faktisk relevant modeller av det tilsvarende inne vivo svulst er avhengig opp på tallrik faktorer og må vurderes nøye. Parametre som vil påvirke hvor godt slike spheroids etterligne in vivo tilstand inkluderer cellulære sammensetningen av svulsten og dens relative ECM sammensetning. For eksempel, den rBM som vi har ansatt som ECM i protokollene gitt her er et godt valg for å etterligne tidlige stadier av epitel kreft, rundt tidspunktet for brudd på kjeller membranen, vil andre ECM komposisjoner være mer relevant for visse tumor typer og-stadier. Videre er kapasiteten for celle-celle vedheft varierer mye mellom kreftcelle linjer, avhengig av deres uttrykk for celle-celle og celle-matrise vedheft proteiner som cadherins og integrins22.
Som beskrevet her, spheroid vekst og morfologi kan lett og ikke-invasivt overvåkes hver 2-3 dager ved hjelp av en lys mikroskop med lav forstørrelse optikk og et stort synsfelt. Men fordi cytotoksisk stress, slik som kjemoterapi behandling, påvirker spheroid morfologi veldig annerledes, og på en måte, avhengig av celle type og behandling ordningen, er det ikke nok å stole på morfologi og omkrets alene for å evaluere behandlingseffekt. For eksempel, spheroids kanskje bli løsere med handling og Emerging cellen død, eller alle død kanskje finnes inne nekrotisk kjernen, stund overflaten er ikke detectably berørt. I begge tilfeller kan resultatet bli et feilaktig inntrykk av at antall aktive celler i spheroid ikke reduseres ved behandlingen. Kvantitative og spheroid teknikker er derfor nødvendige for å evaluere behandlingseffekten. For kvantitativ evaluering av celle død, er syre fosfatase analysen, som som navnet antyder at aktiviteten til cytosolic acid fosfatase er ansatt21. Men i våre hender, mens denne analysen generelt pent reflekterer antall celler seeded, betyr det ikke tilstrekkelig fange rask behandling-indusert celle død (data ikke vist), sannsynligvis fordi syren fosfatase forblir aktiv i noen tid etter celle død. Videre krever denne analysen fullstendig fjerning av mediet, noe som øker feil, spesielt med skjøre, kjemoterapi-behandlet spheroids. Cellen levedyktighet analysen beskrevet her, som er basert på mobilnettet ATP innhold, ble valgt basert på dens enkle og tid effektive protokollen og høy reproduserbarhet. Videre denne analysen ikke krever fullstendig fjerning av kultur medium som er en fordel når du arbeider med spheroids. Som vist i representative resultater, registrerer denne analysen godt både celle nummer og forventet kjemoterapi behandlingseffekter. Imidlertid er en fallgruve av denne teknikken, selvsagt, at metabolske endringer redusere intracellulære ATP innhold kan feilaktig bli registrert som et lavere celle tall. Derfor er parallell vurdering av spheroid volum og morfologi, eller PI farging, tilrådelig å validere resultatene.
Spheroid lyse etterfulgt av vestlige blotting kan gi semi-kvantitativ innsikt i tilstanden i signalering prosesser, celle død-, vekst-og levedyktighet trasé. Bruken av vestlige blotting er komplisert når rBM brukes til å forberede spheroids, siden dette vil utgjøre en betydelig brøkdel av lysat proteininnhold, og enda viktigere, vil dens brøk bidrag øke med synkende mobilnettet innhold under kjemoterapeutiske celle død. Det er i prinsippet mulig å fjerne rBM ved sentrifugering; Dette er imidlertid et kritisk trinn, da det er vanskelig å fjerne alle rBM fullstendig, og dette vil utelukke kvantitativ sammenligning mellom betingelsene. For slike spheroids, og generelt for romlig løst vurdering av død trasé og relevante signalering parametre, embedding og IHC er sterke verktøy. Andre tilnærminger kan vurderes: Live konfokalmikroskopi Imaging av (relativt liten) intakt spheroids39. En annen interessant egenskap av spheroids er at gitt deres ganske vanlig "ball" form, egner de seg godt til gjentakelse mellom matematiske modellering og våt Lab eksperimenter, for å øke forståelsen av viktigheten av de nevnte graderinger av oksygen, pH og næringsstoffer innen spheroids, og ved ekstrapolering, svulster40,41. Dermed, selv om viktige 3D svulst modeller av mye større kompleksitet er nye, inkludert et bredt spekter av organotypic og organoid kulturer basert på komplekse biologiske så vel som inert stillaser, og ikke minst, pasient-avledet xenotransplantater42, spheroids er fortsatt et viktig verktøy på grunn av sin overlegne biologiske relevans sammenlignet med 2D-kultur, kombinert med relativ enkel håndtering.
Oppsummert presenterer vi her en rekke enkle metoder for analyse av anti-kreft behandling-indusert endringer i kreftcelle levedyktighet og død i 3D-kultur. Sammensetningen av spheroids kan endres avhengig av egenskapene og biologi av cellene ansatt, og de kvantitative og kvalitative analysene som presenteres er nyttige både for å vurdere dose-respons relasjoner og for å få innsikt i signalering-og død trasé involvert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Katrine Franklin Markus og Annette Bartels for utmerket teknisk assistanse og til Asbjørn Nøhr-Nielsen for å utføre eksperimentene i figur 1D. Dette arbeidet ble finansiert av Einar Willumsen-stiftelsen, Novo nordisk Foundation, og Fondation Juchum (alle til SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
