Summary
在这里,我们提出一个协议,以检测肿瘤体突变在循环DNA存在于患者生物流体(生物流体)。我们的滴数字聚合酶链反应(dPCR)方法能够定量肿瘤突变等位基因频率(MAF),促进对肿瘤反应的诊断和时间监测的微创补充。
Abstract
与前期和重复手术组织取样相关的并发症显示,需要能够对肿瘤治疗反应进行分子分分类和时间监测的微创平台。在这里,我们描述了我们基于dPCR的方法,用于检测细胞自由DNA(cfDNA)中的肿瘤体突变,在患者生物流体中随时可用。尽管每次测定中可测试的突变数量有限,但这种方法提供了高水平的灵敏度和特异性。监测突变丰度,根据MAF计算,允许评估肿瘤对治疗的反应,从而提供放射成像急需的补充。
Introduction
由于用于分子分析的肿瘤组织可用性有限,需要开发能够检测患者生物液体(包括血浆、血清和脑脊液 (CSF) 中的肿瘤体细胞突变的高度敏感方法.例如,小儿扩散中线胶质瘤 (DmG) 由于其神经解剖学位置而构成挑战。在过去的十年中,DMG组织标本的分子分析发现了该肿瘤类型1的驱动因素突变,并揭示了突变的空间和时间异质性,使得活检对疾病中患者的特征是必要的亚群和促进分子靶向疗法2。因此,临床试验提倡在前期诊断3、4、5、6中整合肿瘤分子分析的外科活检。在治疗过程中,DLG治疗反应的监测仅限于MRI,MRI缺乏检测小变化或肿瘤基因组进化的敏感性。MRI也容易检测伪进展,瞬时炎症在肿瘤的部位,模仿真正的进展成像,并可能错误地解释肿瘤反应7。因此,DPG 代表一种肿瘤类型,对检测肿瘤突变和监测临床反应的替代微创方法的需求很高。为了满足这些需求,我们开发并优化了一种方案,用于检测和量化中线胶质瘤8儿童血浆、血清和CSF中cfDNA突变的等位基因。鉴于儿童期 DLG 经常 (>80%)在组蛋白变体 H3.1(H3.1K27M,20% 的病例)或 H3.3(H3.3K27M,60% 的病例)位置 27 处携带体性以酶对蛋氨酸突变 1,这些和 DMC 的具有其他突变特征(即ACVR1、PIK3R1)的目标使用cfDNA8进行突变等位基因定量。此测定可定制,使用序列特定的引种和探针检测其他肿瘤类型的热点突变。这种方法的多功能性使其适用于各种癌症,这些癌症将受益于基于cfDNA的诊断工具和治疗监测的集成。
为了灵敏地检测cfDNA中的低等位基因突变,我们采用了基于滴数字PCR(dPCR)的方法。在这种方法中,PCR反应混合物使用dPCR平台(例如RainDance)被分割成理论最大值为1000万个液滴,每个PCR通常有700万至900万个液滴。由于样品分割程度高,每个滴中最多只能存在一到两个DNA分子。PCR扩增和序列特异性荧光探针杂交可发生在每个滴中,因此发生数百万次反应。这最大限度地提高了灵敏度,并能够检测稀有的突变等位子,否则在野生型DNA背景下可能无法检测到。利用锁定核酸(LNA)探针,通过限制不匹配杂交和支持9、10、11的准确突变检测,提高了测定的特异性。在这里,我们描述了我们的样品处理方法,cfDNA提取,目标等位子的预扩增,dPCR和数据分析。
Protocol
此处描述的所有方法均已获得加州大学旧金山分校(加利福尼亚州旧金山市;加利福尼亚州;旧金山市;旧金山市)机构审查委员会的批准。IRB #14-13895) 和儿童国家卫生系统(华盛顿特区;IRB #1339)。标本在征得患者或患者监护人的知情同意后进行收集和研究。
1. 根据IRB收集和储存生物标本的同意病人
-
在从每位患者或患者监护人获得书面知情同意后收集患者样本,以便参加临床试验或经相关机构审查委员会批准的生物储存。
- 这项研究中包括的患者被诊断为脑肿瘤的放射学。未使用排除条件。标本在征得患者或患者监护人的知情同意后进行收集和研究。
