Summary
Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.
Abstract
Complicaties in verband met vooraf en herhaalde chirurgische weefsel bemonstering presenteren de behoefte aan minimaal invasieve platformen die in staat zijn moleculaire subclassificatie en temporele monitoring van tumorrespons op therapie. Hier beschrijven we onze op dPCR gebaseerde methode voor de detectie van tumor somatische mutaties in cel vrij DNA (cfDNA), direct beschikbaar in biovloeistoffen voor patiënten. Hoewel het aantal mutaties dat in elke test kan worden getest beperkt is, biedt deze methode een hoge mate van gevoeligheid en specificiteit. Monitoring van de mutatie overvloed, zoals berekend door MAF, maakt de evaluatie van tumorrespons op therapie mogelijk, waardoor een veel noodzakelijke aanvulling op radiografische beeldvorming wordt geboden.
Introduction
Vanwege beperkingen in de beschikbaarheid van tumorweefsel voor moleculaire analyses, is er behoefte aan de ontwikkeling van zeer gevoelige methoden die in staat zijn tumor somatische mutaties in biovloeistoffen van patiënten te detecteren, waaronder plasma, serum en cerebrospinale vloeistof (CSF) . Bijvoorbeeld, pediatrische diffuse middellijn gliomen (dmg's) vormen een uitdaging als gevolg van hun neuroanatomische locatie. In het afgelopen decennium heeft moleculaire profilering van DMG-weefsel specimens bestuurders mutaties in dit tumor type1 blootgelegd en heeft het ruimtelijke en temporele heterogeniteit van mutaties onthuld, waardoor biopsie nodig is voor het karakteriseren van een patiënt binnen een ziekte subgroep en bevordering van moleculair gerichte therapieën2. Als zodanig, klinische proeven pleiten voor de integratie van chirurgische biopsieën voor tumor moleculaire profilering op vooraf diagnose3,4,5,6. Tijdens de behandeling, controle van de therapeutische respons in Dmg's is beperkt tot MRI, die ontbreekt aan gevoeligheid voor het detecteren van kleine veranderingen of tumor genomische evolutie. MRI is ook gevoelig voor het detecteren van pseudoprogressie, voorbijgaande ontsteking op de plaats van de tumor die ware progressie op beeldvorming nabootst en kan de interpretatie van tumorrespons7verkeerd informeren. Dus, Dmg's vertegenwoordigen een tumor type met een hoge behoefte aan een alternatieve, minimaal invasieve middelen voor het opsporen van tumor mutaties en monitoring klinische respons. Om aan deze behoeften tegemoet te komen, ontwikkelden en optimaliseerde men een protocol voor het opsporen en kwantificeren van de allelische frequentie van tumor mutaties in cfdna uit plasma, serum en CSF van kinderen met middellijn gliomen8. Gezien het feit dat de kinder Dmg's vaak (> 80%) een somatische lysine-tot-methionine-mutatie op positie 27 van Histon-variant H 3.1 (H 3.1 K27M, 20% van de gevallen) of H 3.3 (H 3.3 K27M, 60% van de gevallen)1, deze en andere mutaties die kenmerkend zijn voor dmg's (d.w.z. ACVR1, PIK3R1) waren gericht op gemuteerde allel kwantificering met behulp van cfDNA8. Deze test kan worden aangepast aan het detecteren van hotspot mutaties in andere tumortypen met behulp van sequentie-specifieke primers en sondes. De veelzijdigheid van deze aanpak maakt het toepasbaar op een verscheidenheid van kankers die baat zouden hebben bij de integratie van op cfDNA gebaseerde diagnostische instrumenten en therapeutische monitoring.
Om op een verstandige manier lage allel-frequentie mutaties in cfdna te detecteren, hanteren we een druppel digitale PCR (dpcr)-gebaseerde aanpak. Bij deze methode wordt het PCR-reactiemengsel opgedeeld in een theoretisch maximum van 10.000.000 druppels met behulp van het dPCR-platform (bijv. RainDance), met 7-9 miljoen druppels per PCR-goed meestal experimenteel gezien. Vanwege de hoge mate van sample partitionering kunnen er in elke druppel maximaal één tot twee DNA moleculen aanwezig zijn. PCR-amplificatie en sequentie-specifieke fluorescentie sonde hybridisatie kunnen voorkomen in elke druppel, zodat miljoenen reacties plaatsvinden. Dit maximaliseert de gevoeligheid en maakt detectie mogelijk van zeldzame Mutant allelen, die anders onopgemerkt kunnen blijven tegen een achtergrond van wild type DNA. Het gebruik van vergrendelde nucleïnezuur (LNA) voelers verhoogt de specificiteit van de assay door het beperken van mismatch hybridisatie en het ondersteunen van nauwkeurige mutatie detectie9,10,11. Hier beschrijven we onze methoden voor monsterverwerking, cfDNA-extractie, voor versterking van doel-allelen, dPCR en gegevensanalyse.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel beoordelingscomité van de University of California San Francisco (San Francisco, CA; IRB #14-13895) en het Children's National Health System (Washington D.C.; IRB #1339). Specimens werden verzameld en bestudeerd na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming van de patiënt of de voogd van de patiënt.
