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Cancer Research

कैंसर कोशिकाओं के 3 डी स्फीरॉइड संस्कृति में सेल व्यवहार्यता और मौत का आकलन

Published: June 16, 2019 doi: 10.3791/59714
Automatic Translation
1, 1, 1
1Section for Cell Biology and Physiology, Department of Biology, Faculty of Science, University of Copenhagen

Summary

यहाँ, हम 3 डी कैंसर सेल स्फीरोइड में व्यवहार्यता और मौत का मूल्यांकन करने के लिए कई सरल तरीके पेश करते हैं, जो विवो ट्यूमर में भौतिक-रासायनिक ढालों की नकल करते हैं जो 2 डी संस्कृति की तुलना में बेहतर है। इसलिए, गोलोइड मॉडल, विवो स्थितियों में बेहतर अनुवाद के साथ कैंसर दवा प्रभावकारिता के मूल्यांकन की अनुमति देता है।

Abstract

कैंसर कोशिकाओं के तीन आयामी गोलभॉइड दोनों कैंसर दवा स्क्रीन के लिए और कैंसर सेल जीव विज्ञान में मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं. इस तैयारी की शक्ति ट्यूमर के vivo शर्तों में कई पहलुओं की नकल करने की क्षमता में निहित है, जबकि तेजी से किया जा रहा है, सस्ते, और काफी बहुमुखी अपेक्षाकृत उच्च throughput स्क्रीनिंग की अनुमति देने के लिए. अराउंडॉइड संस्कृति की स्थिति एक ट्यूमर में भौतिक-रासायनिक ढालों को फिर से दोहरा सकती है, जिसमें बढ़ती extracellular अम्लता, लैक्टेट में वृद्धि, और ग्लूकोज और ऑक्सीजन की उपलब्धता कम करना शामिल है, जो कि अराउंडॉइड परिधि से इसके कोर तक है। इसके अलावा, यांत्रिक गुण और विवो ट्यूमर में की सेल सेल बातचीत भाग में इस मॉडल द्वारा नकल कर रहे हैं. विशिष्ट गुण और फलस्वरूप इष्टतम विकास की स्थिति, 3 डी अफ़ीरॉइड की, कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के बीच व्यापक रूप से अलग. इसके अलावा, 3 डी स्फीरॉइड में सेल व्यवहार्यता और मृत्यु के मूल्यांकन के लिए उन तरीकों की आवश्यकता होती है जो 2 डी संस्कृतियों के लिए नियोजित लोगों से अलग होते हैं। यहाँ हम कैंसर कोशिकाओं के 3 डी गोलभों की तैयारी के लिए कई प्रोटोकॉल का वर्णन, और ऐसी संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए सेल व्यवहार्यता और कैंसर विरोधी दवाओं की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के संदर्भ में मौत का आकलन.

Introduction

कैंसर जीव विज्ञान में बहुकोशिकीय गोलभक्ते मॉडल का प्रयोग कई दशकों पुराना 1,2है , लेकिन हाल के वर्षों में काफी गति प्राप्त की है. बड़े हिस्से में, यह कैसे दृढ़ता से कैंसर कोशिकाओं के phenotype उनके microenvironment और विशिष्ट विकास की स्थिति पर निर्भर है की वृद्धि हुई जागरूकता को दर्शाता है. ठोस ट्यूमर में microenvironment मूल रूप से इसी सामान्य ऊतकों में से अलग है. इसमें भौतिक-रासायनिक स्थितियां जैसे पीएच, ऑक्सीजन तनाव, साथ ही अंतरालीय दबाव, घुलनशील पदार्थों जैसे घुलनशील कारकों की सांद्रता प्रवणता, अपशिष्ट उत्पाद, और स्रावित संकेतन यौगिक (वृद्धि कारक, साइटोकिन्स)। इसके अलावा, इसमें अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम), सेल-सेल इंटरकोशिकीय संकेतन, और ट्यूमर3,4के विशेष तीन आयामी (3 डी) वास्तुकला के अन्य पहलुओं के संगठन शामिल हैं। 5,6. विशिष्ट सूक्ष्म पर्यावरण की स्थिति जिसमें कैंसर की कोशिकाओं मौजूद हैं, गहराई से उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल और कार्यात्मक गुणों को प्रभावित, और यह स्पष्ट है कि, 2 डी में विकसित कोशिकाओं की तुलना में, 3 डी गोलोइड के phenotype और अधिक बारीकी से नकल करता है कि विवो ट्यूमर7,8,9,10,11में से . 2 डी मॉडल, भले ही वे hypoxia, अम्लीय पीएच, और उच्च लैक्टेट सांद्रता ट्यूमर microenvironment के ज्ञात पहलुओं की नकल करने के लिए रोजगार, अभी भी ट्यूमर के भीतर उत्पन्न होने वाले physico-रासायनिक मापदंडों की ढाल पर कब्जा करने में विफल, साथ ही उनके 3 डी ट्यूमर वास्तुकला. दूसरी ओर, पशु मॉडल महंगे हैं, धीमी गति से, और नैतिक रूप से समस्याग्रस्त, और आम तौर पर, भी मानव ट्यूमर की स्थिति recapitulate करने की क्षमता में कमियां हैं. नतीजतन, 3 डी अफ़ीरॉइड सबसे ठोस कैंसर9,11,12,13के गुणों की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन में एक मध्यवर्ती जटिलता मॉडल के रूप में लागू किया गया है, 14,15,16,17.

3 डी स्फीरोइड का व्यापक रूप से नियोजित उपयोग कैंसर रोधी चिकित्सा प्रभावकारिता9,18,19,20की जांच में है . उपचार प्रतिक्रियाओं ट्यूमर microenvironment के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हैं, tortuosity के दोनों प्रभाव को दर्शाती है, प्रतिबंधित प्रसार, उच्च अंतरालीय दबाव, और दवा वितरण पर अम्लीय पर्यावरण पीएच, और hypoxia और अन्य के प्रभाव कोशिका मृत्यु अनुक्रिया पर सूक्ष्म पर्यावरण के पहलुओं9,17. क्योंकि 3 डी अफ़ीरों के भीतर का वातावरण स्वाभाविक रूप से इन सभी गुणोंकाविकास करता है 7,8,9,10,11, 3 डी सेल संस्कृतियों को रोजगार कर सकते हैं काफी हद तक vivo स्थितियों में करने के लिए परिणामों के अनुवाद में सुधार, अभी तक कुशल और सस्ती शुद्ध विकास के उच्च throughput स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं. हालांकि, कैंसर कोशिकाओं की दवा प्रतिक्रिया पर अध्ययन के महान बहुमत अभी भी 2 डी शर्तों के तहत किया जाता है. यह संभावना को दर्शाता है कि, जबकि कुछ परख अपेक्षाकृत आसानी से 3 डी सेल संस्कृतियों के लिए लागू किया जा सकता है, कई, जैसे व्यवहार्यता assays, पश्चिमी blotting, और इम्यूनोफ्लोरेसींस विश्लेषण, बहुत अधिक आसानी से 3 डी में से 2 डी में किया जाता है.

वर्तमान कार्य का उद्देश्य एक 3 डी ट्यूमर नकल सेटिंग में कैंसर सेल व्यवहार्यता और अस्तित्व पर विरोधी कैंसर दवाओं के साथ उपचार के प्रभाव के विश्लेषण के लिए आसानी से सक्षम परख और सटीक प्रोटोकॉल प्रदान करना है। विशेष रूप से, हम गोलाभकेदार गठन के लिए तीन अलग-अलग विधियों को प्रदान करते हैं और तुलना करते हैं, इसके बाद वृद्धि, व्यवहार्यता और औषध अनुक्रिया के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विधियाँ होती हैं।