2. 血浆或血清的血液采集和分离
- 收集血液样本使用10.0 mL抽入血液收集管。如果为血浆采集血液,请使用K2- 或 K3-EDTA 管、肝素或 cfDNA 采血管。如果为血清收集血液,请使用含有凝块活化剂和凝胶的凝胶阻隔管分离血清。
注:虽然建议使用 10 mL 来进行复制实验,但至少 3 mL 就足够了。 - 小心反转收集管10次,将血样与收集管试剂混合。
- 将血清在室温下采集的血液样本留30分钟,让血液凝固。如果处理血液以获得血浆,请立即执行步骤 2.4。
注:在离心之前,为等离子体加工的样品最多可在冰上保存2小时。然而,从抽血到加工的快速过渡将cfDNA降解降至最低。 - 在设置为 4°C 的离心机中,在 2,000 x g下 15 分钟进行离心式采血管,将血浆或血清从白色和红血球层中分离出来。
- 注意不要干扰白血球层(在上血浆/血清层和包装红血球的下层之间形成一条细线),在 1 mL aliquote 中均匀移液血浆/血清的顶层(可以是透明、黄色或粉红色)变成无菌聚丙烯螺杆盖低温。
- 在冷冻标签上记录受试者的识别号、标本类型(血浆或血清)和采集日期。
- 将冷冻液储存在-80°C冷冻箱中,直到使用。如果没有-80°C冰柜,将样品储存在-20°C下长达一周。
3. CSF 收集和处理
- 从分流器、腰椎穿刺或手术中收集 CSF。
注:只有在临床医生认为有必要时,才应进行此类程序。额外的样品,除了临床使用所必需的,可用于研究目的。 - 测量收集的 CSF 体积并记下其颜色(血腥、黄色、清晰)。
- 在 10,000 x g下将收集管在 4°C 下离心 10 分钟,以颗粒细胞碎屑。
- 将 CSF 上清液以 500 μL 等分平均转移到聚丙烯螺钉盖低温中。
- 在冷冻标签上记录受试者识别号、标本类型和标本收集日期。储存在-80°C,直到使用。
4. 从液体标本中提取cfDNA
- 按照 cfDNA 提取试剂盒手册12中的说明执行 cfDNA 提取协议。
- 使用 10% 漂白剂和 70% 乙醇清洁工作台空间和设备。
注:在协议的所有步骤中使用 PCR 罩、定期更换手套以及频繁对工作台空间和设备进行 10% 漂白剂和 70% 乙醇的净化,对于避免样品污染非常重要。 - 从萃取试剂盒中制备试剂等分量,例如清洗缓冲液,以避免交叉污染。
- 使用 10% 漂白剂和 70% 乙醇清洁工作台空间和设备。
- 在开始提取之前,在冰上解冻患者样品。对于血浆/血清,解冻1 mL等分样品。对于 CSF,解冻 500 μL 等分样品。
注:萃取协议的裂化步骤(4.5-4.8)在血浆/血清和CSF之间有所不同,但从步骤4.9开始,这两种生物流体的抗性步骤是相同的。 - 将加热块设置为 60°C,以便在莱沙步骤 (4.6) 期间使用。
- 在15 mL管中制备莱沙缓冲液和载体RNA混合物,每样品12加入5.6μL的载体RNA和0.9 mL的利沙缓冲液。
- 对于血浆/血清,将步骤 4.4 中制备的 100 μL 蛋白酶 K、1 mL 样品和 0.8 mL 的莱沙缓冲液/载体 RNA 混合物加入标记的 2.0 mL 管中。在高速12时通过脉冲涡旋混合30秒。
- 对于CSF,将125μL蛋白酶K、500μL样品、1 mL裂变缓冲液/载体RNA混合物和250μL组织裂化缓冲液加入2.0 mL管。通过添加 125 μL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 使整个体积达到 2 mL。在高速12时通过脉冲涡旋混合30秒。
- 在加热块12中,在60°C下孵育样品30分钟。
