Summary
Qui, presentiamo diversi semplici metodi per valutare la vitalità e la morte negli sferoidi delle cellule tumorali 3D, che imitano i gradienti fisico-chimici dei tumori in vivo molto meglio della cultura 2D. Il modello sferoide, quindi, consente di valutare l'efficacia del farmaco controilcancro con una migliore traduzione in condizioni in vivo.
Abstract
Gli sferoidi tridimensionali delle cellule tumorali sono strumenti importanti sia per gli schermi di farmaci per il cancro che per ottenere informazioni meccanicistiche sulla biologia delle cellule tumorali. Il potere di questa preparazione sta nella sua capacità di imitare molti aspetti delle condizioni in vivo dei tumori pur essendo veloce, economico e versatile abbastanza per consentire uno screening relativamente ad alto throughput. Le condizioni di coltura degli sferoidi possono ricapitolare i gradienti fisio-chimici in un tumore, tra cui la crescente acidità extracellulare, l'aumento della lattato e la diminuzione della disponibilità di glucosio e ossigeno, dalla periferia sferoide al suo nucleo. Inoltre, le proprietà meccaniche e le interazioni cellula-cellula dei tumori in vivo sono in parte imitate da questo modello. Le proprietà specifiche e di conseguenza le condizioni ottimali di crescita, degli sferoidi 3D, differiscono ampiamente tra i diversi tipi di cellule tumorali. Inoltre, la valutazione della vitalità cellulare e della morte negli sferoidi 3D richiede metodi che differiscono in parte da quelli impiegati per le colture 2D. Qui descriviamo diversi protocolli per la preparazione di sferoidi 3D delle cellule tumorali e per l'uso di tali colture per valutare la vitalità e la morte delle cellule nel contesto della valutazione dell'efficacia dei farmaci anticancro.
Introduction
L'uso di modelli di sferoide multicellulari nella biologia del cancro è di diversi decenni1,2, ma ha guadagnato uno slancio sostanziale negli ultimi anni. In gran parte, ciò riflette una maggiore consapevolezza di quanto fortemente il fenotipo delle cellule tumorali dipenda dal loro microambiente e dalle condizioni di crescita specifiche. Il microambiente nei tumori solidi è fondamentalmente diverso da quello nei tessuti normali corrispondenti. Questo include condizioni fisico-chimiche come pH, tensione di ossigeno, così come la pressione interstiziale, gradienti di concentrazione di fattori solubili come sostanze nutritive, prodotti di scarto, e composti di segnalazione secreted (fattori di crescita, citochine). Inoltre, include l'organizzazione della matrice extracellulare (ECM), le interazioni cellula-cellula e la segnalazione intercellulare, e altri aspetti della particolare architettura tridimensionale (3D) del tumore3,4, 5,6. Le condizioni specifiche dei microambientali in cui esistono le cellule tumorali, influenzano profondamente il loro profilo di espressione genica e le proprietà funzionali, ed è chiaro che, rispetto a quello delle cellule coltivate in 2D, il fenotipo degli sferoidi 3D imita molto più da vicino quella dei tumori in vivo7,8,9,10,11. I modelli 2D, anche se impiegano ipossia, pH acido e alte concentrazioni di lattati per imitare aspetti noti del microambiente tumorale, non riescono ancora a catturare i gradienti dei parametri fisico-chimici che sorgono all'interno dei tumori, così come il loro tumore 3D architettura. D'altra parte, i modelli animali sono costosi, lenti ed eticamente problematici, e in generale hanno anche carenze nella loro capacità di ricapitolare le condizioni del tumore umano. Di conseguenza, gli sferoidi 3D sono stati applicati come modello di complessità intermedia negli studi di una vasta gamma di proprietà della maggior parte dei tumori solidi9,11,12,13, 14,15,16,17.
Un uso ampiamente impiegato di sferoidi 3D è nello screening dei saggi di efficacia della terapia anticancro9,18,19,20. Le risposte al trattamento sono particolarmente sensibili al microambiente tumorale, riflettendo sia l'impatto della tortuosità, la diffusione limitata, l'alta pressione interstiziale e il pH ambientale acido sulla somministrazione di farmaci, sia l'impatto dell'ipossia e di altri aspetti del microambiente sulla risposta alla morte cellulare9,17. Poiché l'ambiente all'interno di sferoidi 3D sviluppa intrinsecamente tutte queste proprietà7,8,9,10,11, impiegando colture di cellule 3D può migliorare sostanzialmente la traduzione dei risultati in condizioni in vivo, pur consentire uno screening efficiente e conveniente ad alto consumo della crescita netta. Tuttavia, la grande maggioranza degli studi sulla risposta farmacologica delle cellule tumorali sono ancora effettuati in condizioni 2D. Questo probabilmente riflette che, mentre alcuni saggi possono essere implementati relativamente facilmente per le colture cellulari 3D, molti, come i saggi di fattibilità, il gonfiore occidentale e l'analisi dell'immunofluorescenza, sono fatti molto più convenientemente in 2D che in 3D.
L'obiettivo del presente lavoro è quello di fornire saggi facilmente disponibili e protocolli precisi per l'analisi dell'effetto del trattamento con farmaci anticancro sulla vitalità e la sopravvivenza delle cellule tumorali in un ambiente di imitazione del tumore 3D. In particolare, forniamo e confrontiamo tre diversi metodi per la formazione di sferoidi, seguiti da metodi per analisi qualitative e quantitative di crescita, vitalità e risposta ai farmaci.
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Protocol
1. Generazione di Spheroids
- Preparazione delle sospensioni cellulari per la formazione di sferoidi
NOTA: diverse linee cellulari hanno proprietà di adesione molto diverse e il protocollo di formazione degli sferoidi più adatto deve essere stabilito in ogni caso. Abbiamo scoperto che le cellule MCF-7 e BxPC-3 sono adatte per la formazione spontanea di sferoidi, mentre MDA-MB-231, SKBr-3, Panc-1 e MiaPaCa richiedono l'aggiunta di membrana seminterrato ricostituita per formare con successo sferoidi. Solo le cellule MDA-MB-231 e BxPC-3 sono state impiegate per il protocollo di sospensione, tuttavia altre linee cellulari sono certamente applicabili.- Coltiva le cellule come monostrato fino alla confluenza del 70-80%.
- Lavare le cellule con fosfato bufferizzato salina (1x PBS, 5 mL per un 25 cm2 o 10 mL per un flacone da 75 cm 2), aggiungere l'enzima di dissociazione della cellula (0,5 mL per un 25 cm2 o 1 mL per un flacone da 75 cmda 2 cm) e incubare le cellule per 2-5 min a 37 gradi centigradi 5% di CO2 e 95% di umidità.
