Summary
Hier presenteren we een aantal eenvoudige methoden voor de evaluatie van de levensvatbaarheid en de dood in 3D kanker cel sferoïden, die de fysisch-chemische gradiënten van in vivo tumoren veel beter dan de 2D-cultuur na te bootsen. Het sferoïde model maakt het dus mogelijk om de effectiviteit van kanker medicijnen te evalueren met een verbeterde vertaling naar in vivo omstandigheden.
Abstract
Driedimensionale sferoïden van kankercellen zijn belangrijke hulpmiddelen voor beide kanker geneesmiddelen schermen en voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in kanker celbiologie. De kracht van deze voorbereiding ligt in zijn vermogen om te imiteren vele aspecten van de in vivo voorwaarden van tumoren terwijl ze snel, goedkoop, en veelzijdig genoeg om relatief high-throughput screening mogelijk te maken. De sferoïde cultuuromstandigheden kunnen recapituleren de fysisch-chemische gradiënten in een tumor, met inbegrip van de toenemende extracellulaire zuurgraad, verhoogde lactaat, en het verminderen van glucose en zuurstof beschikbaarheid, van de sferoïde periferie aan zijn kern. Ook de mechanische eigenschappen en cel-cel interacties van in vivo tumoren zijn deels nagebootst door dit model. De specifieke eigenschappen en bijgevolg de optimale groeiomstandigheden, van 3D sferoïden, verschillen sterk tussen verschillende soorten kankercellen. Voorts vereist de beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen en de dood in 3D sferoïden methodes die gedeeltelijk van die voor 2D culturen verschillen. Hier beschrijven we verschillende protocollen voor de voorbereiding van 3D sferoïden van kankercellen, en voor het gebruik van dergelijke culturen om de levensvatbaarheid van cellen en de dood te beoordelen in het kader van de evaluatie van de effectiviteit van antikanker
Introduction
Het gebruik van multicellulaire sferoïde modellen in de Kankerbiologie is een aantal decennia oud1,2, maar heeft aanzienlijke dynamiek opgedaan in de afgelopen jaren. Voor een groot deel weerspiegelt dit meer besef hoe sterk het fenotype van kankercellen afhankelijk is van hun micromilieu en specifieke groeiomstandigheden. De micromilieu in vaste tumoren is fundamenteel verschillend van dat in overeenkomstige normale weefsels. Dit omvat fysisch-chemische voorwaarden zoals pH, zuurstof spanning, evenals interstitiële druk, concentratie gradiënten van oplosbare factoren zoals voedingsmiddelen, afvalproducten, en afgescheiden signalerende samenstellingen (groeifactoren, cytokines). Bovendien omvat het de organisatie van de extracellulaire matrix (ECM), cel-cel interacties en intercellulaire signalering, en andere aspecten van de bijzondere drie-dimensionale (3D) architectuur van de tumor3,4, 5,6. De specifieke microecologische omstandigheden waarin kankercellen bestaan, hebben een diepgaande invloed op hun genexpressie profiel en functionele eigenschappen, en het is duidelijk dat, vergeleken met die van cellen gekweekt in 2D, het fenotype van 3D sferoïden veel nauwer nabootst die van in vivo tumoren7, 8,9,10,11. 2D-modellen, zelfs als ze in dienst hypoxie, zure pH, en hoge lactaat concentraties om na te bootsen bekende aspecten van de tumor micromilieu, nog steeds niet aan de gradiënten van de fysisch-chemische parameters die ontstaan binnen tumoren, evenals hun 3D-tumor vast te leggen Architectuur. Aan de andere kant, dierlijke modellen zijn kostbaar, traag en ethisch problematisch, en in het algemeen, hebben ook tekortkomingen in hun vermogen om de menselijke tumor voorwaarden recapituleren. Bijgevolg zijn 3D sferoïden toegepast als een intermediair complexiteits model in studies van een breed scala van eigenschappen van de meeste vaste kankers9,11,12,13, 14,15,16,17.
Een veelgebruikt gebruik van 3D sferoïden is in screening assays van kankertherapie werkzaamheid9,18,19,20. De reacties van de behandeling zijn bijzonder gevoelig voor de tumor microenvironment, die zowel de invloed van de tortuosity, de beperkte verspreiding, de hoge interstitiële druk, als zure milieu pH op druglevering weerspiegelt, en de invloed van hypoxie en andere aspecten van het micromilieu op de reactie van de celdood9,17. Omdat het milieu binnen 3D sferoïden inherent al deze eigenschappen7,8,9,10,11ontwikkelt, kan het tewerkstellen van 3D cel culturen aanzienlijk verbeteren van de vertaling van de resultaten in vivo omstandigheden, maar toch een efficiënte en betaalbare high-throughput screening van de netto-groei mogelijk te maken. Echter, de grote meerderheid van de studies over de drug Response van kankercellen worden nog steeds uitgevoerd onder 2D-omstandigheden. Dit waarschijnlijk weerspiegelt dat, terwijl sommige analyses kunnen relatief gemakkelijk worden geïmplementeerd voor 3D-cel culturen, veel, zoals levensvatbaarheid assays, West-bevlekken, en immunofluorescentie analyse, zijn veel handiger gedaan in 2D dan in 3D.
Het doel van het huidige werk is het verstrekken van gemakkelijk vatbaar analyses en precieze protocollen voor analyses van het effect van de behandeling met anti-kanker medicijnen op kankercellen levensvatbaarheid en overleving in een 3D-tumor nabootsen instelling. Concreet, bieden en vergelijken we drie verschillende methoden voor sferoïde vorming, gevolgd door methoden voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van groei, levensvatbaarheid en drug Response.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generatie van Sferoïden
- Het voorbereiden van cel opschortingen voor sferoïde vorming
Nota: de verschillende cel lijnen hebben zeer verschillende adhesie eigenschappen en het geschiktste sferoïde vorming protocol moet in elk geval worden gevestigd. Wij hebben geconstateerd dat MCF-7 en BxPC-3 cellen voor spontane sferoïde vorming geschikt zijn, terwijl MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 en MiaPaCa de toevoeging van opnieuw samengesteld kelder membraan vereisen om met succes sferoïden te vormen. Alleen MDA-MB-231 en BxPC-3 cellen zijn aangewend voor de opknoping drop protocol, maar andere cel lijnen zijn zeker van toepassing.- Grow cellen als monolayer tot 70-80% confluentie.
- Was cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS, 5 mL voor een 25 cm2 of 10 ml voor een kolf van 75 cm2 ), voeg de cel dissociatie enzym (0,5 ml voor een 25 cm2 of 1 ml voor een 75 cm2 kolf) en Incubeer de cellen voor 2-5 min bij 37 °c in 5% CO2 en 95% vochtigheid.