- 从加热块中取出样品,并将温度降至 56°C。将样品返回工作台,并将乳液转移到新的标有 15 mL 的管中。
- 对于血浆/血清,加入1.8 mL的核酸结合缓冲液,通过脉冲涡旋12混合30秒。
- 对于CSF,加入3.6 mL的核酸结合缓冲液,通过脉冲涡旋12混合30秒。
- 在冰12上孵育样品5分钟。
- 将列插入真空接头。打开柱,将 20 mL 管扩展器插入12号柱中。
- 将 15 mL 管的含量直接移入管扩展器底部,避免在管扩展器壁上留下液滴。
- 关闭真空接头开关后,打开真空泵。压力达到 900 mbar 后,打开真空接头的阀门。该示例现在将流经该列。
- 从柱中排出所有解热物后,关闭泵并打开吸尘口的活板门,以释放压力梯度。压力达到 0 mbar 后,关闭真空接头和活板门的阀。
- 拆下 20 mL 管扩展器,小心不要将一列的扩展器传递到相邻柱上,因为这会交叉污染样品。处理管扩展器。
- 将 600 μL 的第一洗涤缓冲液添加到列12。
- 保持管盖打开并打开真空泵。让压力表达到 900 mbar,然后将真空接头上的开关打开到打开位置,将洗涤缓冲器穿过柱。
- 关闭真空泵,打开活板门以释放压力,并将压力释放到 0 mbar。将真空接头的阀转向关闭位置。
- 将 750 μL 的第二洗涤缓冲液添加到柱中,并重复步骤 4.16-4.1712。
- 将 750 μL 的 MB 级乙醇添加到柱中,并重复步骤 4.16-4.1712。
- 关闭柱盖,并将列放在新的 2.0 mL 收集管内。处理真空接头12。
- 在室温12下,用柱在20,000 x g下离心管3分钟。
- 将柱子放入新的收集管中,打开管盖。将实验室组织放在顶部,在56°C孵育10分钟12。
- 将柱放入干净的 1.5 mL PCR 清洁管中,将移液器 100 μL 的洗脱缓冲液(或分子生物学等级 H2O (MB H2O))直接放入柱的中心。请勿用移液器尖端触摸柱子。合上盖子,在室温下离开3分钟。
- 在室温下20,000 x g下离心1分钟至洗脱cfDNA12。
- 将埃卢特移回柱中,在室温下孵育3分钟。
- 全速重复离心1分钟,再次洗脱cfDNA以提高产量(根据制造商的建议)。
- 将 cfDNA 储存在标记为 DNase/RNase 的免费 PCR 清洁管中,在 4°C 下或直接进入步骤 5。
5. cfDNA的真空浓度
- 将含有洗脱的cfDNA的管子插入真空集中器上的支架中并平衡。打开管盖。将真空集中器的温度设置为 23°C。
-
打开真空集中器,然后打开蒸汽疏水阀。离心样品40分钟或直到达到10.5-11μL的最终体积。
- 如果体积低于10.5μL,添加DNA悬浮液缓冲液或MB H2O,最终体积达到10.5μL。
- 沿着管壁移移整个体积,以去除残留的DNA片段。
- 在桌面离心机上短暂离心样品,收集管壁上的液滴。
- 直接转到预放大步骤(步骤 8)或将样品存储在 4°C。
- 将管盖包裹在实验室薄膜中,以避免被污染,如果它们被储存起来供以后使用。
6. 引子和探头的设计与准备
- 为感兴趣的目标设计正向和反向引物,以及野生型和突变LNA探针。商业订购冻干引物和探针(参见材料表)。
注:针对H3F3A p.K27M和其他小儿中线胶质瘤的引基和探针序列可在Panditharatna等人补充表3中找到,20188年。 - 在打开冻干引液和探针之前,对管进行短暂离心。如产品规格表所述,添加适当体积的DNA悬浮液缓冲液或MB H2O,将冻干引材和探针重新悬浮到100μM浓度。
- 轻轻涡旋,上下移液几次,使用桌面离心机混合和短暂离心引注和探头。