- Controllare il distacco cellulare al microscopio e neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare aggiungendo mezzo di crescita (6-10% siero a seconda della linea cellulare) ad un volume totale di 5 mL in un 25 cm2 o 10 mL per un flacone 75 cm2.
- Utilizzare una camera di Bérker per contare le celle e contare 8 quadrati nella preparazione della camera per cellula per ottenere un'elevata riproducibilità delle dimensioni degli sferoidi.
NOT: Di seguito sono riportati tre protocolli che descrivono un metodo diverso per la formazione di sferoidi. Protocollo 1.2 e 1.3 può essere utilizzato per tutti i successivi protocolli analitici presentati, mentre il protocollo 1.4 è più adatto per l'incorporamento e preparazione lisata. A seconda della linea cellulare, la formazione di sferoidi richiede 2-4 giorni, indipendentemente dal metodo utilizzato.
- Formazione spontanea di sferoidi
- Eseguire i passaggi 1.1.1-1.1.4.
- Diluire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL per ottenere 0,5-2 x 104 celle/mL (è necessario determinare la densità ottimale delle celle per ogni linea cellulare) (Figura 1A (ii)).
- Riempire l'anello esterno dei pozzetti con 1x PBS o mezzo di crescita per ridurre l'evaporazione dai pozzi rimanenti. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio sterile e, utilizzando una pipetta multicanale, erogare 200 l/well in un attacco ultra-basso 96 pozze inferiori rotonde (Figura 1A (iii)).
- Incubare la piastra in un'incubatrice a 37gradi centigradi con il 5% di CO 2, il 95% di umidità.
- Ogni 2-3 giorni acquisiscono immagini microscopiche leggere degli sferoidi.
NOT: Le immagini in questo articolo sono prese all'ingrandimento 11.5x, che è appropriato per la maggior parte degli sferoidi preparati utilizzando questi protocolli. - Ogni 2-3 giorni (dopo l'acquisizione delle immagini) sostituiscono 100 luna di mezzo (rimuovere 100 lofdeli del mezzo esaurito e sostituire con 100 luna di mezzo fresco.
NOT: Per evitare di rimuovere sferoidi durante la sostituzione del mezzo, si consiglia di inclinare un po 'la piastra rimuovendo lentamente il mezzo e ispezionare il mezzo aspirato nelle punte per gli sferoidi visibili prima di scartarlo.
- Ricostituito la formazione di sferoidi mediata dalla membrana sotterranea.
NOTA: è stata utilizzata la membrana di elevazione (LDEV) senza lattosioe prosciacqua (LDEV). rBM è sensibile alla temperatura e deve sempre essere tenuto sul ghiaccio, in quanto si coagula se raggiunge i 15 gradi centigradi. Scongelare il rBM sul ghiaccio sia durante la notte a 4 gradi centigradi o 2-4 h a temperatura ambiente (RT) prima della placcatura.- Scongelare rBM sul ghiaccio (vedi Tabella dei materiali).
- Conservare piastre e serbatoi (se avvolti singolarmente) sul ghiaccio prima dell'uso.
- Eseguire i passaggi 1.1.1-1.1.4.
- Riempire l'anello esterno dei pozzetti con 1x PBS o mezzo di crescita per ridurre l'evaporazione dai pozzi rimanenti. Diluire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL per ottenere 0,5-2 x 104 celle/mL (è necessario determinare la densità ottimale delle celle per ogni linea cellulare) (Figura 1A (ii)).
- Posizionare il tubo da 15 mL contenente la sospensione cellulare diluita sul ghiaccio (ad esempio, nel bicchiere di vetro) (Figura 1A (iia)).
- Trasferire le piastre refrigerate e i serbatoi sul cofano. Sciacquare i contenitori di plastica, riempirli di ghiaccio e trasferirli nel cofano per consentire alle piastre e ai serbatoi di essere posizionati sul ghiaccio durante l'intera procedura.
- Risospendere delicatamente rBM per garantire un gel omogeneo.
- Aggiungere 1-2% rBM (è necessario determinare la concentrazione ottimale per ogni linea cellulare) alle sospensioni cellulari refrigerate (Figura 1A (iib)).
- Invertire il tubo da 15 mL per garantire la corretta miscelazione di rBM e sospensioni cellulari prima di erogare la sospensione nella piastra.
- Trasferire la sospensione cellulare contenente rBM in un serbatoio sterile e erogare 200 .l/well in un attacco ultra-basso refrigerato a olio combustibile mediante una pipetta multicanale (Figura 1A (iii)).
NOT: Se si lavora con diverse sospensioni cellulari (ad esempio, più di una linea cellulare), è essenziale erogare ogni sospensione cellulare immediatamente dopo l'aggiunta di rBM per evitare gelling prematuro. - Centrifugare la piastra per 15 min a 750 x g utilizzando 'soft decent'/no frenata (se possibile, centrifugare a 4 gradi centigradi più a lungo, ma non un requisito per la formazione di sferoidi di successo), per garantire che le cellule siano raggruppate insieme quando il rBM indurisce, facilitando la formazione di un singolo sferoide.
- Incubare la piastra in un'incubatrice (37gradi centigradi, 5% CO 2, 95% di umidità).
- Ogni 2-3 giorni acquisiscono immagini microscopiche leggere per la valutazione della crescita degli sferoidi.
- Ogni 2-3 giorni sostituire 100 lofun (rimuovere 100 L e con 100 lofoni di mezzo fresco).
- Spheroids goccia appesa.
- Eseguire il passaggio 1.1.1-1.1.4.
- Diluire le cellule per ottenere una diluizione adeguata. Una diluizione pratica è di 50.000 cellule/mL.
- Rimuovere il coperchio di un piatto di coltura cellulare 10 cm2 e posizionarlo in modo che si affaccia verso l'alto. Aggiungere 6 mL di 1x PBS al piatto (Figura 1B (i)).
- Versare la sospensione cellulare in un serbatoio sterile e posizionare con cura fino a 30 gocce di 40 -L di sospensione cellulare sul coperchio del pinto di coltura cellulare utilizzando una pipetta multicanale (Figura 1B (ii)), con conseguente concentrazione di 2.000 cellule / goccia. Evitare di posizionare le gocce troppo vicino al bordo del coperchio in quanto queste gocce hanno maggiori probabilità di perdere tensione superficiale quando si inverte il coperchio nel passaggio successivo.
- Invertire il coperchio in un movimento rapido ma controllato e posizionarlo sopra il 1x piatto di coltura cellulare contenente PBS (Figura 1B (iii)).
- Mettete il piatto in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e il 95% di umidità senza disturbare le gocce e lasciatele crescere per 4-6 giorni.