- Controleer de cel detachement onder een microscoop en Neutraliseer de cel dissociatie enzym door toevoeging van groeimedium (6-10% serum afhankelijk van de cel lijn) tot een totaal volume van 5 mL in een 25 cm2 of 10 ml voor een 75 cm2 kolf.
- Gebruik een Bürker kamer om cellen te tellen en 8 vierkanten in de kamer per cel voorbereiding te tellen om een hoge reproduceerbaarheid van de grootte van de sferoïden te verkrijgen.
Opmerking: Drie protocollen die elk een andere methode voor sferoïde vorming beschrijven worden hieronder voorgesteld. Protocol 1,2 en 1,3 kunnen worden gebruikt voor alle volgende analytische protocollen gepresenteerd, terwijl Protocol 1,4 is het meest geschikt voor inbedding en lysate preparaten. Afhankelijk van de cel lijn, sferoïde vorming duurt 2-4 dagen, ongeacht de gebruikte methode.
- Spontane sferoïde vorming
- Voer stappen 1.1.1-1.1.4 uit.
- Verdun de schorsing van de cel in een buis van 15 mL om 0,5-2 x 104 cellen/ml te verkrijgen (de optimale dichtheid van de cellen moet voor elke cel lijn worden bepaald) (Figuur 1a (II)).
- Vul de buitenste ring van putten met 1x PBS of groeimedium om verdamping te verminderen van de resterende putten. Breng de schorsing van de cel over in een steriel reservoir en Doseer met behulp van een multichannel pipet 200 µ L/put in ultra-lage bevestigings 96-goed ronde bodemplaten (Figuur 1a (III)).
- Incubeer de plaat in een incubator bij 37 °C met 5% CO2, 95% vochtigheid.
- Elke 2-3 dagen te verwerven licht microscopische beelden van de sferoïden.
Opmerking: De beelden in deze paper zijn genomen op 11,5 x vergroting, die geschikt is voor de meeste sferoïden bereid met behulp van deze protocollen. - Elke 2-3 dagen (na het verwerven van beelden) vervangen 100 µ L van middel (Verwijder 100 µ L van het bestede middel en vervang met 100 µ L van vers middel.
Opmerking: Om te voorkomen dat het verwijderen van sferoïden bij het vervangen van medium, is het raadzaam om de plaat een beetje kantelen terwijl langzaam het verwijderen van het medium en Inspecteer de aanzuiging medium in de tips voor zichtbare sferoïden voordat u het weggegooid.
- Hervormde kelder membraan-gemedieerde sferoïde vorming.
Opmerking: lactose dehydrogenase verheffende virus (LDEV)-gratis verminderde groeifactor opnieuw samengesteld Basement membraan (rBM) werd gebruikt. rBM is temperatuur-gevoelig en moet altijd worden gehouden op het ijs, want het zal stollen als het bereikt 15 ° c. Ontdooi de rBM op het ijs ofwel 's nachts bij 4 ° c of 2-4 h bij kamertemperatuur (RT) voor plating.- Dooi rBM op ijs (Zie lijst van materialen).
- Houd platen en reservoirs (indien individueel verpakt) op ijs voor gebruik.
- Voer stappen 1.1.1-1.1.4 uit.
- Vul de buitenste ring van putten met 1x PBS of groeimedium om verdamping te verminderen van de resterende putten. Verdun de schorsing van de cel in een buis van 15 mL om 0,5-2 x 104 cellen/ml te verkrijgen (de optimale dichtheid van de cellen moet voor elke cel lijn worden bepaald) (Figuur 1a (II)).
- Plaats de 15 mL buis met de verwaterde cel suspensie op ijs (bijv. in glas beker) (Figuur 1a (IIA)).
- Breng de gekoelde platen en reservoirs naar de kap. Spoel plastic containers, vul ze met ijs en breng ze in de kap zodat de platen en reservoirs worden geplaatst op ijs tijdens de gehele procedure.
- Hersuspendeer rBM voorzichtig om een homogene gel te garanderen.
- Voeg 1-2% rBM (de optimale concentratie moet voor elke cel lijn worden bepaald) aan de gekoelde schorsingen van de cel (Figuur 1a (IIB)).
- Omkeren van de 15 mL buis om de juiste vermenging van rBM en cel schorsing voor de afgifte van de schorsing in de plaat te waarborgen.
- Breng de rBM in een steriel reservoir en verdeel 200 µ L/put in gekoeld ultra-laag gehechtheid 96-goed platen met behulp van een multichannel Pipet (Figuur 1a (III)).
Opmerking: Als het werken met verscheidene cel opschortingen (b.v., meer dan één cel lijn), is het essentieel om elke cel opschorting onmiddellijk na rBM toevoeging te afzien om voorbarige geleer te verhinderen. - Centrifugeer de plaat gedurende 15 min bij 750 x g met ' Soft degelijke '/No-remmen (indien mogelijk Centrifugeer bij 4 °c om de rBM vloeistof langer te houden, maar geen vereiste voor een succesvolle sferoïde vorming), om ervoor te zorgen dat de cellen samen geclusterd worden wanneer de rBM verhardt, faciliteert de vorming van een enkele sferoïde.
- Incubeer de plaat in een incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid).
- Elke 2-3 dagen te verwerven licht microscopische beelden voor de evaluatie van de sferoïde groei.
- Elke 2-3 dagen vervangen 100 µ L van middel (Verwijder 100 µ L en vervang met 100 µ L van vers middel).
- Opknoping drop sferoïden.
- Voer stap 1.1.1-1.1.4 uit.
- Verdun cellen om een geschikte verdunning te verkrijgen. Een praktische verdunning is 50.000 cellen/mL.
- Verwijder het deksel van een 10 cm2 Cell kweekschaal en plaats het zodat het naar boven kijkt. Voeg 6 mL 1x PBS aan de schotel toe (Figuur 1B (i)).
- Giet de cel schorsing in een steriel reservoir en voorzichtig plaats tot 30 druppels van 40 µ L van de cel schorsing op het deksel van de cel cultuur schotel met behulp van een multichannel Pipet (Figuur 1B (II)), wat resulteert in een concentratie van 2.000 cellen/druppel. Vermijd het plaatsen van de druppels te dicht bij de rand van het deksel als deze druppels hebben meer kans op oppervlaktespanning te verliezen bij het omkeren van het deksel in de volgende stap.
- Omkeren het deksel in een snelle maar gecontroleerde beweging en plaats deze op de top van de 1x PBS-bevattende cel cultuur schaal (Figuur 1B (III)).
- Plaats de schotel in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid zonder de dalingen te verstoren en laat hen groeien voor 4-6 dagen.
- Als om te worden gebruikt voor eiwit lysaten of inbedding, zwembad sferoïden door het verwijderen van het deksel en kantelen, om te spoelen de druppels met 1 mL verwarmde medium. Breng het resulterende medium met sferoïden naar een 1,5 mL buis en laat ze zich te vestigen op de bodem van de buis. Ga verder zoals beschreven in 4,4 en 6.2.2 voor proteïne lysaten en inbedding, respectievelijk.