- 通过将 10 μL 的 100 μM 库存添加到 90 μL 的 DNA 悬浮液或 MB H2O 中,制备 10 μM 底漆和探针等分。
- 通过将 10 μM 底漆的 10 μM 底漆添加到 90 μL 的 DNA 悬浮液缓冲液或 MB H2O 中,制备 1 μM 正向和反向引物等分(用于预扩增)。
- 将底漆和探头储存在4°C的密封暗容器中。将实验室薄膜包裹在盖子周围以避免污染,并在铝箔中盖住探头,以避免暴露在光线下。如果探头未定期使用,则将其储存在 -20°C,用于长期存储。
7. 正控制的选择
-
选择具有已知DNA浓度的肿瘤组织基因组DNA(gDNA)样本,该样本具有已知等位基因频率的引起兴趣突变,用作正对照。
- 在预扩增步骤(步骤8)中使用0.025 ng的阳性控制肿瘤组织DNA。
注:此DNA输入在dPCR上提供强健的正信号(通过执行含有H3F3A p.K27M突变8的肿瘤组织gDNA的连续稀释来确定),同时最大限度地减少所需的样本量。
- 在预扩增步骤(步骤8)中使用0.025 ng的阳性控制肿瘤组织DNA。
8. 目标等位乐的预放大
注:预扩前协议是根据杰克逊等人,2016年13。
- 使用 10% 漂白剂和 70% 乙醇清洁工作台空间和设备。
- 获得1μM正向和反向引物、cfDNA样品、gDNA阳性对照和DNA聚合酶主混合物,并设置在冰上。
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计算用于单丛或多路预扩的试剂数量,以预扩扩扩扩所需的 cfDNA 样本数量和正对照,如下所示:
- 对于单丛预扩增(用于预扩增野生型和突变等位基因,用于单个感兴趣的单个突变),通过添加17.5 μL的DNA聚合酶主混合物和每样品13的3.5μL正向和反向引物(100 nM)制备PCR反应混合物。
- 对于多路预扩增(用于预扩扩化两组野生型和突变等位基因,用于两个感兴趣的突变),通过添加 17.5 μL 的 DNA 聚合酶主混合物和每组正向和反向引物 (50 nM) 的 1.75 μL 来制备 PCR 反应混合物13.
注:为样品数量准备足够的PCR反应混合物,外加10%的额外样品,以考虑任何移液错误。
- 将 24.5 μL 的 PCR 反应混合物放入 8 井 PCR 带管13的每个井中。
- 将10.5μL的DNA样品放入适当的井中,使总反应量达到35μL13。轻轻移液整个音量向上和向下10次混合。
- 在98°C下进行PCR扩增3分钟;9个周期98°C为10秒,退火温度为3分钟,72°C为30秒;并在72°C下延长2分钟13。
- 将预扩增产物的全部体积转移到标记的DNase/RNase免费PCR清洁管中,并在140μL TE DNA悬浮液缓冲液(pH 8.0)中稀释13。
- 在实验室薄膜中包裹管盖。将预放大产品储存在 4°C。长期保存,储存在-20°C。
9. 使用dPCR检测和定量目标DNA
- 使用 10% 漂白剂和 70% 乙醇清洁工作台空间和设备。
- 在冰上设置 10 μM 引源和探针、基因分型主混合物和 DNA 样本。在室温下储存滴稳定油。
- 轻轻涡旋,并短暂离心除滴稳定油外的所有试剂。
- 确保连接到滴产生器和定量仪器(材料表)的压缩氮气瓶设定为 90 psi。
- 使用仪器软件打开滴产生器和计算机。启动软件并单击"开始初始化"。
- 如果在一周或更长时间内未使用,则对滴产生器运行高压冲洗。
- 通过加入 220 μL 的基因分型主混合物、10 μM 野生型和突变探针各 8.8 μL、10 μM 正向和反向底漆各 39.6 μL 和 17.6 μL 液滴稳定油 14°/c00,为 PCR 带管的 8 口井制备 dPCR 反应混合物,外加 10% 额外>.