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Protocol

1. स्फीरॉइड्स का उत्पादन

  1. अफ़ीम गठन के लिए सेल निलंबन की तैयारी
    नोट:     विभिन्न सेल लाइनों बहुत अलग आसंजन गुण है और सबसे उपयुक्त गोलभड़ गठन प्रोटोकॉल प्रत्येक मामले में स्थापित किया जाना चाहिए। हमने पाया है कि MCF-7 और BxPC-3 कोशिकाओं सहज spheroid गठन के लिए उपयुक्त हैं, जबकि एमडीए-एमबी-231, SKBr-3, Panc-1 और MiaPaCa पुनर्गठन तहखाने झिल्ली के अलावा सफलतापूर्वक spheroids फार्म की आवश्यकता है. केवल एमडीए-एमबी-231 और BxPC-3 कोशिकाओं फांसी ड्रॉप प्रोटोकॉल के लिए नियोजित किया गया है, हालांकि अन्य सेल लाइनों निश्चित रूप से लागू होते हैं.
    1. 70-80% संगम तक मोनोलेयर के रूप में कोशिकाओं को बढ़ाएँ।
    2. फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (1x पीबीएस, एक 75 सेमी2 फ्लास्क के लिए 25 सेमी 2 या 10 एमएल के लिए 5 एमएल) के साथ कोशिकाओं को धोएं, सेल वियोजन एंजाइम जोड़ें (0.5 एमएल एक 75 सेमी2 फ्लास्क के लिए 25 सेमी2 या 1 एमएल के लिए) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2-5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता में।
    3. एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी की जाँच करें और एक 75 सेमी2 फ्लास्क के लिए एक 25 सेमी2 या 10 एमएल में 5 एमएल की कुल मात्रा के लिए वृद्धि माध्यम (6-10% सीरम सेल लाइन के आधार पर) जोड़कर सेल वियोजन एंजाइम बेअसर।
    4. स्यूजर के आकार के उच्च पुनरुत्पादनीयता को प्राप्त करने के लिए कक्षों की गणना करने और कक्ष प्रति कक्ष तैयारी में 8 वर्गों की गणना करने के लिए एक B$rker कक्ष का उपयोग करें।
      नोट: तीन प्रोटोकॉल प्रत्येक गोलोइड गठन के लिए एक अलग विधि का वर्णन नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं. प्रोटोकॉल 1ण्2 और 1ण्3 का उपयोग प्रस्तुत सभी बाद के विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉलों के लिए किया जा सकता है, जबकि प्रोटोकॉल 1ण्4 एम्बेडिंग तथा लाइसेट तैयारी के लिए सर्वोत्तम उपयुक्त है। कोशिका रेखा के आधार पर, गोलभॉइड गठन में उपयोग की गई विधि पर ध्यान दिए बिना 2-4 दिन लगते हैं।
  2. सहज गोलभका निर्माण
    1. 1.1.1-1.4 चरणों का प्रदर्शन करें।
    2. 0ण्5-2 x 104 कोशिकाओं/एमएल (अनुकूल सेल घनत्व प्रत्येक कोशिका रेखा के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है) प्राप्त करने के लिए 15 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन को कम करना (चित्र 1ए (ii))।
    3. शेष कुओं से वाष्पीकरण को कम करने के लिए 1x पीबीएस या विकास माध्यम के साथ कुओं की बाहरी अंगूठी भरें। सेल निलंबन को एक बाँझ जलाशय में स्थानांतरित करें और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, 200 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो लगाव 96-वेल गोल नीचे प्लेटों में वितरित करें (चित्र 1ए (पप))।
    4. 5% सीओ2, 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    5. हर 2-3 दिन गोलभक् त के प्रकाश सूक्ष्म चित्र प्राप्त करते हैं।
      नोट: इस कागज में छवियों 11.5x आवर्धन, जो सबसे इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर तैयार गोलभों के लिए उपयुक्त है पर लिया जाता है.
    6. हर 2-3 दिनों (चित्र प्राप्त करने के बाद) मध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस की जगह (व्यय माध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस को हटा दें और ताजा माध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस के साथ बदलें।
      नोट: मध्यम की जगह जब गोलभड़ियों को हटाने से बचने के लिए, धीरे-धीरे मध्यम को हटाने और इसे हटाने से पहले दृश्य गोलोइड के लिए सुझावों में aspirated माध्यम का निरीक्षण करते हुए प्लेट को थोड़ा झुकाने की सलाह दी जाती है।
  3. पुनर्गठित बेसमेंट झिल्ली-मध्यस्थ स्फरॉइड गठन।
    नोट:     लैक्टोज डिहाइड्रोजनेज एलिवेटिंग वायरस (एलडीओ) मुक्त कम विकास कारक पुनर्गठित तहखाने झिल्ली (आरबीएम) का उपयोग किया गया था। rBM तापमान के प्रति संवेदनशील है और हमेशा बर्फ पर रखा जाना चाहिए, क्योंकि यह थक्का होगा अगर यह 15 डिग्री सेल्सियस तक पहुँचता है। प्लेटिंग से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस या 2-4 एच पर बर्फ पर आरबीएम को थपथपाना।
    1. बर्फ पर thaw rBM (सामग्री की मेजदेखें )
    2. उपयोग करने से पहले बर्फ पर प्लेटें और जलाशय (यदि व्यक्तिगत रूप से लपेटा जाता है) रखें।
    3. 1.1.1-1.4 चरणों का प्रदर्शन करें।
    4. शेष कुओं से वाष्पीकरण को कम करने के लिए 1x पीबीएस या विकास माध्यम के साथ कुओं की बाहरी अंगूठी भरें। 0ण्5-2 x 104 कोशिकाओं/एमएल (अनुकूल सेल घनत्व प्रत्येक कोशिका रेखा के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है) प्राप्त करने के लिए 15 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन को कम करना (चित्र 1ए (ii))।
    5. बर्फ पर पतला सेल निलंबन युक्त 15 एमएल ट्यूब रखें (उदा., कांच बीकर में) (चित्र1ए (द्वितीया))।
    6. ठंडी प्लेटों और जलाशयों को हुड में स्थानांतरित करें। प्लास्टिक के कंटेनर कुल्ला, उन्हें बर्फ के साथ भरने और उन्हें हुड में हस्तांतरण प्लेटें और जलाशयों पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जा करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    7. एक समरूप जेल सुनिश्चित करने के लिए आरबीएम को धीरे से पुन: निलंबित करें।
    8. ठंडा सेल निलंबन करने के लिए 1-2% rBM जोड़ें (अनुकूल एकाग्रता प्रत्येक सेल लाइन के लिए निर्धारित करने की जरूरत है) (चित्र 1ए (iib)).
    9. प्लेट में निलंबन वितरण से पहले आरबीएम और सेल निलंबन का उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए 15 एमएल ट्यूब को उलटें।
    10. एक बाँझ जलाशय में आरबीएम युक्त सेल निलंबन स्थानांतरित करें और एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके ठंडा अल्ट्रा-लोलगाव 96-वेल प्लेटमें 200 डिग्री एल/
      नोट: यदि कई सेल निलंबन (जैसे, एक से अधिक सेल लाइन) के साथ काम कर रहे हैं, तो समय से पहले जेलिंग को रोकने के लिए आरबीएम इसके अलावा के तुरंत बाद प्रत्येक सेल निलंबन को वितरित करना आवश्यक है।
    11. 750 x g पर 15 मिनट के लिए प्लेट को 'सॉफ्ट डेंट'/नो ब्रेकिंग (यदि संभव हो तो, 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र आरबीएम तरल पदार्थ को लंबे समय तक रखने के लिए, लेकिन सफल स्फीरॉइड गठन के लिए एक आवश्यकता नहीं) का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को एक साथ संकुल किया जाता है जब आरबीएम कठोर, एक एकल गोलभके गठन की सुविधा.
    12. एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता) में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    13. हर 2-3 दिन गोलभय विकास के मूल्यांकन के लिए प्रकाश सूक्ष्म छवियों प्राप्त.
    14. हर 2-3 दिन मध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस की जगह (100 डिग्री सेल्सियस निकालें और ताजा माध्यम के 100 डिग्री एल के साथ बदलें)।
  4. हैंगिंग ड्रॉप अफ़ीरॉइड्स।
    1. चरण 1.1.1-1.1.4 निष्पादित करें.
    2. एक उपयुक्त कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं को पतला करना. एक व्यावहारिक कमजोर पड़ने 50,000 कोशिकाओं /
    3. एक 10 सेमी2 सेल संस्कृति पकवान के ढक्कन निकालें और यह जगह है तो यह ऊपर की ओर चेहरे. डिश में 1x पीबीएस का 6 एमएल जोड़ें (चित्र 1ठ (i)) ) .
    4. एक बाँझ जलाशय में सेल निलंबन डालो और ध्यान से सेल संस्कृति डिश के ढक्कन पर सेल संस्कृति डिश के 40 डिग्री सेल्सियस की 30 बूँदें एक multichannel pippette का उपयोग कर जगह (चित्र 1बी (ii), 2,000 कोशिकाओं की एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप / ढक्कन के किनारे के बहुत करीब बूंदों को रखने से बचें क्योंकि निम्न चरण में ढक्कन को उलटते समय इन बूंदों को सतह तनाव खोने की अधिक संभावना होती है।
    5. एक त्वरित लेकिन नियंत्रित आंदोलन में ढक्कन उलटा और यह 1x पीबीएस युक्त सेल संस्कृति पकवान के शीर्ष पर जगह (चित्र1बी (iii)).
    6. बूंदों को परेशान किए बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में पकवान रखें और उन्हें 4-6 दिनों के लिए बढ़ने के लिए छोड़ दें।
    7. यदि प्रोटीन lysates या embedding के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए, पूल गूढ़ों ढक्कन हटाने और यह झुकाव द्वारा, क्रम में गर्म मध्यम के 1 एमएल के साथ बूंदों को धोने के लिए. एक 1.5 एमएल ट्यूब करने के लिए गोलिकेज युक्त परिणामी माध्यम स्थानांतरण और उन्हें ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। प्रोटीन lysates और embedding के लिए 4.4 और 6.2.2 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें, क्रमशः.