2. medicamenteuze behandeling van Sferoïden
Opmerking: Lange-termijn behandeling van geneesmiddelen kan worden toegepast op de sferoïden om te screenen op effecten van een drug van belang. Alvorens de drugbehandeling in werking te stellen, is het raadzaam om een dosis reactie experiment van de drug (s) uit te voeren, om een aangewezen dosis voor de experimentele behandeling te vinden. De doses moeten worden gebaseerd op de vastgestelde IC50/Ki van de drug en variëren van ongeveer 0,2 x-10x van deze waarde.
- Opstelling 6-12 sferoïden per de gewenste voorwaarde zoals beschreven in 1,2 of 1,3 en plaats in de incubator (37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid) 2 dagen.
- Op dag 2, neem licht microscopische beelden van de sferoïden.
- Bereid de eerste behandel doses (na het verwerven van beelden).
Opmerking: De eerste behandeling concentratie moet tweemaal de gewenste uiteindelijke concentratie als de oplossing zal worden verdund 1:2 op aanvulling op de goed bevattende 100 µ L medium. De voorgestelde intervallen van de drugbehandeling (zullen afhangen van drug Half-Life): dag 2, 4 en 7. - Met behulp van een multichannel Pipet, verwijder voorzichtig 100 µ L van medium en vervang deze door 100 µ L van drugs bevattende medium.
- Plaats de 96-well plaat terug in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid en herhaal 2,3 en 2,4 op de gekozen dagen van de behandeling, maar nu zonder verdubbeling van de dosis om de juiste uiteindelijke dosis te verkrijgen.
- Op de laatste dag van het protocol/behandeling schema, een of meerdere van de volgende tests kunnen worden uitgevoerd.
3. de haalbaarheidsanalyse van de cel voor Sferoïden
- Set up 4-6 sferoïden per de gewenste voorwaarde zoals beschreven in 1,2 of 1,3 en plaats in de incubator bij 37 ° c met 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.
Opmerking: In dit geval werd de bepaling van de levensvatbaarheid van de cellen uitgevoerd op dag 7 of 9, nadat de sferoïde groei om de 2-3 dagen is gecontroleerd door de Lichtmicroscopie zoals hierboven beschreven (punt 1.2.5 en 1.3.13). - Ontdooi de levensvatbaarheid assay reagens (Zie tabel van materialen) en laat het EQUILIBRATE naar RT voorafgaand aan het gebruik.
- Meng voorzichtig door het inverteren van een homogene oplossing te verkrijgen.
- Verwijder vóór het uitvoeren van de assay 50% van het kweekmedium uit de sferoïden (100 µ L).
- Voeg de levensvatbaarheid van de cel aan elk goed op een 1:3 verhouding tot de hoeveelheid medium aanwezig in de put (Figuur 2a (i)) voor een 96-well plaat, voeg 50 µ l van reagens tot 100 µ l van medium.
- Meng de inhoud gedurende 5 minuten krachtig om de cel lysis te induceren (Figuur 2a (II)).
- Incubeer gedurende 25 min bij RT om het lichtgevende signaal te stabiliseren (Figuur 2A (III)).
- Neem het lichtgevende signaal op (Figuur 2a (IV)).
4. het voorbereiden van eiwit lysaten voor het westelijke bevlekken van 3D sferoïde culturen
Opmerking: Bij het verzamelen van de sferoïden is het raadzaam om een P200 pipet te gebruiken en het uiteinde van de tip te knippen om een grotere opening mogelijk te maken en dus een gemakkelijker te vangen van de sferoïden zonder hun structuur te verstoren.
- Voor elke conditie, pool een minimum van 12, idealiter 18-24 sferoïden (afhankelijk van sferoïde grootte) in een 1,5 mL buis (Vermijd 2 mL buizen, als de volgende stappen zal moeilijker geworden als gevolg van hun minder puntige bodem).
Opmerking: Indien de hoeveelheid medium groter is dan 1,5 mL alvorens alle sferoïden te hebben verzameld, laat de verzamelde sferoïden zich op de bodem vestigen (gebeurt zeer snel, centrifugeren niet noodzakelijk) en gooi de helft van het volume van de buis weg voordat u doorgaat met het verzamelen van de resterende sferoïden. - Plaats de tubes op het ijs en laat de sferoïden zich aan de onderzijde van de 1,5 mL Tube vestigen.
- Verplaats van het steriele cel laboratorium naar het reguliere laboratorium.
- Was sferoïden tweemaal in 1 mL ijskoud 1x PBS. Laat sferoïden regelen alvorens 1x PBS tussen elke het wassen stap te verwijderen.
- Aspireren zo veel 1x PBS mogelijk zonder de sferoïden te storen of te verwijderen.
- Voeg 5 µ L van verwarmde lysis buffer (LB) toe met fosfatase-en proteaseremmers, per sferoïde (bijv. 10 sferoïden = 50 µ L LB).
- Herhaal intervallen van Vortex gevolgd door spin-down tot sferoïden worden opgelost. Voer een cyclus van vortexen voor 30 s, gevolgd door centrifuge (een snelle spin met behulp van een tafelblad centrifuge is voldoende) voor 10 s voor ca. 5-10 min, afhankelijk van de grootte en de compactheid van de sferoïden.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Houd de lysaten bij-20 °C tot het te werk gaan met sonication, homogenisering en eiwit bepaling zoals in een standaard 2D proteïne lysate protocol, dat door het westelijke bevlekken wordt gevolgd gebruikend standaardprotocollen.
5. Propidium jodide (PI) kleuring van Sferoïden
- Opstelling 3-6 sferoïden per gewenste voorwaarde zoals beschreven in 1,2 of 1,3 en plaats in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 en 95% vochtigheid.
- In een steriele cel cultuur Lab, warmte 1x PBS tot 37 ° c.
- Maak een PI oplossing van 4 µ M door verdunning voorraad oplossing in 1x PBS: Verdun een 1 mg/mL waterige voorraad van PI 1:350 in 1x PBS.
Opmerking: Deze concentratie zal verder worden gehalveerd bij toevoeging van de oplossing voor de putten met een eindconcentratie van 2 µ M. 100 µ L van deze oplossing is nodig voor elk goed met een sferoïde.
Let op: Propidium jodide (PI) moet worden behandeld in een rook kap en het dragen van handschoenen. PI is lichtgevoelig. Bescherm tegen licht bij het hanteren. - Verwijder 100 µ L van het middel van elk goed in de 96-goed plaat zonder de sferoïden te verwijderen.
- Was het resterende medium door toevoeging van 100 µ L van verwarmde 1x PBS aan alle putten, gevolgd door het verwijderen van 100 µ L van de vloeistof in de putten. Herhaal deze wassen stap 3 keer.