- 通过上下移液10-20次,轻轻混合dPCR反应混合物。在反应混合物中加入滴稳定油后,不要涡旋或离心。
- 获得PCR 8井带管,将38μL的dPCR反应混合物直接分配到每口井14的底部。用干净的移液器尖端清除所有气泡。
注:在分析 dPCR 数据时,相互联锁或紧密包装在一起的 PCR 带管会导致静电电荷,导致聚结和噪声信号。为了避免这种情况,将无二分条管放入单独的生物危害袋中,避免过度包装袋子,并防止管子摩擦在一起。 - 将12μL的预扩DNA样本加入PCR带管的适当井中。对于负极控制,添加 12 μL 的 MB H2O。
注:分析复制井中的 cfDNA 样本。对于 CSF,至少重复分析,对于血浆/血清分析三次样品。 - 轻轻移移整个体积向上和向下10次,将反应混合物与DNA样品混合。
- 获得新的滴产生器芯片,并将PCR带管1-8井的全部体积移移到芯片中的相应通道A-H中。避免用移液器尖端触摸通道底部。
- 获得新的清洁 PCR 带管并插入滴产生器中。扫描或手动输入产生滴的仪器芯片 ID 到仪器计算机上的软件中。输入 8 个通道中每个通道的名称。单击"开始运行"以开始丢弃样本。
- 滴放完成后,拆下 PCR 带管并应用带管盖。
- 将带状管转移到热循环器上,并与每口井含有 80 μL 水的另一条带管保持平衡。
- 将热循环条件14编程为:95°C10分钟;45循环两个温度:95°C 30秒,退火温度2分钟;98 °C 10 分钟;并保持在10°C。
- 将斜坡速率设置为 0.5 °C/s,并将采样体积设置为 80 μL14。
- 热循环完成后,拆下带管并转移到定量仪器。拆下 PCR 带盖,然后更换高速盖。
- 使用仪器软件打开定量仪器和连接的计算机。启动仪器软件,然后单击"设置运行"。
- 将带状管放入定量仪器中。
- 获取新的量化仪器芯片并扫描或手动输入芯片 ID 到仪器中。将芯片插入机器。
- 将金属护罩放在芯片顶部并合上仪器盖。
- 在计算机软件中,输入 dPCR 运行的名称以及 8 个通道 (A-H) 的名称。选择快速模式(必须与高速盖一起使用),然后单击"开始"开始量化。
- 量化完成后,拆下金属屏蔽(保存和重复使用),并处理 PCR 带管和芯片。在仪器计算机上,运行日志将包含每次运行的结果文件。使用每个示例的 .fcs 文件使用分析软件进行分析。
10. 数据分析
- 启动分析软件并打开 .fcs 文件以分析原始光谱数据。在"分析视图"下,选择"已保留"。在"示例视图"下,单击 8 个样本中每个样本旁边的框,以便每个框中都有一个复选标记。该软件将分别绘制突变体 (FAM) 和野生型 (HEX) 等位数沿 x 轴和 y 轴的信号。
- 根据制造商的说明15,使用计算矩阵函数对完整液滴应用光谱补偿。
- 在"轴选项"下调整轴设置。将 x 轴设置为最小 0 和最大值 30,000,将 y 轴设置为最小 -5,000 和最大 10,000。识别水滴聚类后,调整轴以减少图形中的空空间。
注:突变型和野生型簇的位置取决于所使用的探针、荧光团及其浓度。 - 选择与正对照肿瘤组织gDNA对应的样本,以设置负数(最接近原点的聚类)、突变体(最接近x轴的簇)和野生型(最接近y轴的簇)门。确保在成功的测定中,这些簇是截然不同的,并且易于识别。
- 通过右键单击正控制样本并单击"将所有设置应用于所选样本"选项,将正控制的门设置应用于所有样本。
- 在图形视图下,单击"多个样本"选项卡以查看所有选定样本的绘图。将图像导出为 。TIF 文件。
- 在屏幕左上角的"工作区"选项卡下,选择导出分析(csv) 并将分析的数据文件另存为 .csv 文件。
- 在电子表格软件中打开 .csv 文件,查看每个示例的负数、野生型和突变液滴计数。通过将泊松校正的突变液滴计数除以每个样本的泊松校正突变体加野生型液滴计数的总和来计算 MAF。
注:使用泊文校正计数,因为泊森统计说明,阳性液滴可能含有多个目标DNA副本,因此,对正液滴求和可能不会产生准确的计数16。