- Se da utilizzare per le tali proteine o l'incorporamento, sferoidi da piscina rimuovendo il coperchio e inclinarlo, al fine di lavare le gocce con 1 mL di mezzo riscaldato. Trasferire il mezzo risultante contenente sferoidi in un tubo da 1,5 mL e lasciarli depositare sul fondo del tubo. Procedere come descritto in 4.4 e 6.2.2 per i lismi proteici e l'incorporamento, rispettivamente.
2. Trattamento farmacologico degli sferoidi
NOT: Il trattamento farmacologico a lungo termine può essere applicato agli sferoidi al fine di verificare gli effetti di un farmaco di interesse. Prima di iniziare il trattamento farmacologico, si consiglia di eseguire un esperimento di risposta alla dose del farmaco(dei) al fine di trovare una dose appropriata per il trattamento sperimentale. Le dosi devono essere basate sulla determinata IC50/Ki del farmaco e variano da circa 0.2x-10x di questo valore.
- Impostare 6-12 sferoidi per la condizione desiderata come descritto in 1.2 o 1.3 e collocare nell'incubatrice (37 C, 5% CO2, 95% di umidità) per 2 giorni.
- Il secondo giorno, scatta immagini microscopiche degli sferoidi.
- Preparare le prime dosi di trattamento (dopo l'acquisizione delle immagini).
NOT: La prima concentrazione di trattamento deve essere due volte la concentrazione finale desiderata in quanto la soluzione sarà diluita 1:2 oltre al pozzo contenente 100 . Intervalli di trattamento farmacologico suggeriti (dipenderà dall'emivita della droga): Giorno 2, 4 e 7. - Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 l'l di mezzo e sostituirlo con 100 - L di farmaco contenente mezzo.
- Rimettere la piastra di 96 pozzeri nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 e 95% di umidità e ripetere 2,3 e 2,4 nei giorni di trattamento scelti, ma ora senza raddoppiare la dose per ottenere la dose finale corretta.
- L'ultimo giorno del programma di protocollo/trattamento, è possibile eseguire uno o più dei seguenti saggi.
3. Esempio di realizzo per la vitalità delle cellule per gli sferoidi
- Impostare 4-6 sferoidi per la condizione desiderata, come descritto in 1.2 o 1.3 e collocare nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 e 95% di umidità.
NOT: In questo caso, il saggio di fattibilità cellulare è stato eseguito il giorno 7 o 9, dopo aver monitorato la crescita dello sferoide ogni 2-3 giorni con microscopia leggera come descritto sopra (punto 1.2.5 e 1.3.13). - Scongelare il reagente di saggio di fattibilità (vedi Tabella deimateriali) e lasciarlo equilivitare a RT prima dell'uso.
- Mescolare delicatamente invertendo per ottenere una soluzione omogenea.
- Prima di eseguire il pesimo, rimuovere il 50% del mezzo di coltura dagli sferoidi (100 l).
- Aggiungere il reagente di fattibilità delle cellule a ogni pozzo con un rapporto 1:3 alla quantità di mezzo presente nel pozzo (Figura 2A (i)) Per una piastra di 96 pozze, aggiungere 50 l di reagente a 100 .
- Mescolare vigorosamente il contenuto per 5 min per indurre la lisi cellulare (Figura 2A (ii)).
- Incubare per 25 min a RT per stabilizzare il segnale luminescente (Figura 2A (iii)).
- Registrare il segnale luminescente (Figura 2A (iv)).
4. Preparazione di proteine lisates per Western Blotting da 3D Spheroid Cultures
NOT: Quando si raccolgono gli sferoidi, si consiglia di utilizzare una pipetta P200 e tagliare la fine della punta per consentire un'apertura più grande e quindi una cattura più facile degli sferoidi senza disturbare la loro struttura.
- Per ogni condizione, piscina un minimo di 12, idealmente 18-24 sferoidi (a seconda delle dimensioni dello sferoide) in un tubo da 1,5 mL (evitare tubi da 2 mL, come i prossimi passi diventeranno più difficili a causa del loro fondo meno punta).
NOT: Se la quantità di mezzo supera 1,5 mL prima di aver raccolto tutti gli sferoidi, lasciare che gli sferoidi raccolti si stabiliscano sul fondo (accade molto rapidamente, la centrifugazione non necessaria) e scartare la metà del volume del tubo prima di continuare a raccogliere il sferoidi rimanenti. - Posizionare i tubi sul ghiaccio e lasciare che gli sferoidi si depositino sul fondo del tubo da 1,5 mL.
- Passare dal laboratorio di cellule sterili al laboratorio regolare.
- Lavare gli sferoidi due volte in 1 mL di 1x PBS ghiacciato. Lasciare che gli sferoidi si stabilizzino prima di rimuovere 1x PBS tra ogni passo di lavaggio.
- Aspirare il più 1x PBS possibile senza disturbare o rimuovere gli sferoidi.
- Aggiungere 5 l'l ofst lis (LB) con inibitori di fosforo e proteasi, per sferoide (ad es., 10 sferoidi - 50 LB).
- Ripetere gli intervalli di vortice seguiti da spin down fino a quando gli sferoidi non vengono sciolti. Eseguire un ciclo di vortice per 30 s seguito da centrifugazione (un giro rapido utilizzando una centrifuga tavolo è sufficiente) per 10 s per circa 5-10 min a seconda delle dimensioni e la compattezza degli sferoidi.
NOT: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Mantenere i lisati a -20 gradi centigradi fino a procedere con la sonicazione, l'omogeneizzazione e la determinazione delle proteine come in un protocollo di lisato di proteine 2D standard, seguito da gonfiore occidentale utilizzando protocolli standard.
5. Iodide propidio (PI) Colorazione degli Sferoidi
- Impostare 3-6 sferoidi per condizione desiderata come descritto in 1.2 o 1.3 e posizionare nell'incubatrice a 37 sC con 5% di CO2 e 95% umidità.
- In un laboratorio sterile di coltura cellulare, riscaldare 1x PBS a 37 gradi centigradi.
- Fare una soluzione PI di 4 M diluindo la soluzione stock in 1x PBS: Diluire uno stock di 1 mg/mL aqueous di PI 1:350 in 1x PBS.
NOT: Questa concentrazione sarà ulteriormente dimezzata dopo l'aggiunta della soluzione ai pozzi dando una concentrazione finale di 2 M. 100 L di questa soluzione è necessaria per ogni pozzo contenente uno sferoide.