- Voeg 100 µ L van de PI-oplossing voor elk goed, bedek de plaat in aluminiumfolie en plaats deze in een incubator op 37 ° c met 5% CO2 en 95% vochtigheid voor 10-15 min.
- Herhaal de 3 wassen stappen beschreven in 4,5 te wassen uit PI oplossing, met het oog op achtergrond signaal bij beeldvorming te verminderen.
- Gebruik een epifluorescence Microscoop om het beeld van de sferoïden. Om de levensvatbaarheid van cellen in de sferoïde kern te evalueren Neem z-stapels om beelden met variërende diepten van de sferoïde te krijgen.
Opmerking: Een stapgrootte rond 18-35 µm tussen elk segment afhankelijk van sferoïde grootte is raadzaam, het geven van ongeveer 11-18 stacks per sferoïde. Z-stacks kunnen worden verwerkt in ImageJ met behulp van de z-projectiefunctie, die alle z-stacks kan combineren tot een laatste foto, wat een overzicht geeft van de kleuring in de sferoïde (voor verdere richtlijnen over het gebruik van ImageJ voor dit doel, zie (https://imagej.net/Z-functions).
6. inbedding van 3D Sferoïden
-
Bereid de agarose gel waarin de sferoïden zijn ingebed (alleen de noodzakelijke eerste keer het uitvoeren van het Protocol).
- Meng 1 g bactoagar in 50 mL ddH2O.
- Verhit langzaam in microgolfoven tot de bactoagar is opgelost en een homogene gel gevormd. Sta niet toe dat de gel aan de kook.
- Houd de bactoagar warm in een waterbad bij 60 °C.
- Houd bij 4 °C tussen experimenten.
-
Inbedding van sferoïden.
- Op dag 1, voor elke conditie, pool een minimum van 12 sferoïden in een 1,5 mL buis.
- Was eens met 1 mL ijskoud 1x PBS.
- Om de sferoïden te bevestigen, voeg 1 mL van 4% Paraformaldehyde toe.
Opmerking: Behandeling van Paraformaldehyde moet worden uitgevoerd in een rook kap. - Laat ze incuberen voor 24 uur bij RT.
- Op dag 2, Verwarm de agarose gel zorgvuldig door het in een met water gevulde beker in een microgolfoven te plaatsen. Zorg ervoor dat de gel niet kookt! Houd warm in een benchtop verwarmingsplaat, bij 60 °C tot het gebruik.
- Was sferoïden tweemaal met 1 mL ijskoud 1x PBS.
- Aspireren de meeste van de 1x PBS (het verlaten van ongeveer 100 µ L op dit punt is praktisch voor de behandeling van de sferoïden).
- Maak een pipet van 20 µ L door het pipet uiteinde te snijden op een helling om een puntiger punt te verkrijgen met een groter gat (zie illustratie).
Opmerking: Het volgende deel moet snel worden gedaan om een optimale sferoïde overdracht te garanderen en te voorkomen dat stolling van gel te laten vallen. Als geen het verwarmen blok beschikbaar is, wordt het geadviseerd om de sferoïden eerst te vangen en dan de agarose daling (d.w.z., die de orde van punten 6.2.9 en 6.2.10) te schakelen maakt. - Maak een agarose gel druppel op een Microscoop dia. Plaats de dia op een warm verwarmingsblok om agarose te verhinderen te stollen.
- Met behulp van de gemodificeerde pipet tip (zie 6.2.8), vangen zoveel mogelijk sferoïden in een volume van 15-20 µ L.
- Injecteer zorgvuldig 15-20 µ L sferoïde-bevattende 1x PBS in het centrum van de agarose gel daling zonder de Microscoop dia aan te raken.
Opmerking: Dit is een iets moeilijk punt. De sferoïden zal verloren gaan als de pipet Tip de Microscoop schuif raakt bij het injecteren van de sferoïden in de gel druppel. Het is raadzaam om het gehele proces te praktizeren van het maken van de agarose daling en het inspuiten van sferoïden door een gekleurde vloeistof in de daling te injecteren. Dit zal visualisatie van een potentiële penetratie door de daling toestaan, aangezien de gekleurde vloeistof uit op de dia zal lekken. - Laat de agarose gel laten uitharden door te broeden voor 5-10 min bij RT of bij 4 °C. Zodra de gel druppel is enigszins gestold (maar is nog steeds vrij zacht), voorzichtig duw de gel druppel van de Microscoop dia in een plastic tissue cassette met een scalpel.
- Bedek de plastic weefsel cassettes in 70% ethanol.
Opmerking: Op dit punt kan de sferoïden direct worden gebruikt of worden opgeslagen voor maanden. - Embed de agarose-embedded sferoïde in paraffine, sectie in 2-3 µm dikke laag dia's en vlek met hematoxyline en eosine of onderworpen aan de immuun-histologische kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sferoïde groei analyses gebaseerd op het sferoïde formatie protocol schematisch geïllustreerd in Figuur 1A en Figuur 1B, werden gebruikt als uitgangspunt voor de analyse van de effecten van anti-kankerbehandelingen in een 3D tumor nabootsen instelling. Het gemak waarmee sferoïden worden gevormd is specifieke cel lijn, en sommige cel lijnen vereisen aanvulling met rBM om coherente sferoïden22te vormen. De concentratie van rBM toegevoegd kan de morfologie van de sferoïden diepgaand beïnvloeden. Zoals weergegeven in Figuur 1C en Figuur 1D, verandert de concentratie van rBM tussen 0 en 4% de compactheid en de morfologie van de sferoïden in een type cel afhankelijke wijze. Figuur 1 C laat zien hoe de toevoeging van maximaal 2,5% rBM maakt sferoïde vorming in SKBr-3 borstkanker cellen, zonder verder effect bij concentraties boven 2,5% rBM. In tegenstelling, BxPC3 ductale adenocarcinoom (PDAC) cellen, die een epitheel morfologie vertonen, spontaan vorm kleine, compacte sferoïden (Figuur 1D, bovenste, linker paneel). In dit type cel, het verhogen van rBM concentratie tot 1,5% of hoger lokt een duidelijke morfologische verandering van sferoïde naar meer ingewikkelde structuren met uitsteeksels en invaginations, doet denken aan ductaal buisvormige structuurvorming. Omgekeerd, de toevoeging van rBM aan twee andere PDAC cel lijnen, MiaPaCa en Panc-1, die een meer mesenchymale fenotype hebben, laat de losse cellulaire aggregaten te worden strakker en vorm meer compacte sferoïden (Figuur 1D, Midden en lager panelen). Deze resultaten tonen aan dat de precieze hoeveelheid rBM resulteert in een optimale sferoïde vorming moet worden betiteld voor elke cel lijn en conditie.