2. स्फीरॉइड्स का औषधि उपचार

नोट: ब्याज की एक दवा के प्रभाव के लिए स्क्रीन करने के लिए लंबे समय तक दवा उपचार गोलाभ के लिए लागू किया जा सकता है। दवा उपचार शुरू करने से पहले, प्रयोगात्मक उपचार के लिए एक उपयुक्त खुराक खोजने के लिए दवा (एस) की खुराक प्रतिक्रिया प्रयोग करने की सलाह दी जाती है। खुराक दवा के निर्धारित आईसी50/Ki पर आधारित होना चाहिए और इस मान के लगभग 0.2x-10x से लेकर।

  1. 1.2 या 1.3 में वर्णित के रूप में वांछित स्थिति के अनुसार 6-12 गोलभड़ों की स्थापना करें और 2 दिनों के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, 95% आर्द्रता) में रखें।
  2. दूसरे दिन, गोलोइड के हल्के सूक्ष्म चित्र लें।
  3. पहले उपचार खुराक तैयार (चित्र प्राप्त करने के बाद).
    नोट: पहले उपचार एकाग्रता दो बार वांछित अंतिम एकाग्रता होना चाहिए के रूप में समाधान पतला किया जाएगा 1:2 अच्छी तरह से युक्त करने के अलावा 100 डिग्री सेल्सियस मध्यम. सुझाए गए दवा उपचार अंतराल (दवा आधा जीवन पर निर्भर करेगा): दिन 2, 4 और 7.
  4. मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, मध्यम के 100 डिग्री सेल्सियस को धीरे से निकालें और इसे मध्यम युक्त दवा के 100 डिग्री एल के साथ बदलें।
  5. 96-वेल प्लेट को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें जिसमें 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता होगी और उपचार के चुने हुए दिनों पर 2.3 और 2.4 दोहराएं, लेकिन अब सही अंतिम खुराक प्राप्त करने के लिए खुराक को दोगुना किए बिना।
  6. प्रोटोकॉल/उपचार अनुसूची के अंतिम दिन, निम्नमें से एक या कई परख की जा सकती है।

3. Spheroids के लिए सेल Viability परख

  1. 1.2 या 1.3 में वर्णित के रूप में वांछित स्थिति के अनुसार 4-6 गोलभड़ों की स्थापना करें और 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: इस मामले में, सेल व्यवहार्यता परख 7 या 9 दिन पर किया गया था, ऊपर वर्णित के रूप में प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा हर 2-3 दिनों में गोलाभ विकास की निगरानी करने के बाद (बिंदु 1.2.5 और 1.3.13).
  2. व्यवहार्यता परख अभिकर्मक को थपथपाएं (सामग्री की तालिकादेखें ) और इसे उपयोग करने से पहले आरटी के बराबर होने दें।
  3. सजातीय विलयन प्राप्त करने के लिए पलटकर धीरे-धीरे मिलाएं।
  4. परख प्रदर्शन करने से पहले, गोलाभ (100 डिग्री सेल्सियस) से संस्कृति माध्यम का 50% निकालें।
  5. कुएं में उपस्थित मध्यम की मात्रा में 1:3 अनुपात में प्रत्येक के लिए सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक जोड़ें (चित्र 2क (i)96-कूप प्लेट के लिए, अभिकर्मक के 50 $L को माध्यम के 100 $ल में जोड़ें।
  6. कोशिका lysis प्रेरित करने के लिए 5 मिनट के लिए जोरदार सामग्री मिक्स (चित्र 2ए (पप).
  7. ल्यूमिनसेंट सिग्नल को स्थिर करने के लिए आरटी में 25 मिनट के लिए इनक्यूबेट (चित्र2ए (पपप)) ।
  8. संदीप्त संकेत को अभिलेखित करें (चित्र2क (पअ)।

4. 3 डी स्फरॉइड संस्कृति से पश्चिमी ब्लॉटिंग के लिए प्रोटीन Lysates की तैयारी

नोट: जब गोलाभभों का संग्रह, यह एक P200 pippette का उपयोग करें और एक बड़ा खोलने की अनुमति है और इसलिए उनकी संरचना परेशान बिना गोलाभियों का एक आसान कब्जा अनुमति देने के लिए टिप के अंत में कटौती करने के लिए सलाह दी जाती है।

  1. प्रत्येक स्थिति के लिए, पूल 12 की एक न्यूनतम, आदर्श 18-24 गोलाभ (गोलीय आकार पर निर्भर करता है) एक 1.5 एमएल ट्यूब में (2 एमएल ट्यूब से बचने, के रूप में अगले कदम उनके कम नुकीले नीचे की वजह से और अधिक कठिन हो जाएगा).
    नोट: यदि माध्यम की मात्रा सभी गोलिभों को एकत्र करने से पहले 1.5 एमएल से अधिक हो जाती है, तो एकत्र किए गए स्फीरॉइडको तल पर व्यवस्थित होने दें (बहुत जल्दी, अपकेंद्रण आवश्यक नहीं है) और एकत्रित करना जारी रखने से पहले ट्यूब की आधी मात्रा को छोड़ दें शेष अफ़ीरॉइड्स.
  2. बर्फ पर ट्यूब रखें और गोलोइड 1.5 एमएल ट्यूब के तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. बाँझ सेल प्रयोगशाला से नियमित प्रयोगशाला में ले जाएँ.
  4. 1 एमएल बर्फ-ठंडा 1x PBS में दो बार अधोक धो लें। गोलाभियों प्रत्येक धोने कदम के बीच 1x पीबीएस को हटाने से पहले व्यवस्थित करते हैं।
  5. परेशान या गोलभड़ियों को हटाने के बिना संभव के रूप में ज्यादा 1x पीबीएस के रूप में aspirate.
  6. फॉस्फेटेज- और प्रोटीज़ इनहिबिटर के साथ 5 डिग्री सेल्सियस गर्म lysis बफर (एलबी) जोड़ें, गोलाभ प्रति (जैसे, 10 गोलाभ 50 डिग्री एल बी)।
  7. भंवर के अंतराल को दोहराएँ, जिसके बाद गोलोइड घुल ने नहीं किया। 30 s centrifugation के बाद के लिए भंवर का एक चक्र प्रदर्शन (एक tabletop अपकेंद्रित्र का उपयोग कर एक त्वरित स्पिन पर्याप्त है) के लिए 10 s के लिए लगभग 5-10 मिनट आकार और spheroids की compactness के आधार पर.
    नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है। एक मानक 2 डी प्रोटीन lysate प्रोटोकॉल के रूप में sonication, homogenization और प्रोटीन निर्धारण के साथ आगे बढ़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर lysates रखें, मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर पश्चिमी blotting द्वारा पीछा किया।