ATTENZIONE: Propidium iodide (PI) deve essere maneggiato in un cofano fumatore e indossare guanti. PI è sensibile alla luce. Proteggere dalla luce durante la manipolazione. - Rimuovere 100 l' del mezzo da ogni pozzo nella piastra del pozzo 96 senza rimuovere gli sferoidi.
- Lavare il mezzo rimanente aggiungendo 100 luna di 1x PBS riscaldata a tutti i pozze seguite dalla rimozione di 100 l del liquido nei pozze. Ripetere questo passaggio di lavaggio 3 volte.
- Aggiungete 100 l della soluzione PI ad ogni pozzo, coprite la piastra in un foglio di alluminio e mettetela in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO2 e 95% di umidità per 10-15 min.
- Ripetere i 3 passaggi di lavaggio descritti in 4.5 per lavare la soluzione PI, al fine di ridurre il segnale di fondo durante l'imaging.
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza per immaginare gli sferoidi. Per valutare la vitalità delle cellule nel nucleo sferoide prendere z-stacks per ottenere immagini con profondità variabili dello sferoide.
NOT: Si consiglia una dimensione di passo di circa 18-35 m tra ogni fetta a seconda delle dimensioni dello sferoide, dando circa 11-18 pile per sferoide. Gli stack z possono essere elaborati in ImageJ utilizzando la funzione z-projection, che può combinare tutti gli z-stack in un'unica immagine finale, fornendo una panoramica della colorazione in tutto lo sferoide (per ulteriori linee guida sull'uso di ImageJ a questo scopo, vedi (https://imagej.net/Z-functions).
6. Incorporamento di Spheroid 3D
-
Preparare il gel di agarose in cui sono incorporati gli sferoidi (necessario solo la prima volta che si esegue il protocollo).
- Mescolare 1 g di bactoag in 50 mL di ddH2O.
- Riscaldare lentamente in forno a microonde fino a quando il bactoagar si è dissolto e si è formato un gel omogeneo. Non far bollire il gel.
- Mantenere il bactoragar caldo in un bagno d'acqua a 60 gradi centigradi.
- Mantenere a 4 gradi centigradi tra un esperimento e l'altro.
-
Incorporamento di sferoidi.
- Il primo giorno per ogni condizione, mettere in piscina un minimo di 12 sferoidi in un tubo da 1,5 mL.
- Lavare una volta con 1 mL di 1x PBS ghiacciato.
- Per riparare gli sferoidi, aggiungere 1 mL del 4% di paraformaldeide.
NOT: La manipolazione della paraformaldeide deve essere eseguita in una cappa di fumi. - Lasciarli incubare per 24 h a RT.
- Il giorno 2, riscaldare con cura il gel di agarose mettendolo in un becher pieno d'acqua in un forno a microonde. Assicurarsi che il gel non bolle! Mantenere caldo in una piastra di riscaldamento panca, a 60 gradi centigradi fino all'uso.
- Lavare gli sferoidi due volte con 1 mL di 1x PBS ghiacciato.
- Aspirate la maggior parte del 1x PBS (lasciando circa 100 L a questo punto è pratico per la gestione degli sferoidi).
- Preparare una pipetta da 20 l,l tagliando la punta della pipetta in pendenza, per ottenere una punta più puntista con un foro più grande (vedi figura).
NOT: La parte successiva deve essere fatta rapidamente per garantire un trasferimento ottimale dello sferoide ed evitare la solidificazione della caduta di gel. Se non è disponibile alcun blocco di riscaldamento, si consiglia di catturare prima gli sferoidi e poi far cadere l'agarose (cioè, cambiando l'ordine dei punti 6.2.9 e 6.2.10). - Fare una goccia di gel agarose su un vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino su un blocco riscaldante caldo per evitare che l'agarose si solidifica.
- Utilizzando la punta della pipetta modificata (vedi 6.2.8), prendi il maggior numero possibile di sferoidi in un volume di 15-20 l.
- Iniettare con cura il 1x PBS contenente sferoide da 15 20 litri al centro della goccia di gel di agarose senza toccare il vetrino del microscopio.
NOT: Questo è un punto un po' difficile. Gli sferoidi andranno persi se la punta della pipetta tocca il vetrino del microscopio quando si iniettano gli sferoidi nella goccia di gel. Si consiglia di praticare l'intero processo di fare la goccia di agarose e iniettare gli sferoidi iniettando un liquido colorato nella goccia. Ciò consentirà la visualizzazione di una potenziale penetrazione attraverso la goccia, in quanto il liquido colorato fuoriesce sulla diapositiva. - Lasciare indurire il gel di agarose incubando per 5-10 min a RT o a 4 gradi centigradi. Una volta che la goccia di gel si è solidificata un po '(ma è ancora piuttosto morbido), spingere con attenzione la goccia di gel dal vetrino del microscopio in una cassetta di tessuto di plastica con un bisturi.
- Coprire le cassette dei tessuti plastici nel 70% di etanolo.
NOT: A questo punto gli sferoidi possono essere utilizzati direttamente o conservati per mesi. - Incorporare lo sferoide incorporato in paraffina, la sezione in scivoli di strato spessi 2-3 m e la macchia con ematossialina ed eosina o soggetti a colorazione immuno-istologica.
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Representative Results
I saggi di crescita dello spheroid basati sul protocollo di formazione degli sferoidi schematicamente illustrati nella Figura 1A e nella Figura 1Bsono stati utilizzati come punto di partenza per l'analisi degli effetti dei trattamenti farmacologici anti-cancro in un tumore 3D imitando l'impostazione. La facilità con cui si formano sferoidi è specifica della linea cellulare, e alcune linee cellulari richiedono il completamento con rBM al fine di formare sferoidi coerenti22. La concentrazione di rBM aggiunto può influenzare profondamente la morfologia degli sferoidi. Come mostrato nella Figura 1C e Figura 1D, la concentrazione di rBM tra 0 e 4% altera la compattezza e la morfologia degli sferoidi in modo dipendente dal tipo di cellula. Figura 1 C dimostra come l'aggiunta fino al 2,5% di rBM consenta la formazione di sferoidi nelle cellule del cancro al seno SKBr-3, senza ulteriori effetti a concentrazioni superiori al 2,5% rBM. Al contrario, le cellule BxPC3 pancreatiche contraduttrici (PDAC), che presentano una morfologia epiteliale, formano spontaneamente sferoidi piccoli e compatti (Figura 1D, superiore, pannello sinistro). In questo tipo di cellula, l'aumento della concentrazione di rBM all'1,5% o superiore provoca un netto cambiamento morfologico da sferoide a strutture più contorte con sportrusioni e invaginazioni, che ricordano la formazione della struttura tubolare dutale. Al contrario, l'aggiunta di rBM ad altre due linee cellulari PDAC, MiaPaCa e Panc-1, che hanno un fenotipo più mesenchymal, permette agli aggregati cellulari sciolti di diventare più stretti e formare sferoidi più compatti (Figura 1D, medio e inferiore di pannelli). Questi risultati mostrano che la quantità precisa di rBM risultante nella formazione ottimale di sferoidi deve essere titolata per ogni linea cellulare e condizione.