Een kwantitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen binnen de sferoïden bij medicamenteuze behandeling was noodzakelijk om het effect van anti-kankerbehandelingen te evalueren. De hier beschreven analyse is een luciferin-Luciferase-gebaseerde analyse, die ATP meet die van levende cellen binnen sferoïden wordt vrijgegeven. Het principe van de assay is geïllustreerd in Figuur 2A. Het lichtgevende signaal dat in deze analyse wordt opgewekt, wordt gemakkelijk geregistreerd door een plaat lezer (Figuur 2a) en correleert goed met de levensvatbaarheid gemeten door andere methoden23. De lineaire relatie tussen de ATP-concentratie en de luminescentie in het relevante concentratiebereik wordt weergegeven in Figuur 2B, terwijl Figuur 2C het vermogen van de test toont om de celdood in 3D sferoïden te beoordelen die behandeld zijn met anti-kankertherapie. Om de lineariteit van de assay in het relevante bereik verder te evalueren, werden experimenten om standaard krommen van het lichtgevende signaal vast te stellen als functie van het aantal cellen uitgevoerd (Figuur 2D en Figuur 2E ). Deze resultaten geven aan dat de assay geschikt is voor het schatten van de levensvatbaarheid van cellen in 3D sferoïde culturen en dat het van toepassing is voor onderzoek naar geneesmiddelen geïnduceerde verlies van de levensvatbaarheid van cellen.
Een combinatie van lichte microscopische beelden verworven om de twee tot drie dagen, tijdens de behandelingsperiode en een definitieve kwantitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid van de cel maakt een nauw toezicht op sferoïde groei en morfologie, alsmede de beoordeling van een optimale behandeling Dosis. Deze laatste is geïllustreerd in Figuur 3A en Figuur 3B, waar een dosis-Response experiment werd uitgevoerd om de dosis die nodig is voor 50% verminderde levensvatbaarheid van cellen in MDA-MB-231 borstkanker sferoïden te bepalen. De effecten van de behandeling op sferoïde morfologie worden gevisualiseerd in Figuur 3C en Figuur 3D voor MDA-MB-231 en MCF-7 sferoïden, respectievelijk. Tijdens de behandeling met de gekozen chemotherapeutische cocktail, de compactheid van MDA-MB-231 sferoïden stijgt, terwijl tijdens de behandeling met tamoxifen, MCF-7 sferoïden steeds meer gerafeld en ongelijk. In beide gevallen is een duidelijke daling van de levensvatbaarheid van de cellen zichtbaar na 7 (MDA-MB-231) of 9 (MCF-7) dagen van de behandeling (Figuur 3E en Figuur 3F). Hieruit blijkt de noodzaak van zowel een visuele als een kwantitatieve beoordeling van de behandeling-gemedieerde effecten op sferoïde de levensvatbaarheid van de cellen en de morfologie, alsmede dat deze parameters zijn zeer cel-en behandeling-type specifiek.
Als een aanvulling op de cel levensvatbaarheid Assay, kleuring van dode cellen met PI, die niet kunnen kruisen het membraan en dus alleen vlekken necrotic of laat apoptotic cellen met gecompromitteerd membraan integriteit, zorgt voor een snelle ruimtelijke evaluatie van dode cellen in antwoord op de behandeling, zonder het tijdrovende Protocol van inbedding, sectioneren en IHC. Zoals geïllustreerd in Figuur 4A de ruimtelijke ordening van dode cellen op een stijgende concentratie van een remmer, in dit geval, de na+/H+ Exchanger 1 (NHE1) remmer 5-(N-ethyl-n-isopropylalcohol)-amiloride (EIPA), kan worden Gevisualiseerd. Zoals gezien, de controle sferoïden tonen een beperkte necrotic/late apoptotic kern, terwijl de dode cellen worden verdeeld over de sferoïde als de concentratie van EIPA wordt verhoogd.
Om de relatieve inductie van apoptotic spanning na verschillende behandelingen te kwantificeren, werden sferoïden lysed en werden onderworpen aan sds-pagina de Elektroforese van het gel en het westelijke bevlekken voor volledige lengte en gekloofd poly (ADP-) Polymerase (PARP). Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 4B en Figuur 4C. In dit experiment, sferoïden werden bereid uit MDA-MB-231 cellen waarin de lactaat-Proton cotrans Porter MCT4 of de na+, HCO3- cotrans Porter NBCn1 werden neergehaald met behulp van siRNA. De knock-out werd geëvalueerd door Western bevlekken voor MCT4 en NBCn1 (ongepubliceerde gegevens). Zoals gezien, de knock-out van MCT4, maar niet van NBCn1, robuust verhoogt PARP splitsing, in overeenstemming met onze vorige demonstratie dat stabiele knock-out van MCT4 in MDA-MB-231 cellen vermindert de groei van de tumor in vivo24.
Om verdere analyse van de effecten van de behandeling en het verkrijgen van informatie over de specifieke signalering-, groeiarrestatie, en de dood paden geactiveerd, kan de sferoïden in aanvulling op de westerse vlek analyse worden ingebed en onderworpen aan Immunohistochemistry (IHC) analyse. IHC analyse van de sferoïde secties maakt het gebruik van specifieke antilichamen of markers van cel proliferatie, celcyclus en geprogrammeerde celdood, en vergemakkelijkt een visualisatie van de ruimtelijke ordening van proliferatie-en apoptotic cellen in de sferoïde.
Een schematische figuur van het inbedding protocol voor IHC-analyse van sferoïden wordt gepresenteerd in Figuur 5A. Een representatief licht microscopisch beeld van een ca. 3 µm dikke microtome deel van een embedded sferoïde is weergegeven in Figuur 5B, en een immunofluorescentie beeld van een sferoïde gekleurd voor de tumor suppressor eiwit p53 (kernen gekleurd met behulp van DAPI), wordt weergegeven als Figuur 5C. Voorbeelden van DMSO en chemotherapie-behandeld sferoïden gekleurd voor de cel proliferatie marker Ki-67 of voor p53 zijn weergegeven in Figuur 5D en Figuur 5E, respectievelijk. In overeenstemming met het antiproliferative effect van de chemotherapie behandeling, is het aantal Ki-67 positieve cellen groter in de DMSO controle dan in de chemotherapie-behandelde sferoïde (Figuur 5D). In tegenstelling, wordt de p53 uitdrukking verhoogd tijdens voorwaarden van cel spanning, apoptosis en de groeiarrestatie, en bijgevolg, is het aantal p53-bevlekt cellen wezenlijk hoger in de chemotherapie-behandelde sferoïden in vergelijking met DMSO controles (Figuur 5 E).
Deze resultaten illustreren voorbeelden van hoe ruimtelijk opgelost (PI kleuring, IHC) of kwantitatieve (westelijke bevlekkende) informatie over drugsbehandeling effecten in 3D sferoïden kan worden verkregen.