5. प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) स्फीरॉइड्स का दाग

  1. 1.2 या 1.3 में वर्णित के रूप में वांछित स्थिति के अनुसार 3-6 गोलभड़ों की स्थापना करें और 5% सीओ2 और 95% आर्द्रता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
  2. एक बाँझ सेल संस्कृति प्रयोगशाला में, गर्मी 1x पीबीएस करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस.
  3. 1x पीबीएस में स्टॉक समाधान को कम करके 4 डिग्री सेल्सियस का PI समाधान करें: 1x PBS में पीआई 1:350 के 1 मिलीग्राम/
    नोट: इस संकेन्द्रण को कूपों के विलयन के अतिरिक्त और आधा कर दिया जाएगा जिससे इस विलयन की अंतिम सांद्रता 2 उृ. 100 ेल की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रत्येक कूप होता है जिसमें एक गोलभहोता होता है।
    चेतावनी: Propidium आयोडाइड (पीआई) एक धूआं हुड में संभाला और दस्ताने पहने होना चाहिए. पीआई प्रकाश संवेदनशील है. जब से निपटने प्रकाश से रक्षा करें।
  4. काहोरॉइड्स को हटाए बिना 96-वेल प्लेट में प्रत्येक कुएं से 100 डिग्री सेल्सियस निकाल दें।
  5. सभी कुओं में 100 डिग्री सेल्सियस तरल को हटाने के बाद गर्म 1x पीबीएस के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़कर शेष माध्यम को धो लें। इस धोने कदम 3 बार दोहराएँ.
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से पीआई समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेट को कवर करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 और 10-15 मिनट के लिए 95% आर्द्रता के साथ रखें।
  7. पीआई समाधान को धोने के लिए 4.5 में वर्णित 3 धोने के चरणों को दोहराएँ, ताकि इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि संकेत को कम किया जा सके।
  8. एक एपिफ्लोरेसी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गोलोइडों की छवि करें। स्फीरॉइड कोर में कोशिकाओं की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए स्फीरॉइड की अलग-अलग गहराई वाले चित्रों को प्राप्त करने के लिए z-स्टैक लेते हैं।
    नोट: एक कदम आकार के आसपास 18-35 डिग्री प्रत्येक टुकड़ा के बीच गोलोइड आकार के आधार पर सलाह दी जाती है, लगभग 11-18 spheroid प्रति ढेर दे रही है. $-स्टैक ्स-स्टैक्स को z-प्रक्षेप समारोह का उपयोग करके ImageJ में संसाधित किया जा सकता है, जो सभी z-स्टैक को एक अंतिम चित्र में संयोजित कर सकता है, जो गोलाभ भर में धुंधला का अवलोकन दे सकता है (इस उद्देश्य के लिए ImageJ के उपयोग पर आगे के दिशानिर्देशों के लिए, देखें (https://imagej.net/Z-functions).

6. 3 डी स्फीरॉइड्स का एम्बेडिंग

  1. agarose जेल जिसमें गोलाभ एम्बेडेड हैं तैयार (केवल आवश्यक पहली बार प्रोटोकॉल प्रदर्शन).
    1. डीडीएच2हे के 50 एमएल में 1 ग्राम बैक्टोगर मिलाएं।
    2. जब तक बैक्टोगर भंग नहीं हो जाता और एक समरूप जेल का गठन नहीं हो जाता, तब तक माइक्रोवेव ओवन में धीरे-धीरे गर्मी दें। जेल को उबालने की अनुमति न दें।
    3. 60 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में बैक्टोगर गर्म रखें।
    4. प्रयोगों के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. गोलभों का एम्बेडिंग.
    1. 1 दिन, प्रत्येक शर्त के लिए, एक 1.5 एमएल ट्यूब में 12 गोलभड़ियों की एक न्यूनतम पूल.
    2. बर्फ ठंडा 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ एक बार धो लें.
    3. गोलभड़ियों को ठीक करने के लिए, 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का 1 एमएल जोड़ें।
      नोट: एक धूआं हुड में पैराफॉर्मेल्डिहाइड की हैंडलिंग की जानी चाहिए।
    4. उन्हें आरटी में 24 एच के लिए इनक्यूबेट करते हैं।
    5. 2 दिन, एक माइक्रोवेव ओवन में एक पानी से भरे बीकर में रखकर आगनबाड़ी जेल सावधानी से गर्मी. सुनिश्चित करें कि जेल फोड़ा नहीं है! उपयोग होने तक 60 डिग्री सेल्सियस पर बेंचटॉप हीटिंग प्लेट में गर्म रखें।
    6. 1 एमएल बर्फ-ठंडा 1x PBS के साथ दो बार गोलोइड धो लें।
    7. 1x पीबीएस के अधिकांश Aspirate (इस बिंदु पर लगभग 100 $L छोड़ने का कार्य गोलाभ से निपटने के लिए व्यावहारिक है)।
    8. एक बड़ा छेद के साथ एक pointier टिप प्राप्त करने के लिए एक incline पर पिपेट टिप काटने से एक 20 डिग्री एल पिपेट तैयार करें (उदाहरण देखें).
      नोट: अगले भाग के लिए जल्दी से इष्टतम spheroid हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए और जेल ड्रॉप के solidification से बचने के लिए किया जाना है. यदि कोई हीटिंग ब्लॉक उपलब्ध नहीं है, तो पहले गोलाभ को पकड़ने और फिर agarose ड्रॉप करने के लिए सिफारिश की है (यानी, अंक के क्रम स्विचन 6.2.9 और 6.2.10).
    9. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक agarose जेल ड्रॉप बनाओ. एक गर्म हीटिंग ब्लॉक पर स्लाइड प्लेस solidifying से agarose को रोकने के लिए.
    10. संशोधित पिपेट टिप का उपयोग करना (6.2.8 देखें), 15-20 डिग्री सेल्सियस की मात्रा में संभव के रूप में कई गोलभों को पकड़ें।
    11. माइक्रोस्कोप स्लाइड को छूने के बिना 15-20 डिग्री गोलभयुक्त 1x पीबीएस को अगारोस जेल ड्रॉप के केंद्र में सावधानी से इंजेक्ट करें।
      नोट: यह थोड़ा कठिन मुद्दा है। गोलोइड खो जाएगा अगर पिपेट टिप माइक्रोस्कोप स्लाइड को छूता है जब जेल ड्रॉप में गोलिॉइड इंजेक्शन। यह agarose ड्रॉप बनाने और ड्रॉप में एक रंगीन तरल इंजेक्शन द्वारा गोहरॉइड इंजेक्शन की पूरी प्रक्रिया का अभ्यास करने के लिए सलाह दी जाती है। यह ड्रॉप के माध्यम से एक संभावित प्रवेश के दृश्य की अनुमति देगा, क्योंकि रंगीन तरल स्लाइड पर लीक हो जाएगा।
    12. एगारोस जेल को आरटी पर 5-10 मिनट के लिए या 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करके कठोर होने दें। एक बार जेल ड्रॉप कुछ ठोस है (लेकिन अभी भी नहीं बल्कि नरम है), ध्यान से एक स्केलपेल के साथ एक प्लास्टिक ऊतक कैसेट में माइक्रोस्कोप स्लाइड से जेल ड्रॉप धक्का.
    13. 70% इथेनॉल में प्लास्टिक के ऊतक कैसेट कवर.
      नोट: इस बिंदु पर गोलभों का उपयोग सीधे किया जा सकता है या महीनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    14. पैराफिन में agarose-एम्बेडेड गोहरॉइड एम्बेड करें, 2-3 मीटर मोटी परत स्लाइड में अनुभाग और हेमेटोक्सीलिन और ईओसिन के साथ दाग या प्रतिरक्षा-हिस्टोलॉजिकल धुंधला के अधीन।