Per valutare l'effetto dei trattamenti farmacologici anti-cancro è stata necessaria una valutazione quantitativa della vitalità cellulare all'interno degli sferoidi durante il trattamento farmacologico. L'esempio qui descritto è un saggio basato sulla luciferina-luciferasi, che misura l'ATP rilasciato dalle cellule vive all'interno di sferoidi. Il principio del saggio è illustrato nella figura 2A. Il segnale luminescente generato in questo saggio è facilmente registrato da un lettore di lamiere (Figura 2A) e correla bene con la fattibilità misurata con altri metodi23. La relazione lineare tra la concentrazione ATP e la luminescenza nell'intervallo di concentrazione pertinente è illustrata nella Figura 2B, mentre la figura 2C mostra la capacità dell'analisi di valutare la morte delle cellule negli sferoidi 3D trattati con terapia anti-cancro. Al fine di valutare ulteriormente la linearità del saggio nell'intervallo in questione, sono stati effettuati esperimenti per stabilire curve standard del segnale luminescente in funzione del numero di cellule (Figura2D e Figura 2E ). Questi risultati indicano che il test è adatto per stimare la vitalità cellulare nelle colture di sferoidi 3D e che è applicabile per studiare la perdita di vitalità cellulare indotta da farmaci.
Una combinazione di immagini microscopiche leggere acquisite ogni due o tre giorni, durante il periodo di trattamento e una valutazione quantitativa finale della vitalità cellulare consente una stretta supervisione della crescita e morfologia sferoidi, nonché la valutazione del trattamento ottimale dose. Quest'ultimo è esemplificato nella Figura 3A e nella Figura 3B, in cui è stato eseguito un esperimento di risposta alla dose per determinare la dose necessaria per ridurre al 50% la vitalità cellulare negli sferoidi del cancro al seno MDA-MB-231. Gli effetti del trattamento sulla morfologia sferoide sono visualizzati rispettivamente nella Figura 3C e nella Figura 3D per gli sferoidi MDA-MB-231 e MCF-7. Durante il trattamento con il cocktail chemioterapico scelto, la compattezza degli sferoidi MDA-MB-231 aumenta, mentre durante il trattamento con tamoxifene, gli sferoidi MCF-7 diventano sempre più sfilacciati e irregolari. In entrambi i casi, un netto calo della vitalità cellulare è visibile dopo 7 (MDA-MB-231) o 9 (MCF-7) giorni di trattamento (Figura 3E e Figura 3F). Ciò dimostra la necessità di una valutazione visiva e quantitativa degli effetti mediati dal trattamento sulla vitalità e la morfologia delle cellule sferoidi, nonché che questi parametri sono altamente specifici di tipo cellula e trattamento.
Come supplemento al saggio di fattibilità cellulare, la colorazione delle cellule morte con PI, che non può attraversare la membrana e quindi solo le macchie necrotiche o apoptotiche tardive con integrità della membrana compromessa, consente una rapida valutazione spaziale delle cellule morte risposta al trattamento, senza il lungo protocollo di incorporamento, sezionamento e IHC. Come illustrato nella Figura 4A la disposizione spaziale delle cellule morte suuna crescente concentrazione di un inibitore, in questo caso, l'inibitore 5-(N-ethyl-N-isopropile)-amiloride (EIPA) di Na Visualizzato. Come si è visto, gli sferoidi di controllo mostrano un nucleo apoptotico necrotico/tardivo limitato, mentre le cellule morte sono distribuite in tutto lo sferoide con l'aumentare della concentrazione di EIPA.
Al fine di quantificare l'induzione relativa dello stress apoptotico a seguito di diversi trattamenti, gli sferoidi sono stati sottoposti a elettroforesi gel SDS-PAGE e gonfiore occidentale per polimerasi a lunghezza intera e cleosa (PARP) a policleghi e slitta (PARP). I risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 4B e Nella Figura 4C. In questo esperimento, gli sferoidi sono stati preparati da cellule MDA-MB-231 incui il cotrasporto latato-protone MCT4 o il cotrasporto Na , HCO3- cotransporter NBCn1 sono stati abbattuti utilizzando il siRNA. L'abbattito è stato valutato dal blotting occidentale per MCT4 e NBCn1 (dati inediti). Come si è visto, il knockdown di MCT4, ma non di NBCn1, aumenta robustamente scissione PARP, coerente con la nostra precedente dimostrazione che l'abbattimenti stabili di MCT4 nelle cellule MDA-MB-231 diminuisce la crescita del tumore in vivo24.
Per analizzare ulteriormente gli effetti del trattamento e ottenere informazioni sulle specifiche vie di segnalazione, arresto della crescita e vie di morte attivate, gli sferoidi possono oltre all'analisi delle macchie occidentali essere incorporati e sottoposti ad analisi immunoistochimica (IHC). L'analisi IHC delle sezioni degli sferoidi consente l'uso di anticorpi o marcatori specifici della proliferazione cellulare, del ciclo cellulare e della morte cellulare programmata e facilita la visualizzazione della disposizione spaziale delle cellule proliferanti e apoptotiche nello sferoide.
Una figura schematica del protocollo di incorporamento per l'analisi IHC degli sferoidi è presentata nella Figura 5A. Un'immagine microscopica luminosa rappresentativa di una sezione di microtomi spessa circa 3 m di uno sferoide incorporato è mostrata nella Figura 5Be un'immagine immunofluorescenza di uno sferoide macchiato per la proteina soppressore del tumore p53 (nuclei macchiati utilizzando DAPI), è mostrato come Figura 5C. Esempi di Sferoidi trattati con DMSO e chemioterapia macchiati per il marcatore di proliferazione cellulare Ki-67 o per p53 sono riportati rispettivamente nella Figura 5D e Figura 5E. Coerentemente con l'effetto antiproliferativo del trattamento chemioterapico, il numero di cellule positive Ki-67 è maggiore nel controllo DMSO rispetto allo sferoide trattato con chemioterapia (Figura 5D). Al contrario, l'espressione p53 è aumentata durante le condizioni di stress cellulare, apoptosi e arresto della crescita, e di conseguenza, il numero di cellule color p53 è notevolmente più elevato negli sferoidi trattati con chemioterapia rispetto ai controlli DMSO (Figura5 E).