1. toestemming van patiënten met het IRB-protocol voor de inzameling en opslag van biologische specimens
-
Verzamel patiënt monsters nadat schriftelijke geïnformeerde toestemming is verkregen van elke patiënt, of de voogd van de patiënt, voor deelname aan een klinische proef of voor biorepository zoals goedgekeurd door de respectieve institutionele beoordelings Raad.
- Patiënten opgenomen in deze studie werden gediagnosticeerd met een hersentumor radiografisch. Er werden geen uitsluitingscriteria gebruikt. Specimens werden verzameld en bestudeerd na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming van de patiënt of de voogd van de patiënt.
2. bloedafname en scheiding van plasma of serum
- Verzamelen van het bloedmonster met behulp van een 10,0 mL trekken in bloedinzameling buizen. Bij het verzamelen van bloed voor plasma, gebruik K2-of k3-EDTA buizen, heparine of cfdna bloedinzameling buizen. Als bloed voor serum verzamelen, gebruik gel-barrière buizen met de stolsel activator en gel te scheiden van serum.
Opmerking: Hoewel 10 mL wordt aanbevolen om replicaatexperimenten mogelijk te maken, volstaat een minimum van 3 mL. - Keer voorzichtig de opvang buis om 10 keer om het bloedmonster te mengen met de reagentia van de opvang buis.
- Laat de bloedmonsters van waaruit het serum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur wordt opgevangen om het bloed te laten stollen. Als de verwerking van bloed om plasma te verkrijgen, ga onmiddellijk naar stap 2,4.
Opmerking: Monsters die voor plasma worden verwerkt, mogen vóór het centrifugeren maximaal 2 uur op ijs worden bewaard. Een snelle overgang van de bloedafname naar de verwerking minimaliseert echter de afbraak van cfDNA. - Centrifugeer bloedafname buisjes bij 2.000 x g gedurende 15 minuten in een centrifuge op 4 °c om plasma of serum van witte en rode bloedcel lagen te scheiden.
- Zorg dat u de witte bloedcel laag niet verstoort (die een dunne lijn vormt tussen de bovenste plasma/serum laag en de onderste laag van rode bloedcellen), Pipetteer de bovenste laag van plasma/serum (die helder, geel of roze van kleur kan zijn) gelijk in 1 mL aliquots in steriele polypropyleen schroefdop cryoflesjes.
- Noteer het onderwerpidentificatienummer, het type preparaat (plasma of serum) en de afhaaldatum op het etiket van de cryoflesjes.
- Bewaar cryoflesjes in de vriezer-80 °C tot het gebruik. Als een-80 °C vriezer niet beschikbaar is, bewaar de monsters maximaal één week bij-20 °C.
3. CSF-inzameling en-verwerking
- Verzamel CSF van een shunt, Lumbaalpunctie of operatie.
Opmerking: Dergelijke procedures mogen alleen worden uitgevoerd als dit door clinici noodzakelijk wordt geacht. Voor onderzoeksdoeleinden mag extra monster worden gebruikt dan nodig is voor klinisch gebruik. - Meet het volume van de CSF verzameld en noteer de kleur (bloederig, geel, helder).
- Centrifugeer de opvang buis bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c om het cellulaire puin te pellet.
- Breng het CSF supernatant evenredig over in 500 μL aliquots in polypropyleen schroefdop cryoflesjes.
- Noteer het identificatienummer van het onderwerp, het type specimen en de datum van de verzameling van monsters op het etiket van de cryoflesjes. Bewaren bij-80 °C tot gebruik.
4. extractie van cfDNA uit vloeibare specimens
- Voer cfDNA-extractie protocol volgens de instructies in de cfDNA-extractie Kit handboek12.
- Reinig de ruimte en uitrusting van de Bank met 10% bleekwater en 70% ethanol.