Figuur 1 : Spontane en rBM-gemedieerde sferoïde vorming. (A) Schematische weergave van sferoïde vorming met behulp van ultra-lage bevestiging 96-goed ronde bodemplaten, met optionele gebruik van rBM. Individuele stappen gemarkeerd door (i-III). (B) Schematische weergave van sferoïde vorming met behulp van de hangende druppel methode. De individuele stappen worden gekenmerkt door (i-III) (C) representatieve beelden van rBM-gemedieerde sferoïde vorming van SKBr-3 cellen. Cellen werden gezaaid in ultra-lage gehechtheid 96-goed ronde bodemplaten met toenemende concentraties van rBM en geteeld voor 9 dagen. Weegschaal Bar 100 µm. (n = 3). (D) representatieve beelden van BxPC-3, MiaPaCa en Panc-1 cellen gezaaid voor sferoïde vorming in ultra-lage gehechtheid 96-goed ronde bodemplaten met een concentratie van rBM van 0,5-2,5%. Sferoïden werden 4 dagen gekweekt. Schaalbalk = 250 µm. (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Principe en evaluatie van de bepaling van de levensvatbaarheid van de cel. (A) Schematische weergave van de 3D-cel levensvatbaarheid assay. Individuele stappen aangeduid door (i-IV). Blichtgevend signaal als functie van de ATP-concentratie. Verdunningen van ATP werden geplateerd in een 96-well plaat en cel levensvatbaarheid reagens toegevoegd aan elk goed. Luminescentie werd geregistreerd na 30 min bij 405 nm. 1 n.clevensvatbaarheid, gemeten als luminescentie, van controle en chemotherapie-behandelde MCF-7 sferoïden. MCF-7 cellen werden gezaaid in ultra-lage bevestiging ronde-bodemplaten en werden geteeld voor 7 dagen. De behandeling van chemotherapie (5 μM cisplatine, 5 μM Doxorubicine en 30 nM 5-FU) werd toegepast op dag 2 en 4. De staven vertegenwoordigen gemiddelde waarden met br. 1 n. (D) lichtgevend signaal als functie van het aantal MCF-7 gezaaide cellen. MCF-7 cellen werden gezaaid in 96-goed platen op het aangegeven aantal cellen en mogen groeien voor 48 h, waarna de levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten. Foutbalken vertegenwoordigen SD. 1 n. (E) zoals beschreven in D voor MDA-MB-231 cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Effecten van behandelingsschema's op sferoïde morfologie en de levensvatbaarheid van cellen. (A) representatieve beelden van MDA-MB-231 sferoïden op dag 2, 4 en 7. MDA-MB-231 cellen werden gezaaid in ultra-lage gehechtheid ronde bodem 96-goed platen. De behandeling met stijgende dosissen chemotherapie werd begonnen op dag 2, op welk ogenblik alle sferoïden van gelijkaardige grootte waren. De rijen tonen sferoïden bij stijgende dosissen chemotherapie, en de kolommen tonen sferoïden vertegenwoordiger van grootte bij dag 2, 4, en 7 bij de vermelde dosis. De laagste dosis was 18,75 nM cisplatine, 18,75 nM Doxorubicine, 0,0625 nM 5-fluorouracil (5-FU) en deze dosis werd verdubbeld voor elk beeld getoond, resulterend in een maximale dosis van 0,3 µ M cisplatine, 0,3 µ M Doxorubicine en 2 nM 5-FU. De staaf van de schaal = 100 µm. (2 n). (B) de levensvatbaarheid van MDA-MB-231 sferoïden, gemeten als luminescentie, na 7 dagen van chemotherapeutische behandeling. De staven vertegenwoordigen gemiddelde waarden met SEM. 2 n. (c, D) representatieve beelden van MDA-MB-231 (c) en MCF-7 sferoïden (D) op dag 2, 4, 7 en voor MCF-7 sferoïden 9. Cellen die als onderaworden gezaaid en die met chemotherapie (chemo, 18,75 nm cisplatine, 18,75 nm doxorubicine, 0,0625 nm 5-Fu) op dag 2 en 4 (C) of met 2 µ m tamoxifen (TAM) op dag 2, 4 en 7 (D) worden behandeld. Schaalbalk = 100 µm. (4 n en 3 n), respectievelijk. (E, F) Levensvatbaarheid, gemeten als luminescentie, op dag 7 en 9 voor respectievelijkcend. Om te testen voor statistisch significant verschil tussen de voorwaarden een niet-gepaarde student t-test werd uitgevoerd. duidt p < 0,0001 aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Propidium jodide het bevlekken en westelijke vlek analyse van sferoïden. (A) representatieve beelden van pi-gekleurd MCF-7 sferoïden na 9 dagen van de behandeling. MCF-7 cellen werden gezaaid in ultra-lage gehechtheid 96-goed platen geteeld voor 9 dagen en behandeld met toenemende concentraties van EIPA op dag 2, 4 en 7. Op dag 9, werden de sferoïden bevlekt met PI en de beelden werden verworven op een epifluorescence Microscoop. De staaf van de schaal = 200 µm. (1 n.) (B) representatieve westelijke vlekken van MDA-MB-231 cellen na Knockout/knock-out van zuur-basis vervoerders. NHE1 werd knock-out door de CRISPer/Cas9 in MDA-MB-231 cellen 12 en de cellen werden vervolgens tijdelijk transfected met SIRNA tegen MCT4 of NBCn1, en gekweekt als sferoïden voor 9 dagen voordat ze lysed en onderworpen aan westerse bevlekken met behulp van een antilichaam het erkennen van totaal en gekloofd (c) PARP. (C) kwantificering van de verhouding van CPARP tot PARP eiwit niveau, genormaliseerd tot het laden van de controle (β-actine). (1 n). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Vaststelling, inbedding en Immunohistochemistry analyse van sferoïden. Aschematische weergave van het protocol voor de inbedding van sferoïden. Individuele stappen zijn gemarkeerd als (i-VII). (B) afbeelding van embedded MDA-MB-231 sferoïde. Schaal Bar: 50 µm. (C) representatief beeld van chemotherapie-behandelde MDA-MB-231 sferoïde onderworpen aan IHC analyse met antilichamen tegen p-53. Stippellijnen tonen de omtrek van de sferoïde. Scale bar = 20 µm. (D, E) representatieve beelden van DMSO-of chemotherapie-behandeld (bovenste en onderste panelen, respectievelijk) MDA-MB-231 sferoïden. MDA-MB-231 cellen werden gezaaid in ultra-lage gehechtheid 96-goed platen, gekweekt voor 7 dagen en behandeld met chemotherapie op dag 2 en 4. Op dag 7, werden de sferoïden ingebed gevolgd door analyse door IHC met primaire antilichamen tegen Ki-67 (D) en P53 (E). Witte dozen vertegenwoordigen zoom beelden. Schaalbalk = 20 µm in beide vergrotingen, (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van 3D kanker cel sferoïden heeft bewezen een waardevol en veelzijdig instrument niet alleen voor antikanker drug screening, maar ook voor het verkrijgen van mechanistische inzicht in de regulering van kankercellen dood en