Questi risultati illustrano esempi di come si possano ottenere informazioni spaziali (PI coloring, IHC) o quantitative (blotting occidentali) sugli effetti del trattamento farmacologico negli sferoidi 3D.
Figura 1 : formazione spontanea e mediata da sferoidi. (A) Rappresentazione schematica della formazione di sferoidi utilizzando un attaccamento ultra-basso allegato 96 pozze tonde, con uso opzionale di rBM. Singoli passi contrassegnati da (i-iii). (B) Rappresentazione schematica della formazione di sferoidi utilizzando il metodo di goccia appesa. I singoli passi sono contrassegnati da (i-iii) (C) Immagini rappresentative della formazione di sferoidi mediate da rBM di cellule SKBr-3. Le cellule sono state semiin attaccamento ultra-basso 96-bene piastre inferiori rotonde con aumentando le concentrazioni di rBM e coltivato per 9 giorni. Barra della scala di 100 m. (n. 3). (D) Immagini rappresentative delle cellule BxPC-3, MiaPaCa e Panc-1 seminato per la formazione di sferoidi in piastre inferiori rotonde a 96 pozze l'attacco con concentrazioni di rBM da 0,5-2,5 %. Gli sferoidi sono stati coltivati per 4 giorni. Barra della scala: 250 m. (n. 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Principio e valutazione del saggio di fattibilità cellulare. (A) Rappresentazione schematica del saggio di fattibilità delle cellule 3D. Singoli passi denotati da (i-iv). (B) Segnale luminescente in funzione della concentrazione ATP. Le diluizioni di ATP sono state placcate in una piastra di 96 pozze e il reagente di vitalità cellulare aggiunto ad ogni pozzo. La luminescenza è stata registrata dopo 30 min a 405 nm. 1 n. (C) Viability, misurata come luminescenza, di controllo e sferoidi MCF-7 trattati con chemioterapia. Le cellule MCF-7 sono state semiate in piastre rotonde di attacco ultra-basse e sono state coltivate per 7 giorni. Il trattamento chemioterapico (5 Cisplatin, 5 Doxorubicin e 30 nM 5-FU) è stato applicato il giorno 2 e 4. Le barre rappresentano valori medi con segnale luminescente SD. 1 n. (D) in funzione del numero di semidici di celle MCF-7. Le cellule MCF-7 sono state semiate in piastre di 96 pozze al numero di cellulare indicato e hanno permesso di crescere per 48 h, dopo di che è stata misurata la vitalità cellulare. Le barre di errore rappresentano SD. 1 n. (E) Come descritto in D per le celle MDA-MB-231. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Effetti dei regimi di trattamento sulla morfologia degli sferoidi e sulla vitalità cellulare. (A) Immagini rappresentative degli sferoidi MDA-MB-231 il giorno 2, 4 e 7. Le cellule MDA-MB-231 sono state semimelate in piastre di fondo rotonde ultra-basse. Il trattamento con dosi crescenti di chemioterapia è stato iniziato il giorno 2, a quel tempo tutti gli sferoidi erano di dimensioni simili. Le righe mostrano sferoidi a dosi crescenti di chemioterapia, e le colonne mostrano sferoidi rappresentativi delle dimensioni al giorno 2, 4 e 7 alla dose indicata. La dose più bassa era di 18,75 nM Cisplatin, 18,75 nM Doxorubicin, 0,0625 nM 5-Fluorouracil (5-FU) e questa dose è stata raddoppiata per ogni immagine mostrata, con una dose massima di 0,3 cisplatini, 0,3 Doxorubicin e 2 nM 5-FU. Barra della scala: 100 m. (2 n). (B) Vitalità degli sferoidi MDA-MB-231, misurati come luminescenza, dopo 7 giorni di trattamento chemioterapico. Le barre rappresentano valori medi conIMMAGINI rappresentative di MDA-MB-231 (C) e MCF-7 sferidi (D) il giorno 2, 4, 7 e per gli sferoidi MCF-7 9. Le cellule seminata come in (A) e trattate con la chemioterapia (Chemo, 18.75 nM Cisplatina, 18.75 nM Doxorubicin, 0.0625 nM 5-FU) il giorno 2 e 4 (C) o con 2 Tamoxfien M (Tam) il giorno 2, 4 e 7 (D). Barra della scala : rispettivamente 100 m. (4 n e 3 n). (E, F) La viabilità, misurata come luminescenza, il giorno 7 e 9 per (C) e (D). Per verificare la differenza statisticamente significativa tra le condizioni è stato eseguito un test t di Student non accoppiato. indica p < 0.0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : colorazione ai iodi di propidio e analisi macchia occidentale degli sferoidi. (A) Immagini rappresentative di sferoidi MCF-7 macchiati di PI dopo 9 giorni di trattamento. Le cellule MCF-7 sono state semiate in fissaggio ultra-basso 96 piastre di pozzo coltivate per 9 giorni e trattate con aumentazioni di EIPA il giorno 2, 4 e 7. Il giorno 9, gli sferoidi sono stati macchiati con PI e le immagini sono state acquisite su un microscopio di epifluorescenza. Barra della scala : 200 m. (1 n.) (B) Macchie occidentali rappresentative di cellule MDA-MB-231 dopo knockout/knockdown di trasportatori a base di acido. NHE1 è stato eliminato da CRISPR/Cas9 nelle cellule MDA-MB-231 12 e le cellule sono state successivamente transinfettate transitoriamente con siRNA contro MCT4 o NBCn1, e coltivate come sferoidi per 9 giorni prima di essere lised e sottoposte a gonfiore occidentale utilizzando un anticorpo riconoscimento totale e cleaved (c)PARP. (C) Quantificazione del rapporto tra il livello di cPARP e il livello di proteina PARP, normalizzato al controllo del carico (z-actin). (1 n). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : analisi di fissaggio, incorporamento e immunoistochimica degli sferoidi. (A) Rappresentazione schematica del protocollo per l'incorporamento di sferoidi. I singoli passi sono contrassegnati come (i-vii). (B) Immagine dello sferoide MDA-MB-231 incorporato. Barra della scala: 50m. (C) Immagine rappresentativa dello sferoide MDA-MB-231 trattato dalla chemioterapia sottoposto all'analisi IHC con anticorpi contro il p-53. Le linee tratteggiate mostrano la circonferenza dello sferoide. Barra di scala - 20 m. (D,E) Immagini rappresentative di DMSO- o chemioterapia trattati (rispettivamente pannelli superiore e inferiore) Sferoidi MDA-MB-231. Le cellule MDA-MB-231 sono state semiate in fissaggio ultra-basso 96 pozze di fissaggio, coltivate per 7 giorni e trattate con chemioterapia il giorno 2 e 4. Il giorno 7, gli sferoidi sono stati incorporati seguita da analisi da IHC con anticorpi primari contro Ki-67 (D) e p53 (E). Le caselle bianche rappresentano le immagini di zoom. Barra di scala: 20 m in entrambi gli ingrandimenti, (n. 