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Representative Results

स्फीरॉइड विकास परख, चित्र 1ए और चित्रा 1बीमें योजनाबद्ध रूप से सचित्र, एक 3 डी ट्यूमर में विरोधी कैंसर दवा उपचार के प्रभाव के विश्लेषण के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया गया नकल सेटिंग. जिस आसानी से स्रूपभियों का निर्माण होता है वह सेल लाइन विशिष्ट होती है, और कुछ कोशिका रेखाओं को सुसंगत गोलोइडबनानेके लिए आरबीएम के साथ पूरकता की आवश्यकता होती है। आरबीएम की सांद्रता जो कि गोलोभों की आकृति विज्ञान को गहराई से प्रभावित कर सकती है। जैसा कि चित्र 1ब् और चित्र 1Dमें दर्शाया गया है, 0 और 4% के बीच rBM की सांद्रता में परिवर्तन करने से गोलों के प्रकार पर निर्भर तरीके से गोलियों की संहतता और आकारिकी बदल जाती है। चित्र 1 सी दर्शाता है कि कैसे अप करने के लिए के अलावा 2.5% rBM SKBr-3 स्तन कैंसर कोशिकाओं में गोलभड़ गठन की अनुमति देता है, 2.5% rBM से ऊपर सांद्रता पर कोई और प्रभाव के साथ. इसके विपरीत, BxPC3 अग्नाशयी नलिका एडेनोकार्सीनोमा (पीडीएसी) कोशिकाओं, जो एक उपकला आकृति विज्ञान प्रदर्शन, स्वतः छोटे रूप में, कॉम्पैक्ट गोलाभ (चित्रा 1डी, ऊपरी, बाएँ पैनल). इस सेल प्रकार में, 1.5% या उससे ऊपर के लिए rBM एकाग्रता में वृद्धि, बाहर निकालता है और invaginations के साथ अधिक जटिल संरचनाओं के लिए गोलिता से एक अलग आकृतिविज्ञान परिवर्तन प्राप्त करता है, नलिका ट्यूबलर संरचना गठन की याद ताजा करती है। इसके विपरीत, दो अन्य पीडीएसी सेल लाइनों के लिए rBM के अलावा, MiaPaCa और Panc-1, जो एक अधिक mesenchymal phenotype है, ढीला सेलुलर समुच्चय तंग हो जाते हैं और अधिक कॉम्पैक्ट स्फीरॉइड फार्म की अनुमति देता है (चित्र 1डी, मध्य और कम पैनल)। इन परिणामों से पता चलता है कि rBM की सटीक राशि इष्टतम spheroid गठन में जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक सेल लाइन और हालत के लिए titrated किया जाना चाहिए.

दवा उपचार पर गोलोइड के भीतर सेल व्यवहार्यता का एक मात्रात्मक मूल्यांकन विरोधी कैंसर दवा उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक था। यहाँ वर्णित परख एक luciferin-luciferase आधारित परख है, जो एटीपी गोलिता के भीतर जीवित कोशिकाओं से जारी उपाय है. परख का सिद्धांत चित्र 2कमें स्पष्ट है। इस परख में उत्पन्न संदीपसंकेत को प्लेट रीडर द्वारा आसानी से अभिलिखित किया जाता है (चित्र 2क) और अन्य विधियों23द्वारा मापे गए व्यवहार्यता के साथ अच्छी तरह से संबंधित होता है . संगत सांद्रता श्रेणी में एटीपी सांद्रता तथा संदीप्ति के बीच रैखिक संबंध चित्र 2ठमें दर्शाया गया है जबकि चित्र 2ब् में 3D अफ़ीम ों के साथ उपचारित कोशिका मृत्यु का आकलन करने की परख की क्षमता दर्शायी गई है। विरोधी कैंसर चिकित्सा. प्रासंगिक श्रेणी में परख की रैखिकता का और मूल्यांकन करने के लिए, कोशिकाओं की संख्या के एक समारोह के रूप में दीप्ति संकेत के मानक वक्रों को स्थापित करने के लिए प्रयोग किए गए थे (चित्र 2ं व चित्र 2E ). इन परिणामों से संकेत मिलता है कि परख 3 डी अगोलीय संस्कृतियों में सेल व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए उपयुक्त है और यह सेल व्यवहार्यता की दवा प्रेरित नुकसान की जांच के लिए लागू है।

उपचार अवधि के दौरान हर दो से तीन दिनों में प्राप्त प्रकाश सूक्ष्म छवियों का एक संयोजन और सेल व्यवहार्यता का अंतिम मात्रात्मक मूल्यांकन गोलभों के विकास और आकृति विज्ञान के करीब पर्यवेक्षण के साथ-साथ इष्टतम उपचार के मूल्यांकन की अनुमति देता है खुराक. बाद के चित्र 3ए और चित्रा 3बीमें उदाहरण दिया गया है, जहां एमडीए-एमबी-231 स्तन कैंसर स्फिरॉइड में 50% कम सेल व्यवहार्यता के लिए आवश्यक खुराक निर्धारित करने के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया प्रयोग किया गया था। गोलोइड आकारिकी पर उपचार प्रभाव क्रमशः एमडीए-एमबी-231 और एमसीएफ-7 गोलभॉइड के लिए चित्र 3ब् और चित्र 3डी में कल्पना की जाती है। चुने हुए रसायन चिकित्सा कॉकटेल के साथ उपचार के दौरान, एमडीए-एमबी-231 स्फीरॉइड की compactness बढ़ जाती है, जबकि tamoxifen के साथ उपचार के दौरान, MCF-7 अफ़सोस तेजी से अस्त व्यस्त और असमान हो जाते हैं। दोनों ही स्थितियों में, 7 (एमडीए-एमबी-231) या 9 (एमसीएफ-7) दिनों के उपचार के बाद सेल व्यवहार्यता में स्पष्ट गिरावट दिखाई देती है (चित्र 3ई और चित्र 3च)। यह दोनों एक दृश्य और एक मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए की जरूरत को दर्शाता है एक गोलाभ सेल व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान पर उपचार मध्यस्थता प्रभाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से है कि इन मापदंडों अत्यधिक सेल और उपचार प्रकार विशिष्ट हैं.

सेल व्यवहार्यता परख के लिए एक पूरक के रूप में, पीआई के साथ मृत कोशिकाओं के धुंधला, जो झिल्ली को पार नहीं कर सकते हैं और इसलिए केवल दाग नेक्रोटिक या देर से apoptotic कोशिकाओं समझौता झिल्ली अखंडता के साथ, में मृत कोशिकाओं के एक त्वरित स्थानिक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है उपचार के लिए प्रतिक्रिया, embedding के समय लेने वाली प्रोटोकॉल के बिना, अनुभागऔर IHC. जैसा कि चित्र 4में सचित्र हैकि एक अवरोधक की बढ़ती एकाग्रता पर मृत कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था, इस मामले में, ना+/एच+ एक्सचेंजर 1 (NHE1) अवरोधक 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride (EIPA), हो सकता है Visualized. जैसा कि देखा गया है, नियंत्रण गोलोइड एक सीमित नेक्रोटिक/लेट एपोप्टोटिक कोर दिखाते हैं, जबकि मृत कोशिकाएं गोलोइड में वितरित की जाती हैं क्योंकि ईआईपीए की सांद्रता बढ़ जाती है।

विभिन्न उपचार के बाद apoptotic तनाव के सापेक्ष प्रेरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, गोलाभ lysed थे और पूर्ण लंबाई और cleaved पाली (एडीपी-रिबोज़) पॉलिमरेज (PARP) के लिए एसडीएस-पेज जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस और पश्चिमी blotting के अधीन। प्रतिनिधि परिणाम चित्र 4ठ और चित्र 4ब् में दिखाएगएहैं। इस प्रयोग में, एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं से गोलभड़ों को तैयार किया गया था जिसमें लैक्टेट-प्रोटोन कोट्रालेस्टर एमसीटी 4 या ना+, एचसीओ 3-सहपरिवहनNBCn1 को सिरना का उपयोग करके गिरा दिया गया था। नॉकडाउन का मूल्यांकन एमसीटी 4 और NBCn1 (अप्रकाशित डेटा) के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा किया गया था। जैसा कि देखा, MCT4 की दस्तक, लेकिन NBCn1 की नहीं, मजबूती से PARP दरार बढ़ जाती है, हमारे पिछले प्रदर्शन के अनुरूप है कि एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं में MCT4 के स्थिर knockdown vivo24में ट्यूमर विकास कम हो जाती है.

आगे उपचार के प्रभाव का विश्लेषण करने और विशिष्ट संकेतन के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए-, विकास गिरफ्तारी, और मौत रास्ते सक्रिय, गोलाभिक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के अलावा एम्बेडेड और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (IHC) विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। गोलोइड वर्गों के IHC विश्लेषण विशिष्ट एंटीबॉडी या सेल प्रसार, सेल चक्र और क्रमादेशित सेल मौत के मार्करों के उपयोग की अनुमति देता है, और spheroid में proliferative और apoptotic कोशिकाओं के स्थानिक व्यवस्था के एक दृश्य की सुविधा.