levensvatbaarheid onder omstandigheden nabootsen die in de tumor micro-omgeving. Dit is vooral van cruciaal belang als de toegankelijkheid, cellulaire opname, en intracellulaire effecten van chemotherapeutische drugs zijn diep beïnvloed door de fysisch-chemische omstandigheden in de tumor, met inbegrip van pH, zuurstof spanning, tortuosity, en fysieke en chemische cel-cel interacties9,17. Bijvoorbeeld, de zuurgraad van extracellulaire pH, die kan bereiken waarden zo laag als 6-6.5 in veel vaste tumoren25, 26,27,28,29, veroorzaakt zwak fundamentele chemotherapeutische verbindingen, zoals Doxorubicine, mitoxantron en de zwitterion paclitaxel, in rekening gebracht. Dit vermindert hun opname in de tumorcellen en kan invloed hebben op de activiteit van Multidrug resistentie eiwitten zoals p-Glycoproteïne30,31,32. Ook de proliferatie van cellen, die is cruciaal voor het effect van de meeste chemotherapeutische verbindingen, is over het algemeen verlaagd in 3D in vergelijking met 2D-voorwaarden en dus is waarschijnlijk beter nagebootst in tumor sferoïden dan in 2D-cel cultuur8,33 ,34. Ten slotte, de dichte tumor-micromilieu is de oorsprong van tal van fysieke en oplosbare signalering cues leiden intracellulaire signalering paden reguleren cel groei, overleving en dood. Dus, bij het analyseren van de effectiviteit van geneesmiddelen, 3D-cultuursystemen zijn een cruciale stap voor het inschepen in vivo modellen. Een belangrijk nadeel van 3D-cultuur is echter de toegenomen complexiteit van de analyse ten opzichte van die van de 2D-cultuur. We hebben hier beschreven eenvoudige en relatief goedkope technieken voor sferoïde vorming met behulp van een verscheidenheid van soorten kankercellen. We hebben voorbeelden getoond van hoe sferoïde vorming moet worden geoptimaliseerd voor elk type cel bestudeerd en hebben beschreven hoe kwantitatieve gegevens over de levensvatbaarheid van cellen, celdood, en de bijbehorende signalering trajecten te verkrijgen, in dergelijke sferoïden. Er zijn geen duidelijke groei-of morfologische verschillen tussen de drie hier beschreven modellen. In onze handen, de variatie in de morfologie kan iets groter zijn met behulp van de opknoping druppel methode, maar een voordeel van deze methode is dat rBM niet nodig is. We hebben hier gericht op sferoïden geproduceerd uit een enkele vorm van kankercellen. De sferoïde model is echter ook vatbaar voor co-cultuur, bijvoorbeeld van kankercellen met fibroblasten, monocyten/macrofagen, endothelial cellen, en/of adipocyten35,36,37. Andere geavanceerde toepassingen van dit model zijn de combinatie met 3D gedrukte vloeibare apparaten waardoor de dosering door middel van een semipermeabel membraan, gevolgd door het oogsten voor kwantitatieve Proteomic profilering38.
Terwijl, zoals hierboven vermeld, het fenotype van cellen geteeld in 3D sferoïden over het algemeen nabootst die van in vivo tumoren veel beter dan cellen gekweekt in 2D, de mate waarin deze sferoïden zijn in feite relevante modellen van de overeenkomstige in vivo tumoren is afhankelijk van een groot aantal factoren en moet zorgvuldig worden geëvalueerd. Parameters die van invloed zijn hoe goed dergelijke sferoïden na te bootsen de in vivo voorwaarde onder meer de cellulaire samenstelling van de tumor en de relatieve ECM samenstelling. Bijvoorbeeld, de rBM die we hebben tewerkgesteld als ECM in de protocollen die hier is een goede keuze voor het nabootsen van vroege stadia van epitheel kanker, rond de tijd van overtredingen van de kelder membraan, andere ECM-samenstellingen zullen meer relevant zijn voor bepaalde tumor types en-stadia. Voorts verschilt de capaciteit voor cel-cel adhesie wijd tussen de lijnen van kankercellen, afhankelijk van hun uitdrukking van cel-cel en cel-matrijs adhesie proteïnen zoals cadherinen en integrines22.
Zoals hier beschreven, sferoïde groei en morfologie kan gemakkelijk en niet-invasief worden gecontroleerd om de 2-3 dagen met behulp van een lichte Microscoop met een lage vergroting optiek en een groot gezichtsveld. Echter, omdat de chemotherapie stress, zoals chemotherapie behandeling, beïnvloedt sferoïde morfologie zeer verschillend en, op een manier, afhankelijk van de cel type en behandeling regeling, is het niet genoeg om te vertrouwen op de morfologie en omtrek alleen voor de evaluatie behandeling effect. Bijvoorbeeld, sferoïden kan losser worden met de behandeling en opkomende celdood, of alle dood kan optreden in de necrotic kern, terwijl het oppervlak is niet detecteerbaar aangetast. In beide gevallen kan het resultaat een foutieve indruk zijn dat het aantal levende cellen in de sferoïde niet door de behandeling wordt verminderd. Kwantitatieve en sferoïde technieken zijn daarom essentieel voor de evaluatie van het effect van de behandeling. Voor de kwantitatieve evaluatie van de celdood, de zure fosfatase Assay, die zoals de naam impliceert maatregelen de activiteit van cytosolische acid fosfatase is tewerkgesteld21. Echter, in onze handen, terwijl deze assay over het algemeen mooi weerspiegelt het aantal cellen gezaaid, is het niet adequaat vast te leggen snelle behandeling-geïnduceerde celdood (gegevens niet getoond), waarschijnlijk omdat het zuur fosfatase blijft actief voor enige tijd na celdood. Voorts vereist deze analyse volledige verwijdering van het middel, dat fout vooral met breekbare, chemotherapie-behandelde sferoïden toeneemt. De hier beschreven cel levensvatbaarheid, die is gebaseerd op cellulaire ATP-inhoud, werd gekozen op basis van zijn eenvoudige en tijdbesparende protocol en hoge reproduceerbaarheid. Voorts vereist deze analyse geen volledige verwijdering van cultuurmiddel dat een voordeel wanneer het werken met sferoïden is. Zoals aangetoond in representatieve resultaten, deze analyse vangt goed zowel cel nummer en verwachte behandeling van chemotherapie effecten. Echter, een valkuil van deze techniek is, uiteraard, dat metabole veranderingen verminderen intracellulaire ATP-inhoud kan ten onrechte worden geregistreerd als een lager aantal cellen. Vandaar, parallelle beoordeling van sferoïde volume en de morfologie, of PI kleuring, is raadzaam om resultaten te valideren.