Opmerking: Het gebruik van een PCR-kap, regelmatige wisseling van handschoenen en frequente ontsmetting van de tafelruimte en apparatuur met 10% bleekwater en 70% ethanol tijdens alle stappen van het protocol is belangrijk om besmetting van monsters te voorkomen. - Maak aliquots van reagentia, bijvoorbeeld reinigings buffers, van de extractie Kit om kruisbesmetting te voorkomen.
- Reinig de ruimte en uitrusting van de Bank met 10% bleekwater en 70% ethanol.
- De patiënt monsters op ijs ontdooien voordat de extractie wordt begonnen. Voor plasma/serum, ontdooien 1 mL aliquot monster. Voor CSF, ontdooien 500 μL aliquot van het monster.
Opmerking: Lysisstappen (4,5-4.8) van het extractie protocol verschillen tussen plasma/serum en CSF, maar vanaf stap 4,9 is het protocol identiek voor beide soorten biovloeistoffen. - Stel een verwarmingsblok in op 60 °C voor gebruik tijdens de lysisstap (4,6).
- Bereid de lysisbuffer en het drager RNA mengsel in een buis van 15 mL door toevoeging van 5,6 μL drager RNA en 0,9 mL lysisbuffer per monster12.
- Voeg voor plasma/serum 100 μL proteïnurine K, 1 mL monster en 0,8 mL lysisbuffer/drager RNA mengsel bereid in stap 4,4 in een gelabelde 2,0 mL buis. Meng door Pulse grondig voor 30 s op hoge snelheid12.
- Voeg voor CSF 125 μl proteïnase K, 500 μL van het monster, 1 ml lysisbuffer/Carrier RNA-mengsel en 250 μL weefsellysisbuffer toe aan een buis van 2,0 ml. Breng het volledige volume tot 2 mL door toevoeging van 125 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Meng door Pulse grondig voor 30 s op hoge snelheid12.
- Inincuberen monsters gedurende 30 minuten bij 60 °C in het verwarmingsblok12.
- Verwijder de monsters uit het verwarmingsblok en verlaag de temperatuur tot 56 °C. Breng de monsters terug naar de Bank en breng het lysaat over in nieuw gelabelde 15 ml tubes.
- Voor plasma/serum, voeg 1,8 ml nucleïnezuur binding bufferand mix voor 30 s door Pulse grondig12.
- Voeg voor CSF 3,6 ml nucleïnezuur binding buffer toe en meng voor 30 s door Pulse grondig12.
- Inincuberen monsters voor 5 min op ijs12.
- Plaats de kolom in de vacuüm connector. Open de kolom en steek een 20 mL Tube Extender in de kolom12.
- Pipetteer de inhoud van de buis van 15 mL direct in de bodem van de buis-extender, Vermijd het achterlaten van druppels op de wanden van de buis-extender.
- Schakel de vacuümpomp in met de schakelaar van de vacuüm connector gesloten. Zodra de druk is opgebouwd tot 900 mbar, opent u de klep van de vacuüm connector. Het voorbeeld wordt nu door de kolom stromen.
- Zodra alle lysaat uit de kolom is afgevoerd, zet u de pomp uit en opent u het valluik op de vacuüm connector, zodat de drukgradiënt wordt verlicht. Zodra de druk 0 mbar bereikt, sluit u de klep van de vacuüm connector en het valluik.
- Verwijder de 20 mL Tube extender, wees voorzichtig niet te passeren van de extender van een kolom over een naburige kolom, als dit kan monsters kruislings besmetten. Gooi de tube Extender weg.
- Voeg 600 μL van de eerste reinigings buffer toe aan kolom12.
- Laat de deksels van de buizen open en zet de vacuümpomp aan. Laat de manometer 900 mbar bereiken en zet vervolgens de schakelaar op de vacuüm connector in de open positie om de wasbuffer door de kolom te trekken.
- Schakel de vacuümpomp uit, open het valluik om de druk vrij te maken en ontlast de druk tot 0 mbar. Draai klep van de vacuüm connector op de gesloten positie.
- Voeg 750 μL van de tweede reinigings buffer toe aan de kolom en herhaal de stappen 4.16-4.1712.
- Voeg 750 μL MB ethanol toe aan de kolom en herhaal stappen 4.16-4.1712.
- Sluit de deksel van de kolom en plaats de kolom in een nieuwe 2,0 mL collectie buis. Gooi de vacuüm connector weg12.