निमाइड प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध आकृति निभभयाज ों के लिए निरूपित है। एक एम्बेडेड स्फीरॉइड के लगभग 3 डिग्री मीटर मोटी माइक्रोटोम अनुभाग की एक प्रतिनिधि प्रकाश सूक्ष्म छवि चित्र 5खमें दिखाया गया है , और ट्यूमर दमन प्रोटीन p53 के लिए दाग एक गोलोइड की एक इम्यूनोफ्लोरेसी छवि (न्यूक्लिई का उपयोग कर दाग DAPI), चित्र 5Cके रूप में दिखाया गया है। सेल प्रसार मार्कर की-67 या च53 के लिए दागवाले DMSO और रसायन चिकित्सा-उपचारित गोलभों के उदाहरण क्रमशः चित्र 5D और चित्र 5Eमें दर्शाए गए हैं। रसायन चिकित्सा उपचार के antiproliferative प्रभाव के अनुरूप, की-67 सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या कीमोथेरेपी उपचार गोलभ की तुलना में DMSO नियंत्रण में अधिक से अधिक कर रहे हैं (चित्र 5डी)। इसके विपरीत, p53 अभिव्यक्ति सेल तनाव, apoptosis और विकास की गिरफ्तारी की स्थिति के दौरान वृद्धि हुई है, और इसके परिणामस्वरूप, p53 सना हुआ कोशिकाओं की संख्या DMSO नियंत्रण की तुलना में रसायन चिकित्सा इलाज गोलिभड़ों में काफी अधिक है (चित्र 5 ई)

ये परिणाम कैसे स्थानिक रूप से हल (पीआई धुंधला, IHC) या मात्रात्मक (पश्चिमी blotting) 3 डी spheroids में दवा उपचार प्रभाव पर जानकारी प्राप्त किया जा सकता है के उदाहरण दिखाते हैं.

Figure 1
चित्र 1 : सहज और rBM-मध्यस्थ अफ़ीरॉइड गठन. (क) बीबीएम के वैकल्पिक उपयोग के साथ अल्ट्रा-लो लगाव 96-वेल गोल नीचे प्लेटों का उपयोग करके गोलभड़ियों के गठन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। द्वारा चिह्नित अलग-अलग चरण (i-iii). (बी) हैंगिंग ड्रॉप विधि का उपयोग करते हुए स्फीरॉइड गठन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। अलग-अलग चरणों को एसकेबीआर-3 कोशिकाओं के आरबीएम-मध्यस्थ स्फीरॉइड गठन के प्रतिनिधि चित्रों द्वारा चिह्नित किया जाता है। कोशिकाओं अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह से गोल नीचे प्लेटों में rBM की बढ़ती सांद्रता के साथ बीज और 9 दिनों के लिए हो रहे थे. स्केल बार 100 [m. (n]3). (घ) BxPC-3, MiaPaCa और Panc-1 कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों अल्ट्रा कम लगाव 96-अच्छी तरह गोल नीचे प्लेटों में spheroid गठन के लिए बीज 0.5-2.5 % से rBM की सांद्रता के साथ. स्फ़ेरॉइड 4 दिनों के लिए बड़े हो गए थे। स्केल बार ] 250 $m. (n $3)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : सिद्धांत और सेल व्यवहार्यता परख का मूल्यांकन. (क) 3डी सेल व्यवहार्यता परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। व्यक्तिगत चरण (i-iv) द्वारा निरूपित। (ठ) एटीपी सांद्रता के एक समारोह के रूप में चमकदार संकेत। एटीपी के Dilutions एक 96 अच्छी तरह से थाली और सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा में चढ़ाया गया. 30 मिनट 405 एनएम पर संदीप् ति दर्ज की गई। 1 n.(C) व्यवहार्यता, luminscence के रूप में मापा, नियंत्रण और रसायन चिकित्सा का इलाज MCF-7 गोलभॉइड्स. MCF-7 कोशिकाओं अल्ट्रा कम लगाव दौर नीचे प्लेटों में बीज थे और 7 दिनों के लिए बड़े हो रहे थे. रसायन चिकित्सा उपचार (5 डिग्री सेल्सियस Cisplatin, 5 $M Doxorubicin और 30 एन एम 5-FU) दिन 2 और 4 पर लागू किया गया था। बार्स SD. 1 n.( D) Luminescent संकेत के साथ माध्य मानों का प्रतिनिधित्व करते हैं MCF-7 कोशिकाओं की संख्या के समारोह के रूप में seeded. MCF-7 कोशिकाओं संकेत सेल संख्या पर 96 अच्छी प्लेटों में बीज और 48 एच के लिए विकसित करने की अनुमति दी गई, जिसके बाद सेल व्यवहार्यता मापा गया था. त्रुटि पट्टियाँ SD. 1 n. (E) MDA-MB-231 कक्षों के लिए D में वर्णित का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : गोलभयाबाद आकारिकी और कोशिका व्यवहार्यता पर उपचार regimens के प्रभाव. (क) दिन 2, 4 और 7 पर एमडीए-एमबी-231 स्फीरॉइड्स के प्रतिनिधि चित्र। एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं अल्ट्रा कम लगाव दौर नीचे 96 अच्छी तरह से प्लेटों में बीज थे. कीमोथेरेपी की बढ़ती खुराक के साथ उपचार दिन 2 पर शुरू किया गया था, जिस समय सभी गोलभॉइड समान आकार के थे। पंक्तियाँ कीमोथेरेपी की बढ़ती खुराक पर गोलिकेड दिखाते हैं, और कॉलम संकेत खुराक पर दिन 2, 4, और 7 पर आकार के गोलभॉइड्स प्रतिनिधि दिखाते हैं। सबसे कम खुराक 18.75 एनएम Cisplatin था, 18.75 एनएम Doxorubicin, 0.0625 एनएम 5-Fluorouracil (5-FU) और इस खुराक दिखाया प्रत्येक छवि के लिए दोगुनी हो गई थी, 0.3 $M Cisplatin की एक अधिकतम खुराक में जिसके परिणामस्वरूप, 0.3 $M Doxorubicin और 2 एनएफयूएफयू. स्केल बार ] 100 डिग्री मी. (2 द)। (ख) एमडीए-एमबी-231 स्फीरॉइड्स की व्यवहार्यता, जो रसायन चिकित्सा उपचार के 7 दिनों के बाद संदीप् ति के रूप में मापी जाती है। सलाखों SEM. 2 n. (सी, डी) MDA-MB-231 (सी) और MCF-7 spheroids (डी) के दिन 2, 4, 7 और MCF-7 spheroids 9 के लिए प्रतिनिधि छवियों के साथ मतलब मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं. में बीज के रूप में बीज (एक) और या तो रसायन चिकित्सा के साथ इलाज किया (चेमो, 18.75 एनएम Cisplatin, 18.75 एनएम Doxorubicin, 0.0625 एनएम 5-FU) दिन पर 2 और 4 (सी ) या के साथ 2 $M Tamoxifen (Tam) दिन 2, 4 और 7 (डी) के साथ . स्केल बार र् 100 उ. (4 द और 3 द) क्रमशः। (ई, एफ) व्यवहार्यता, दीप्ति के रूप में मापा, दिन 7 और 9 के लिए (सी) और (डी), क्रमशः. शर्तों के बीच सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर के लिए परीक्षण करने के लिए एक unpaired छात्र टी परीक्षण किया गया था. p और 0.0001 को दर्शाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला और गोलभों का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। (क) 9 दिनों के उपचार के बाद पीआई-सस्ड एम सी एफ-7 स्फीरॉइड्स के प्रतिनिधि चित्र। MCF-7 कोशिकाओं अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह से प्लेटें 9 दिनों के लिए हो गई और दिन 2, 4 और 7 पर EIPA की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज में बीज थे. 9 दिन, गोलोइड पीआई के साथ दाग थे और छवियों को एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर प्राप्त किया गया था। स्केल बार ] 200 डिग्री मी. (1 द.) (ख) एसिड-बेस ट्रांसपोर्टरों के नॉकआउट/नॉकडाउन के बाद एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के प्रतिनिधि पश्चिमी blots। NHE1 MDA-MB-231 कोशिकाओं 12 में CRISPR/Cas9 द्वारा बाहर खटखटाया गया था और कोशिकाओं को बाद में MCT4 या NBCn1 के खिलाफ siRNA के साथ क्षणिक transfected थे, और lysed होने से पहले 9 दिनों के लिए spheroids के रूप में विकसित किया गया और एक एंटीबॉडी का उपयोग कर पश्चिमी blotting के अधीन कुल और c(c) PARP को पहचानने. (ग) सीआरपी के अनुपात को PARP प्रोटीन स्तर तक का परिमाणीकरण, नियंत्रण लोड करने के लिए सामान्यीकृत (जेड-एक्टिन)। (1 n)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 : नि:स्फीथिंग, एम्बेडिंग और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का स्फीरॉइड्स का विश्लेषण। (क) कारूपीय निरूपण का निरूपण का निरूपण। अलग-अलग चरणों को (i-vii) के रूप में चिह्नित किया गया है. (बी) एम्बेडेड एमडीए-एमबी-231 स्फीरॉइड की छवि। स्केल बार: 50 डिग्रीमी. (सी) कीमोथेरेपी उपचार एमडीए-एमबी-231 स्फीरॉइड के प्रतिनिधि छवि पी-53 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ आईएचसी विश्लेषण के अधीन। डैश्ड रेखाएँ अफ़ीमॉइड की परिधि दर्शाती हैं। स्केल बार - 20 डिग्री मी.(डी, ई) DMSO के प्रतिनिधि छवियों- या रसायन चिकित्सा का इलाज (ऊपरी और निचले पैनलों, क्रमशः) एमडीए-MB-231 गोलभड़। एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी प्लेटें, 7 दिनों के लिए बड़े हो गए और दिन 2 और 4 पर कीमोथेरेपी के साथ इलाज में बीज थे। 7 दिन, गोलाभ ों को आईएचसी द्वारा के-67 (डी) और च53 (ई) के विरुद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ विश्लेषण के बाद अंतःस्थापित किया गया था . सफेद बक्से ज़ूम छवियों का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल बार र् 20 उ उ उ दोनों आवर्धनों में (द$3)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