Representative Results
图1显示了在预扩增等离子体(左上面板)和CSF(右上面板)中成功检测DMG两个子级H3F3A p.K27M突变的代表性结果。在复制中分析了cfDNA样本,但每个样本类型只显示一个代表性图。dPCR 图显示成功的液滴生成,每个 PCR 井有 700-900 万个液滴(其中大多数是不包含靶性 DNA 的负液滴)。每孔 PCR 孔至少 700 万个液滴表示成功滴滴,而少于 700 万滴表示测定失败,在这种情况下,用户不应继续进行数据分析。图 1显示了沿 x 轴和 y 轴的突变和野生类型簇之间的明确分离。健壮的野生型簇表明cfDNA提取是成功的,因为模板DNA存在。突变簇显示,血浆和CSF样品的MAF分别为1.60%和39.92%,表明突变的阳性检测。对于这些患者,dPCR结果与肿瘤突变状态一致,经活检肿瘤组织8基因组分析证实。负控制(左下角面板)显示0突变和0野生型液滴,表明PCR反应混合物没有污染。正对照肿瘤组织gDNA(右下角面板)显示在所选特定肿瘤样本的预期等位频率处检测到突变。
在图2中,在DMG儿童血浆cfDNA中,对兴趣突变H3F3A p.K27M的检测失败显示了代表性的结果。肿瘤组织8的基因组分析证实了突变状态。显示两个复制 PCR 井的代表性结果(顶部面板)。水滴总数(包括负液滴)为每 PCR 孔 7-9 百万,表明液滴成功。沿 y 轴绘制的野生型簇显示血浆 cfDNA 每个 PCR 井大约 7-8,000 个野生型液滴,表明成功提取 cfDNA(因为样本中有目标野生型 DNA)。然而,在血浆样品中检测到0个突变液滴。左下角面板显示负控制(MB H2O),没有野生型或突变液滴;右右面板显示阳性控制预扩肿瘤组织gDNA(0.025 ng)与阳性突变检测。如图所示,血浆中缺乏突变检测并不一定意味着患者是兴趣突变的野生型,因为假阴性确实会发生8。在某些情况下,当在前期活检收集的血浆中漏掉突变时,在稍后时间点8从同一患者获得的血浆中检测到突变。
图 1: 成功检测H3F3Ap.K27M突变在预扩增血浆和CSF cfDNA从儿童与中线胶质瘤。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:从已知有兴趣突变的患者身上分析预扩增血浆cfDNA样本获得假阴性结果,H3F3Ap.K27M,在肿瘤中。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
在这里,我们介绍了从患者液体活检中检测和量化cfDNA中肿瘤突变的等位频率的方法。我们强调该方法成功的关键步骤,包括分析前样品处理、cfDNA提取、PCR 测定设计和数据分析。为了限制使用的样品体积,从1 mL的血浆中提取cfDNA,但仅提取500μL的CSF。从CSF中提取时,根据制造商的建议,使用从1 mL尿液中提取的协议(遵循cfDNA提取试剂盒手册12)。血浆和CSF之间所需的样本量差异是由于血浆中肿瘤特异性cfDNA水平低于脑肿瘤患者的CSF,因此突变检测所需的样本量较大。如果样品可用,可以从中提取超过1 mL的血浆,以产生更高的DNA产量。然而,对于小儿患者,尽可能减少使用的血液量很重要,因为即使是简单的程序,如抽血,对接受放射治疗的癌症的儿科患者来说也是很肥的。从1 mL等分血浆中提取也能够进行复制提取,这样测定可以重复(例如,在DNA提取失败或样品污染的情况下)。
为了减少任何并非绝对必要的样品使用,cfDNA 通常不量化。然而,我们在等离子体和CSF中分别发现0.2-2纳克/μL和0.6-13纳克/μL之间的cfDNA浓度范围。鉴于cfDNA的含量较低,并且肿瘤特异性突变位命在低频下存在,因此有必要使用用于dPCR的相同引物集进行预扩增步骤,以显著增加样品中靶DNA的含量,从而有助于突变检测8。在DNA悬浮液中稀释预扩增产物为技术复制提供了足够的体积,有助于区分真正的阳性。由于突变液滴的数量可能较低(例如,在血浆样本中的 0-2 个突变液滴之间),因此包含技术复制是解决突变状态的关键。虽然一个PCR孔可能产生0突变液滴,但另外两个可能产生1-2为单一血浆样品分析三元;因此,在确定突变状态时,包含复制可以提高准确性。然后,将 MAF 计算为复制值的平均值。