- Centrifugeer de buis met de kolom bij 20.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur12.
- Plaats de kolom in een nieuw opvang buisje en open de deksel van de buis. Plaats een laboratorium weefsel over de top en incuberen bij 56 °C gedurende 10 min.12.
- Plaats de kolom in een schone 1,5 mL PCR-clean Tube en Pipetteer 100 μL elutie buffer (of moleculaire biologie klasse H2o (MB H2o)) direct in het midden van de kolom. Raak de kolom niet aan met een pipetpunt. Sluit de deksel en laat 3 min bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer op 20.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut om cfdna12te Elueer.
- Pipetteer het eluaat terug in de kolom en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Herhaal de centrifugeren op volle snelheid gedurende 1 minuut om cfdna een tweede keer te Elueer om de opbrengst te verhogen (volgens de aanbeveling van de fabrikant).
- Bewaar cfDNA in gelabelde DNase/RNase vrije PCR-clean tubes bij 4 °C of ga direct naar stap 5.
5. vacuüm concentratie van cfDNA
- Voeg de buisjes met een elzen cfDNA in de houders van de vacuüm concentrator en breng ze in balans. Open de deksels van de buizen. Stel de temperatuur van de vacuüm concentrator in op 23 °C.
-
Schakel de vacuümconcentrator in en schakel vervolgens de damp vanger in. Centrifugeer monsters voor 40 min of tot een eindvolume van 10,5-11 μL is bereikt.
- Als het volume lager is dan 10,5 μL, voeg dan een DNA-suspensie buffer of MB H2O toe om een eindvolume van 10,5 μl te bereiken.
- Pipetteer het volledige volume langs de wanden van de buis om rest DNA-fragmenten te verwijderen.
- Centrifugeer kort de monsters op een tafel centrifuge om druppels op de wanden van de buizen te verzamelen.
- Ga direct naar de voorversterker stap (stap 8) of bewaar samples bij 4 °C.
- Wikkel deksels van buizen in een laboratorium film om besmetting te voorkomen als ze worden opgeslagen voor later gebruik.
6. ontwerp en bereiding van primers en sondes
- Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers, en wild type en Mutant LNA-sondes, voor de doelstelling (en) van de interesse. Commercieel bestellen gelyofiliseerd primers en sondes (zie tabel van de materialen).
Opmerking: sequenties voor primers en sondes gericht op H3F3A p. K27M en andere doel mutaties voor pediatrische middellijn gliomen zijn te vinden in aanvullende tabel 3 van panditharatna et al., 20188. - Voordat u de gelyofiliseerde primers en sondes opent, centrifugeer kort de buizen. Voeg het juiste volume van de DNA-suspensie buffer of MB H2O toe, zoals vermeld op het productspecificatie blad, om de gelyofiliseerde primers en sondes te hervatten tot een concentratie van 100 μM.
- Draai een paar keer zachtjes op en neer om primers en sondes met een tafel centrifuge te mengen en kort te centrifugeren.
- Bereid 10 μM aliquots van primers en sondes voor door toevoeging van 10 μL 100 μM kolf aan 90 μL van de DNA-suspensie buffer of MB H2O.
- Bereid 1 μM aliquots van voorwaartse en omgekeerde primers (te gebruiken voor voor versterking), door toevoeging van 10 μL van de 10 μM primer tot 90 μL van de DNA-suspensie buffer of MB H2O.
- Bewaar primers en sondes bij 4 °C in luchtdichte donkere containers. Wikkel laboratorium film rond de deksels om verontreiniging te voorkomen, en bedek sondes in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Bewaar voelers bij-20 °C voor lange termijn opslag als ze niet regelmatig worden gebruikt.
7. selectie van positieve controles
-
Selecteer tumorweefsel genomisch DNA (gdna) monster (s) met bekende DNA-concentratie, die de mutatie van de belangstelling op een bekende allel frequentie herbergt om te worden gebruikt als een positieve controle.
- Gebruik 0,025 ng van positieve controle tumorweefsel DNA in de preamplificatie stap (stap 8).
Opmerking: deze DNA-invoer biedt een robuust positief signaal op dpcr (zoals bepaald door het uitvoeren van seriële verdunningen van het tumorweefsel gdna cellen H3F3A p. K27M mutatie8), terwijl de hoeveelheid vereiste monster wordt geminimaliseerd.
- Gebruik 0,025 ng van positieve controle tumorweefsel DNA in de preamplificatie stap (stap 8).