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'uso di sferoidi delle cellule tumorali 3D si è dimostrato uno strumento prezioso e versatile non solo per lo screening farmacologico anticancro, ma anche per ottenere informazioni meccanicistiche sulla regolazione della morte e della vitalità delle cellule tumorali in condizioni che imitano quelle nel tumore Microambiente. Ciò è particolarmente importante in quanto l'accessibilità, l'assorbimento cellulare e gli effetti intracellulari dei farmaci chemioterapici sono profondamente influenzati dalle condizioni fisico-chimiche del tumore, tra cui pH, tensione di ossigeno, tortuosità e interazioni chimiche cellule-cellule9,17. Ad esempio, l'acidità del pH extracellulare, che può raggiungere valori a partire da 6-6,5 in molti tumori solidi25,26,27,28,29, provoca debolmente base chemioterapeutico composti, come la doxorubina, la mitoxantrone e il paclitaxel zwitterion, da addebitare. Questo riduce il loro assorbimento nelle cellule tumorali e può influenzare l'attività di proteine di resistenza multifarmaco come p-glicoproteina30,31,32. Anche la proliferazione cellulare, che è fondamentale per l'effetto della maggior parte dei composti chemioterapici, è generalmente ridotta in 3D rispetto alle condizioni 2D e quindi è probabilmente meglio imitata negli sferoidi tumorali che nella coltura cellulare 2D8,33 ,34. Infine, il microambiente tumorale denso è l'origine di numerosi segnali di segnalazione fisici e solubili che dirigono percorsi di segnalazione intracellulari che regolano la crescita cellulare, la sopravvivenza e la morte. Pertanto, quando si analizza l'efficacia dei farmaci, i sistemi di coltura 3D sono un passo fondamentale prima di intraprendere modelli in vivo. Uno dei principali inconvenienti della cultura 3D è, tuttavia, la maggiore complessità dell'analisi rispetto a quella della cultura 2D. Abbiamo descritto qui tecniche semplici e relativamente poco costose per la formazione di sferoidi utilizzando una varietà di tipi di cellule tumorali. Abbiamo mostrato esempi di come la formazione degli sferoidi debba essere ottimizzata per ogni tipo di cellula studiata e abbiamo descritto come ottenere dati quantitativi sulla vitalità cellulare, la morte cellulare e i percorsi di segnalazione associati, in tali sferoidi. Non vi sono differenze evidenti di crescita o morfologiche tra i tre modelli qui descritti. Nelle nostre mani, la variazione nella morfologia può essere leggermente maggiore utilizzando il metodo di goccia appesa, ma un vantaggio di questo metodo è che rBM non è necessario. Ci siamo concentrati sugli sferoidi prodotti da un singolo tipo di cellula tumorale. Il modello sferoide è, tuttavia, anche suscettibile di co-coltura, ad esempio di cellule tumorali con fibrolanti, monociti / macrofagi, cellule endoteliali e/o adipociti35,36,37. Altre applicazioni avanzate di questo modello includono la combinazione con dispositivi fluidici stampati in 3D che consentono il dosso attraverso una membrana semipermeabile, seguita dalla raccolta per la profilazione proteomica quantitativa38.
Mentre, come osservato in precedenza, il fenotipo delle cellule coltivate in sferoidi 3D generalmente imita quello dei tumori in vivo molto meglio delle cellule coltivate in 2D, la misura in cui tali sferoidi sono in realtà modelli rilevanti dei tumori in vivo corrispondenti dipende da numerosi fattori e devono essere valutati attentamente. I parametri che avranno un impatto su quanto bene tali sferoidi imitano la condizione in vivo includono la composizione cellulare del tumore e la sua composizione ECM relativa. Per esempio, il rBM che abbiamo impiegato come ECM nei protocolli qui forniti è una buona scelta per imitare le prime fasi dei tumori epiteliali, intorno al momento della violazione della membrana del seminterrato, altre composizioni ECM saranno più rilevanti per alcuni tumori tipi e -fasi. Inoltre, la capacità di adesione delle cellule sono ampiamente diverse tra le linee cellulari del cancro, a seconda della loro espressione delle proteine cellulari e di adesione della matrice cellulare come cadherine e integrins22.
Come descritto qui, la crescita sferoide e la morfologia possono essere monitorate facilmente e in modo non invasivo ogni 2-3 giorni utilizzando un microscopio leggero con ottica a basso ingrandimento e un ampio campo visivo. Tuttavia, poiché lo stress citotossico, come il trattamento chemioterapico, influisce sulla morfologia sferoide in modo molto diverso e, in un modo, a seconda del tipo di cellula e dello schema di trattamento, non è sufficiente fare affidamento solo sulla morfologia e sulla circonferenza per valutare effetto del trattamento. Ad esempio, gli sferoidi possono allentarsi con il trattamento e la morte cellulare emergente, o tutta la morte può verificarsi nel nucleo necrotico, mentre la superficie non è rilevare l'impatto. In entrambi i casi, il risultato può essere un'impressione errata che il numero di cellule vive nello sferoide non sia ridotto dal trattamento. Le tecniche quantitative e intere sferoidi sono quindi essenziali per valutare l'effetto del trattamento. Per la valutazione quantitativa della morte cellulare, il saggio acido fosfoculosi, che come il nome implica misura l'attività del fosfoculoano acido citosolico è stato impiegato21. Tuttavia, nelle nostre mani, mentre questo saggio riflette generalmente bene il numero di cellule seminato, non cattura adeguatamente la morte cellulare indotta dal trattamento rapido (dati non mostrati), probabilmente perché il fosfofasi acido rimane attivo per qualche tempo dopo la morte delle cellule. Inoltre, questo saggio richiede la rimozione completa del mezzo, che aumenta l'errore soprattutto con sferoidi fragili e trattati con chemioterapia. Il saggio di fattibilità delle cellule descritto qui, che si basa sul contenuto di ATP cellulare, è stato scelto in base al suo protocollo semplice ed efficiente in termini di tempo e ad alta riproducibilità. Inoltre, questo saggio non richiede la completa rimozione del mezzo di coltura che è un vantaggio quando si lavora con sferoidi. Come mostrato nei risultati rappresentativi, questo saggio cattura bene sia il numero di cellule che gli effetti previsti per il trattamento chemioterapico. Tuttavia, una trappola di questa tecnica è, ovviamente, che i cambiamenti metabolici riducendo il contenuto di ATP intracellulare possono erroneamente essere registrati come un numero di cellule inferiore. Pertanto, è consigliabile convalidare parallelamente il volume e la morfologia dello sferoide, o della colorazione PI.