多路复用预扩增(预扩增野生型和两个感兴趣的突变突变等位基因)增加了单个样本的效用,因为相同的起始材料可用于测试两个突变。重要的是,多路复用预扩前产品可以在dPCR期间在单丛中进行分析,以便更加简单,如此处所述。但是,预扩介 PCR 和 dPCR 都可以多路复用。多路复用时,必须针对两组引水器和探头优化条件:引水退火温度必须类似于 PCR 放大时一起运行,并且探头应设计为生成不同的聚类(基于荧光信号和强度)。验证一组新的引体和探头时,运行退火温度梯度,以根据制造商建议的范围确定最佳退火温度。在测试患者 cfDNA 标本的探针之前,使用合成 DNA 构造和/或不同输入的肿瘤组织 gDNA(即高达 10 ng)进行验证。
为了检测在探针与目标DNA杂交中具有更大特异性和减少不匹配的突变等位子,使用锁定核酸(LNA)探针。LNA是一种核酸模拟体,带有一个亚甲桥,连接核糖环9的2'氧和4'碳。亚甲桥将核酸锁定成刚性双环形,从而限制灵活性,提高热双工稳定性,提高探针杂交的特异性,以靶向DNA 10,18,19.如果LNA探针和模板DNA之间存在单基不匹配,探头和目标之间的双面形成将不稳定。因此,LNA探头提高了探头结合的特异性,并产生了更高的信噪比11。对非CNS病患儿患者血浆和CSF的分析确定了我们针对H3F3A p.K27M的LNA探针的测定的特异性,以确定等于或小于0.001%的等位频率被认为是假阳性8.有关优化探头和引物设计的其他注意事项,包括 GC 含量、放大素大小、探针报子染料和淬火,请参阅 dPCR 制造商指南 14、17 。尽管我们的方法针对 RainDance 系统进行了优化,但该协议可以适用于其他 dPCR 平台。
这里介绍的方法从dPCR实现的高灵敏度和目标富集中汲取了力量,而dPCR仍然是检测cfDNA中罕见肿瘤突变的首选平台。dPCR虽然功能强大,但可在单次检测中测试的突变数量有限。dPCR 的替代方案是下一代测序 (NGS),它可检测多个基因的多个突变,从而增加单个样本的效用。NGS可以检测脑干胶质瘤20患者的CSF和血浆突变,然而,目前在检测cfDNA中的肿瘤突变方面比dPCR敏感,检测限值为0.1-10%MAF,而基于PCR的方法为0.001%.dPCR 还实现了比 NGS 更快的周转时间,从而能够快速检测感兴趣的突变。PCR方法适用于癌症类型,可扩展以检测热点突变和甲基化cfDNA22。
液体活检确实处于初级阶段,需要进一步开发,以适应特定的疾病。肿瘤进化背景下的肿瘤监测将是下一个挑战,需要一个能够检测高灵敏度的新兴突变的平台。此外,能够检测各种生物分子(肽、细胞因子、RNA)的平台将非常有益于评估肿瘤对治疗的反应,以及推进个性化的临床干预。
Disclosures
本手稿中描述的方法包含在由Javad Nazarian & Eshini Panditharatna提出的国际专利申请"检测癌症生物标志物的方法"中。
Acknowledgments
作者要感谢所有病人及其家属的慷慨。这项工作得到了粉碎核桃基金会(弗吉尼亚州米德尔堡)、V基金会(亚特兰大,佐治亚州)、加布里埃拉·米勒儿童第一数据中心、国家儿童临床和转化科学研究所(加利福尼亚州)的资助。5UL1TR001876-03),穆塞拉基金会(纽约州休利特),马修·拉森基金会(新泽西州弗兰克林湖),利拉比恩小儿脑癌研究基金会(银泉,MD),儿童脑肿瘤基金会(德国城,马里兰州),儿童脑肿瘤组织联盟(费城,宾夕法尼亚州)和儿童癌症研究拉力赛基金会(佐治亚州亚特兰大)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
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