3 डी कैंसर सेल गोलाभ का उपयोग न केवल कैंसर विरोधी दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मूल्यवान और बहुमुखी उपकरण साबित हो गया है, लेकिन यह भी ट्यूमर में उन नकल शर्तों के तहत कैंसर सेल मौत और व्यवहार्यता के विनियमन में मशीनी अंतर्दृष्टि पाने के लिए सूक्ष्म पर्यावरण. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है के रूप में पहुँच, सेलुलर तेज, और chemothetic दवाओं के intracellular प्रभाव गहराई से ट्यूमर में भौतिक रासायनिक स्थितियों से प्रभावित कर रहे हैं, पीएच सहित, ऑक्सीजन तनाव, tortuosity, और शारीरिक और रासायनिक कोशिका बातचीत9,17. उदाहरण के लिए, extracellular पीएच की अम्लता, जो कई ठोस ट्यूमर25,26,27,28,29में कम के रूप में 6-6.5 के रूप में मूल्यों तक पहुँच सकते हैं, कमजोर बुनियादी chemotherapetic का कारण बनता है यौगिकों, जैसे doxorubicin, mitoxantrone और zwitterion paclitaxel, चार्ज किया जा करने के लिए. इससे ट्यूमर की कोशिकाओं में उनकी गति कम हो जाती है और बहुऔषध प्रतिरोध प्रोटीन जैसे च ग्लाइकोप्रोटीन30,31,32की गतिविधि को प्रभावित किया जा सकता है . इसके अलावा सेल प्रसार, जो सबसे chemothetic यौगिकों के प्रभाव के लिए निर्णायक है, आम तौर पर 2 डी की स्थिति की तुलना में 3 डी में कम है और इसलिए संभावना बेहतर 2 डी सेल संस्कृति8,33 में से ट्यूमर अगोभ में नकल की है ,34. अंत में, घने ट्यूमर microenvironment कई शारीरिक और घुलनशील संकेत संकेतों का मूल है intracellular संकेतन रास्ते सेल विकास, अस्तित्व और मौत को विनियमित निर्देशित. इस प्रकार, जब दवा प्रभावकारिता का विश्लेषण, 3 डी संस्कृति प्रणालियों vivo मॉडल में पर तैयार करने से पहले एक निर्णायक कदम हैं. 3 डी संस्कृति का एक प्रमुख दोष है, तथापि, 2 डी संस्कृति की तुलना में विश्लेषण की वृद्धि हुई जटिलता. हम यहाँ का वर्णन किया है सरल और अपेक्षाकृत सस्ती तकनीक के लिए गोलाभ गठन के लिए कैंसर सेल प्रकार की एक किस्म का उपयोग कर. हमने इस बात के उदाहरण दिए हैं कि किस प्रकार गोलाभ का अध्ययन किया गया प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और इस प्रकार के गोलाभ में सेल व्यवहार्यता, कोशिका मृत्यु, और संबद्ध संकेतन पथों पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने का वर्णन किया गया है। यहाँ वर्णित तीन मॉडलों के बीच कोई स्पष्ट वृद्धि या आकृतिक अंतर नहीं है। हमारे हाथों में, आकृति विज्ञान में भिन्नता फांसी ड्रॉप विधि का उपयोग कर थोड़ा अधिक हो सकता है, अभी तक इस विधि का एक लाभ यह है कि rBM की जरूरत नहीं है. हम यहाँ एक ही कैंसर सेल प्रकार से उत्पादित गोलिभों पर ध्यान केंद्रित किया है. तथापि, यह स्फीरोइड मॉडल सह-संवर्धन के लिए भी अनुकूल है, उदाहरण के लिए फाइब्रोब्लास्ट्स के साथ कैंसर कोशिकाओं, मोनोसाइट्स/मैक्रोफेज, एंडोथेलियल कोशिकाओं, और/या आदिकूट35,36,37. इस मॉडल के अन्य उन्नत अनुप्रयोगों 3 डी मुद्रित fluidic उपकरणों के साथ संयोजन एक अर्द्धपारगम्य झिल्ली के माध्यम से dosing की अनुमति शामिल है, मात्रात्मक प्रोटीओमिक रूपरेखा38के लिए कटाई के बाद.

जबकि, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, 3 डी गोलाभ में उगाई गई कोशिकाओं के phenotype आम तौर पर vivo ट्यूमर में की तुलना में बहुत बेहतर है कि 2 डी में विकसित कोशिकाओं की नकल करता है, हद तक जो इस तरह के गोलोॉइड वास्तव में विवि में इसी के प्रासंगिक मॉडल हैं कई पर निर्भर है कारकों और ध्यान से मूल्यांकन किया जाना है. पैरामीटर जो कितनी अच्छी तरह इस तरह के गोफिरों vivo हालत में नकल को प्रभावित करेगा ट्यूमर के सेलुलर संरचना और उसके रिश्तेदार ECM संरचना शामिल हैं. उदाहरण के लिए, आरबीएम जो हम प्रोटोकॉल में ECM के रूप में कार्यरत है यहाँ प्रदान उपकला के कैंसर के प्रारंभिक चरणों की नकल के लिए एक अच्छा विकल्प है, तहखाने झिल्ली उल्लंघन के समय के आसपास, अन्य ECM रचनाओं कुछ ट्यूमर के लिए और अधिक प्रासंगिक हो जाएगा प्रकार और चरणों. इसके अलावा, सेल सेल आसंजन के लिए क्षमता कैंसर सेल लाइनों के बीच व्यापक रूप से अलग है, सेल सेल और सेल मैट्रिक्स आसंजन प्रोटीन जैसे cadherins और integrins22की अपनी अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है.