Sferoïde lysis gevolgd door het westelijke bevlekken kan semi-kwantitatief inzicht in de staat van signalering processen, cel dood-, groei-en levensvatbaarheid wegen verstrekken. Het gebruik van het westelijke bevlekken is ingewikkeld wanneer rBM wordt gebruikt om de sferoïden voor te bereiden, aangezien dit een wezenlijke Fractie van het lysate eiwitgehalte zal omvatten, en wat nog belangrijker is, zal zijn verwaarloosbare bijdrage met het verminderen van cellulaire inhoud stijgen tijdens chemotherapeutische celdood. Het is in principe mogelijk om de rBM door centrifugeren te verwijderen; Nochtans, is dit een kritieke stap, aangezien het moeilijk is om alle rBM volledig te verwijderen, en dit zal kwantitatieve vergelijking tussen voorwaarden uitsluiten. Voor dergelijke sferoïden, en in het algemeen voor ruimtelijk opgeloste beoordeling van de dood trajecten en relevante signalering parameters, inbedding en IHC zijn sterke instrumenten. Andere benaderingen kunnen worden overwogen: Live confocale beeldvorming van (relatief klein) intact sferoïden39. Een ander interessant bezit van sferoïden is dat gezien hun vrij regelmatige "bal" vorm, zij zich goed aan herhaling tussen wiskundige modellering en natte laboratoriumexperimenten lenen, om het begrip van het belang van bovengenoemd te verhogen-vermeld gradiënten van zuurstof, pH, en voedingsstoffen binnen sferoïden, en, door extrapolatie, tumoren40,41. Zo, hoewel belangrijke 3D-tumor modellen van veel grotere complexiteit in opkomst zijn, met inbegrip van een breed scala van organotypic en organite culturen op basis van complexe biologische en inerte steigers, en, niet in het minst, patiënt-afgeleide xenografts42, sferoïden blijft een belangrijk instrument vanwege hun superieure biologische relevantie ten opzichte van 2D-cultuur, gecombineerd met relatief eenvoudig te hanteren.
Samengevat, presenteren we hier een reeks eenvoudige methoden voor de analyse van de behandeling van anti-kanker-geïnduceerde veranderingen in de levensvatbaarheid van kankercellen en de dood in 3D-cultuur. De samenstelling van de sferoïden kan worden aangepast naar gelang van de eigenschappen en de biologie van de gebruikte cellen en de kwantitatieve en kwalitatieve analyses zijn nuttig, zowel voor de beoordeling van de dosis-respons relaties als voor het verkrijgen van inzicht in de signalering-en overlijdens trajecten betrokken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Katrine Franklin Mark en Annette Bartels voor uitstekende technische hulp en om Asbjørn Nøhr-Nielsen voor het uitvoeren van de experimenten in figuur 1D. Dit werk werd gefinancierd door de Stichting Willumsen, de Novo Nordisk Foundation, en de Fondation juchum (all to SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
References
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids. British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).
- Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).
- Chen, J. L., et al. The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers. PLoS Genetics. 4 (12), 1000293 (2008).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30 (3), 247-255 (2003).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Jacobi, N., et al. Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling. Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).
- Rodriguez-Enriquez, S., et al. Energy metabolism transition in multi-cellular human tumor spheroids. Journal of Cell Physiology. 216 (1), 189-197 (2008).
- Kunz-Schughart, L. A. Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor. Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).
- Andersen, A. P., et al. Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment. Molecular Cancer. 15 (1), 45 (2016).
- Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).
- Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).
- Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation. International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).
- Feng, H., et al. Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).
- Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology. 10, 29 (2012).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Cong, L., Xu, E. Y. Human neuroendocrine tumor cell lines as a three-dimensional model for the study of human neuroendocrine tumor therapy. Journal of Visual Experiments. (66), e4218 (2012).
- Friedrich, J., et al. A reliable tool to determine cell viability in complex 3-d culture: the acid phosphatase assay. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 925-937 (2007).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. International Journal of Oncology. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Andersen, A. P., et al. The net acid extruders NHE1, NBCn1 and MCT4 promote mammary tumor growth through distinct but overlapping mechanisms. International Journal of Cancer. , (2018).
- Vaupel, P. Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology. Seminars in Radiation Oncology. 14 (3), 198-206 (2004).
- Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma. Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).
- Helmlinger, G., Yuan, F., Dellian, M., Jain, R. K. Interstitial pH and pO2 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation. Nature Medicine. 3 (2), 177-182 (1997).
- Zhang, X., Lin, Y., Gillies, R. J. Tumor pH and its measurement. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1167-1170 (2010).
- Gillies, R. J., Raghunand, N., Karczmar, G. S., Bhujwalla, Z. M. MRI of the tumor microenvironment. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 16 (4), 430-450 (2002).
- Vukovic, V., Tannock, I. F. Influence of low pH on cytotoxicity of paclitaxel, mitoxantrone and topotecan. British Journal of Cancer. 75 (8), 1167-1172 (1997).
- Song, C. W., Griffin, R., Park, H. J. Cancer Drug Resistance. Teicher, B. A. , Humana Press. 21-42 (2006).
- Lotz, C., et al. Role of the tumor microenvironment in the activity and expression of the p-glycoprotein in human colon carcinoma cells. Oncology Reports. 17 (1), 239-244 (2007).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular Oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Kuen, J., Darowski, D., Kluge, T., Majety, M. Pancreatic cancer cell/fibroblast co-culture induces M2 like macrophages that influence therapeutic response in a 3D model. PLoS One. 12 (7), 0182039 (2017).
- Bochet, L., et al. Adipocyte-derived fibroblasts promote tumor progression and contribute to the desmoplastic reaction in breast cancer. Cancer Research. 73 (18), 5657-5668 (2013).
- Amann, A., et al. Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports. 7 (1), 2963 (2017).
- LaBonia, G. J., Ludwig, K. R., Mousseau, C. B., Hummon, A. B. iTRAQ Quantitative Proteomic Profiling and MALDI-MSI of Colon Cancer Spheroids Treated with Combination Chemotherapies in a 3D Printed Fluidic Device. Analytical Chemistry. 90 (2), 1423-1430 (2018).
- Hulikova, A., Vaughan-Jones, R. D., Swietach, P. Dual role of CO2/HCO3(-) formula buffer in the regulation of intracellular pH of three-dimensional tumor growths. Journal of Biological Chemistry. 286 (16), 13815-13826 (2011).
- Wallace, D. I., Guo, X. Properties of tumor spheroid growth exhibited by simple mathematical models. Frontiers in Oncology. 3, 51 (2013).
- Michel, T., et al. Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids. Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).
- Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