La lisi di spheroide seguita dal gonfiore occidentale può fornire una visione semi-quantitativa dello stato dei processi di segnalazione, dei percorsi di morte cellulare, di crescita e di vivibilità. L'uso del gonfiore occidentale è complicato quando rBM viene utilizzato per preparare gli sferoidi, dal momento che questo comprenderà una frazione sostanziale del contenuto proteico lisato e, cosa più importante, il suo contributo frazionario aumenterà con la diminuzione del contenuto cellulare durante la morte delle cellule chemioterapiche. In linea di principio è possibile rimuovere il rBM mediante centrifugazione; tuttavia, si tratta di un passo fondamentale, in quanto è difficile rimuovere completamente tutti i rBM, e ciò precluderà il confronto quantitativo tra le condizioni. Per tali sferoidi, e in generale per la valutazione risolta spazialmente dei percorsi di morte e dei relativi parametri di segnalazione, l'incorporamento e l'IHC sono strumenti forti. Possono essere presi in considerazione altri approcci: imaging confocale vivo di (relativamente piccoli) sferoidi intatti39. Un'altra proprietà interessante degli sferoidi è che, data la loro forma piuttosto regolare "palla", si prestano bene all'iterazione tra modellazione matematica ed esperimenti di laboratorio bagnato, per aumentare la comprensione dell'importanza del sopra citato gradienti di ossigeno, pH e sostanze nutritive all'interno di sferoidi e, per estrapolazione, tumori40,41. Così, anche se stanno emergendo importanti modelli tumorali 3D di maggiore complessità, tra cui una vasta gamma di colture organotipiche e organoidi basate su scaffold biologici e inedito complessi e, non da ultimo, xenotrapilati derivati dal paziente42, gli sferoidi rimangono uno strumento importante a causa della loro rilevanza biologica superiore rispetto alla cultura 2D, combinata con relativa facilità di manipolazione.
In sintesi, presentiamo qui una serie di semplici metodi per l'analisi dei cambiamenti indotti dal trattamento anti-cancro nella vitalità e nella morte delle cellule tumorali nella coltura 3D. La composizione degli sferoidi può essere modificata a seconda delle proprietà e della biologia delle cellule impiegate, e le analisi quantitative e qualitative presentate sono utili sia per valutare le relazioni dose-risposta che per ottenere informazioni vie di segnalazione e morte coinvolti.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Siamo grati a Katrine Franklin Mark e Annette Bartels per l'eccellente assistenza tecnica e ad Asbjàrn N'hr-Nielsen per l'esecuzione degli esperimenti in Figura 1D. Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Einar Willumsen, dalla Novo Nordisk Foundation e dalla Fondation Juchum (tutti a SFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H-indole-6-carboxamidine (DAPI) | Invitrogen | # C10595 | For staining nuclei |
| 5-Fluorouracil (5-FU) | Sigma-Aldrich | #F6627 | Component in chemotherapeutic treatment |
| 5-(N-ethyl-isopropyl) amiloride (EIPA) | Life Technologies | #E3111 | Inhibitor of NHE1 |
| Antibody against PARP and cPARP | Cell signaling | #9542 | Used in western blotting |
| Antibody against Ki-67 | Cell signaling | #9449 | Used for IHC |
| Antibody against p53 | Cell Signaling | #2524 | Used for IHC |
| Antibody against β-actin | Sigma | A5441 | Used in western blotting |
| Bactoagar | BD Bioscience | #214010 | Used for agarose gel preparation |
| Benchmark protein ladder | Invitrogen | #10747-012 | Used for SDS-PAGE |
| Bio-Rad DC Protein Assay kit | Bio-Rad Laboratories | #500-0113, #500-0114, #500-0115 | Used for protein determination from lysates |
| Bürker chamber | Marienfeld | 610311 | For cell counting |
| BX63 epifluoresence microscope | Olympus | Used for fluorescent imaging | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | #G9681 | Used for the cell viability assay |
| Cisplatin | Sigma-Aldrich | #P4394 | Component in chemotherapeutic treatment |
| Corning Spheroid Microplate, 96 well, Black with clear round bottom, Ultra-low attachment, With lid, Sterile | Corning | #4520 | Used for growing spheroids with luminescence measurements as end point |
| Corning 96 well, clear round bottom, Ultra-low attachment microplate, With lid, Sterile | Corning | #7007 | Sufficient for spheroid growth without luminescence measurements as end point |
| Criterion TGX Precast Gels | Bio-Rad | 5671025 | Used for SDS-PAGE |
| Doxorubicin | Abcam | #120629 | Component in chemotherapeutic treatment |
| FLUOStar Optima Microplate reader | BMG Labtech | Used for recording luminescence | |
| Formaldehyde | VWR Chemicals | #9713.1000 | Used for cell fixation |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Gibco | #A1413202 | Keep at 4 °C to prevent solidification. Referred to as rBM in the protocol. |
| Heat-inactivated FBS | Sigma | #F9665 | Serum for growth media |
| ImageJ | NIH | Scientific Image analysis | |
| Medim Uni-safe casette | Medim Histotechnologie | 10-0114 | Used for storage of embedded spheroids |
| Mini protease inhibitor cocktail tablets | Roche Diagnostics GmBH | # 11836153001 | Used for lysis buffer preparation |
| MZ16 microscope | Leica | Used for light microscopic images | |
| NuPAGE LDS 4x Sample Buffer | Invitrogen | #NP0007 | Used for western blotting |
| Pierce ECL Western blotting substrate | Thermo scientific | #32106 | Used for western blotting |
| Ponceau S | Sigma-Aldrich | #P7170-1L | Used for protein band staining |
| Prism 6.0 | Graphpad | Scientific graphing and statistical software | |
| Propidium iodide (1mg/ml solution in water) | Invitrogen | P3566 | Light sensitive |
| Sterile reservoirs, multichannel | SPL lifesciences | 21002 | Used for seeding cells for spheroid formation |
| Superfrost Ultra-Plus Adhesion slide | Menzel-Gläser | #J3800AMNZ | Microscope glass slide used for embedding |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | #T5648 | Used as chemotherapeutic treatment |
| Trans-blot Turbo 0.2 µm nitrocellulose membranes | Bio-Rad | #170-4159 | Used for western blotting |
| Tris/Glycine/SDS running buffer | Bio-Rad | #161 0732 | Used for SDS-PAGE |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | #T4174 | Cell dissociation enzyme |
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