यहाँ वर्णित के रूप में, गोलोइड विकास और आकृति विज्ञान आसानी से और गैर इनवेसिव हर 2-3 दिनों कम आवर्धन प्रकाशिकी और देखने के एक बड़े क्षेत्र के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नजर रखी जा सकती है. हालांकि, क्योंकि cytotoxic तनाव, इस तरह के रसायन चिकित्सा उपचार के रूप में, बगोलीय आकृति विज्ञान को बहुत अलग ढंग से प्रभावित करता है और, एक तरह से, सेल प्रकार और उपचार योजना के आधार पर, यह मूल्यांकन के लिए अकेले आकृति विज्ञान और परिधि पर भरोसा करने के लिए पर्याप्त नहीं है उपचार प्रभाव. उदाहरण के लिए, गोलभॉइड उपचार और उभरते सेल मौत के साथ ढीला हो सकता है, या सभी मौत नेक्रोटिक कोर में हो सकती है, जबकि सतह का पता लगाने से प्रभावित नहीं होता है। दोनों ही मामलों में, परिणाम एक गलत धारणा है कि गोलाभ में जीवित कोशिकाओं की संख्या उपचार द्वारा कम नहीं है हो सकता है. मात्रात्मक- और पूरे-स्फरॉइड तकनीक इसलिए उपचार प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं। कोशिका मृत्यु के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए, अम्ल फॉस्फेटाज परख, जिसके नाम का अर्थ हैसाइटोसोलिक अम्ल फॉस्फेटेज की गतिविधि को 21 नियोजित किया गया है। हालांकि, हमारे हाथों में, जबकि इस परख आम तौर पर अच्छी तरह से बीज कोशिकाओं की संख्या को दर्शाता है, यह पर्याप्त रूप से तेजी से उपचार प्रेरित सेल मौत (डेटा नहीं दिखाया गया) पर कब्जा नहीं है, की संभावना है क्योंकि एसिड फॉस्फेटाज सेल मौत के बाद कुछ समय के लिए सक्रिय रहता है. इसके अलावा, इस परख मध्यम है, जो विशेष रूप से नाजुक, रसायन चिकित्सा इलाज गोलभॉइड के साथ त्रुटि बढ़ जाती है की पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता है। सेल व्यवहार्यता परख यहाँ वर्णित है, जो सेलुलर एटीपी सामग्री पर आधारित है, अपने सरल और समय कुशल प्रोटोकॉल और उच्च reproducibility के आधार पर चुना गया था. इसके अलावा, इस परख संस्कृति माध्यम है जो एक लाभ है जब गोलोइड के साथ काम कर रहा है की पूरी तरह से हटाने की आवश्यकता नहीं है. के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया गया है, इस परख अच्छी तरह से दोनों सेल संख्या और उम्मीद रसायन चिकित्सा उपचार प्रभाव कब्जा. हालांकि, इस तकनीक का एक नुकसान है, जाहिर है, कि चयापचय परिवर्तन intracellular एटीपी सामग्री को कम करने ग़लती से एक कम सेल संख्या के रूप में दर्ज किया जा सकता है. इसलिए, अफ़रेइड मात्रा और आकारिकी, या पीआई धुंधला के समानांतर मूल्यांकन, परिणामों को मान्य करने के लिए सलाह दी जाती है।

पश्चिमी सोख्ता lysis पश्चिमी blotting द्वारा पीछा संकेत प्रक्रियाओं की स्थिति में अर्द्ध मात्रात्मक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, सेल मौत, विकास- और व्यवहार्यता रास्ते. पश्चिमी blotting का उपयोग जटिल है जब rBM गोलाभ तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, क्योंकि यह lysate प्रोटीन सामग्री का एक बड़ा अंश शामिल होगा, और अधिक महत्वपूर्ण बात, इसके आंशिक योगदान सेलुलर सामग्री को कम करने के साथ वृद्धि होगी रसायन चिकित्सा सेल मौत के दौरान। यह सिद्धांत रूप में centrifugation द्वारा rBM को दूर करने के लिए संभव है; हालांकि, यह एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि सभी rBM को पूरी तरह से हटाना मुश्किल है, और यह स्थितियों के बीच मात्रात्मक तुलना को रोक देगा। इस तरह के गोलिभयाज के लिए, और सामान्य रूप से मौत के रास्ते और प्रासंगिक संकेत नदेने के मूल्यांकन के लिए, embedding और IHC मजबूत उपकरण हैं. अन्य दृष्टिकोण पर विचार किया जा सकता है: लाइव confocal इमेजिंग के (relatively छोटे) बरकरार अगोलीय39| गोलिता का एक और दिलचस्प गुण यह है कि उनके बजाय नियमित रूप से "गेंद" आकार दिया, वे खुद को अच्छी तरह से गणितीय मॉडलिंग और गीला प्रयोगशाला प्रयोगों के बीच पुनरावृत्ति के लिए उधार दे, ऊपर उल्लेख के महत्व की समझ को बढ़ाने के लिए गोलाभकेदारों के भीतर ऑक्सीजन, पीएच, और पोषक तत्वों की ढाल, और, extrapolation द्वारा, ट्यूमर40,41. इस प्रकार, हालांकि बहुत अधिक जटिलता के महत्वपूर्ण 3 डी ट्यूमर मॉडल उभर रहे हैं, जटिल जैविक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निष्क्रिय पाड़ के आधार पर organotypic और organoid संस्कृतियों की एक विस्तृत श्रृंखला सहित, और, कम से कम नहीं, रोगी व्युत्पन्न xenografts42, spheroids क्योंकि उनके बेहतर जैविक प्रासंगिकता के एक महत्वपूर्ण उपकरण 2 डी संस्कृति की तुलना में रहते हैं, से निपटने के रिश्तेदार आसानी के साथ संयुक्त.

सारांश में, हम यहाँ विरोधी कैंसर उपचार के विश्लेषण के लिए सरल तरीकों की एक श्रृंखला प्रस्तुत कैंसर कोशिका व्यवहार्यता और 3 डी संस्कृति में मौत में परिवर्तन प्रेरित. कार्यरत कोशिकाओं के गुणों और जीव विज्ञान के आधार पर गोलिभदों की संरचना को संशोधित किया जा सकता है, और प्रस्तुत मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण खुराक-प्रतिक्रिया संबंधों का आकलन करने और अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए दोनों उपयोगी होते हैं संकेतन- और मौत के रास्ते शामिल.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए कैटरीन फ्रेंकलिन मार्क और एनेट Bartels के लिए आभारी हैं और चित्र 1D में प्रयोगों के प्रदर्शन के लिए AsbJr-Nielsen के लिए। यह काम Einar Willumsen फाउंडेशन, नोवो Nordisk फाउंडेशन, और Fondation Juchum (सभी SFP के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) Invitrogen # C10595  For staining nuclei
5-Fluorouracil (5-FU) Sigma-Aldrich #F6627 Component in chemotherapeutic treatment
5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) Life Technologies #E3111 Inhibitor of NHE1
Antibody against PARP and cPARP Cell signaling #9542 Used in western blotting
Antibody against Ki-67 Cell signaling #9449 Used for IHC
Antibody against p53 Cell Signaling  #2524  Used for IHC
Antibody against β-actin Sigma  A5441 Used in western blotting
Bactoagar BD Bioscience #214010 Used for agarose gel preparation
Benchmark protein ladder Invitrogen #10747-012 Used for SDS-PAGE
Bio-Rad DC Protein Assay kit Bio-Rad Laboratories #500-0113, #500-0114, #500-0115   Used for protein determination from lysates
Bürker chamber Marienfeld 610311 For cell counting 
BX63 epifluoresence microscope Olympus Used for fluorescent imaging
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega #G9681 Used for the cell viability assay
Cisplatin Sigma-Aldrich #P4394  Component in chemotherapeutic treatment
Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom,  Ultra-low attachment, With lid, Sterile Corning #4520 Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point
Corning 96 well, clear round bottom,  Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile Corning #7007 Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point
Criterion TGX Precast Gels Bio-Rad 5671025 Used for SDS-PAGE
Doxorubicin Abcam #120629 Component in chemotherapeutic treatment
FLUOStar Optima Microplate reader BMG Labtech Used for recording luminescence 
Formaldehyde  VWR Chemicals  #9713.1000  Used for cell fixation
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Gibco #A1413202 Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol.
Heat-inactivated FBS Sigma #F9665 Serum for growth media
ImageJ NIH Scientific Image analysis
Medim Uni-safe casette Medim Histotechnologie 10-0114 Used for storage of embedded spheroids
Mini protease inhibitor cocktail tablets Roche Diagnostics GmBH  # 11836153001 Used for lysis buffer preparation
MZ16 microscope Leica Used for light microscopic images
NuPAGE LDS 4x Sample Buffer  Invitrogen #NP0007 Used for western blotting
Pierce ECL Western blotting substrate Thermo scientific #32106 Used for western blotting
Ponceau S Sigma-Aldrich #P7170-1L Used for protein band staining
Prism 6.0 Graphpad Scientific graphing and statistical software
Propidium iodide (1mg/ml solution in water) Invitrogen  P3566 Light sensitive 
Sterile reservoirs, multichannel SPL lifesciences 21002 Used for seeding cells for spheroid formation
Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide  Menzel-Gläser #J3800AMNZ Microscope glass slide used for embedding
Tamoxifen Sigma-Aldrich #T5648 Used as chemotherapeutic treatment
Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes Bio-Rad #170-4159 Used for western blotting
Tris/Glycine/SDS running buffer  Bio-Rad  #161 0732 Used for SDS-PAGE
Trypsin-EDTA solution Sigma #T4174  Cell dissociation enzyme

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Rolver, M. G., Elingaard-Larsen, L.… More

Rolver, M. G., Elingaard-Larsen, L. O., Pedersen, S. F. Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells. J. Vis. Exp. (148), e59714, doi:10.3791/59714 (2019).

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