8. voor versterking van de doel-allelen
Opmerking: Preamplificatie protocol is per Jackson et al., 201613.
- Reinig de ruimte en uitrusting van de Bank met 10% bleekwater en 70% ethanol.
- Verkrijg 1 μM voorwaartse en omgekeerde primers, cfDNA-samples, gDNA-positieve controles en DNA-polymerase Master Mix, en stel op ijs.
-
Bereken het volume van de reagentia die nodig zijn om het gewenste aantal cfDNA-monsters en positieve controle vooraf te versterken, voor ofwel singleplex-of multiplex-preamplificatie als volgt:
- Voor singleplex-preamplificatie (om wild type en Mutant allelen voor een enkele mutatie van belang te versterken), bereidt u een PCR-reactiemengsel door 17,5 μL DNA polymerase Master Mix toe te voegen, en 3,5 μL voorwaartse en omgekeerde primers (100 nM) per sample13.
- Voor multiplex preamplificatie (om twee sets wild type en Mutant allelen voor twee mutaties van belang te versterken), bereidt u een PCR-reactiemengsel door toevoeging van 17,5 μL DNA polymerase Master Mix en 1,75 μL van elke set van voorwaartse en omgekeerde primers (50 nM) per monster 13.
Opmerking: bereid voldoende PCR-reactiemengsel voor het aantal monsters plus 10% extra om rekening te maken voor elke Pipetteer fout.
- Verdeel 24,5 μL van het PCR-reactiemengsel in elke put van een 8-well PCR-strip buis13.
- Verdeel 10,5 μL van het DNA-monster in de juiste put om het totale reactievolume op 35 μL13te brengen. Pipetteer het volledige volume 10 keer voorzichtig omhoog en omlaag om te mengen.
- Voer gedurende 3 minuten PCR-versterking uit bij 98 °C; 9 cycli van 98 °C gedurende 10 sec., gloeien temperatuur gedurende 3 min, 72 °C gedurende 30 s; en een verlenging bij 72 °C gedurende 2 min.13.
- Breng het volledige volume van het voorversterkte product over naar de gelabelde DNase/RNase vrije PCR-clean tubes en Verdun in 140 μL TE DNA suspensie buffer (pH 8,0)13.
- Wikkel de deksels van de buizen in de laboratorium film. Bewaar het voorversterkte product op 4 °C. Voor langdurig conservering, bewaren bij-20 °C.
9. detectie en kwantificering van doel-DNA met behulp van dPCR
- Reinig de ruimte en uitrusting van de Bank met 10% bleekwater en 70% ethanol.
- Stel 10 μM primers en sondes, genotypering Master Mix, en DNA monsters op ijs. Bewaar de druppel stabiliserend olie bij kamertemperatuur.
- Draai zachtjes en centrifugeer alle reagentia met uitzondering van druppel stabiliserend olie.
- Zorg ervoor dat de gecomprimeerde stikstof gascilinder die is bevestigd aan het druppel genererende instrument en het kwantificerings instrument (tabel met materialen) is ingesteld op 90 psi.
- Schakel het druppel genererende instrument en de computer in met de instrument software. Start de software en klik op Start initialiseren.
- Voer een hogedruk spoeling uit op het druppel genererende instrument als het niet in een week of langer is gebruikt.
- Bereid het dPCR-reactiemengsel voor 8 putjes van de PCR-strip buis plus 10% extra, door toevoeging van 220 μL genotypering Master Mix, 8,8 μL van het wild type van 10 μM en de Mutante voelers, 39,6 μL elk van 10 μM voorwaarts en omgekeerd primers, en 17,6 μL druppel stabiliserend olie14 .
- Meng het dPCR-reactiemengsel zachtjes door het volledige volume op en neer te pipetteren 10-20 keer. Niet Vortex of centrifuge na druppel stabiliserende olie is toegevoegd aan het reactiemengsel.
- Verkrijg een PCR 8-well strip buis en verdeel 38 μL van het dPCR-reactiemengsel direct in de bodem van elke put14. Verwijder eventuele bubbels met een schone pipetpunt.
Opmerking: PCR-strip buizen die dicht bij elkaar zitten of strak samen worden verpakt, kunnen resulteren in statische elektrische ladingen, waardoor coalescentie en ruissignaal worden veroorzaakt bij het analyseren van dPCR-gegevens. Vermijd deze, aliquot strip buisjes in afzonderlijke Biohazard zakken, voorkom oververpakking van de zakken en houd de buizen van elkaar wrijven. - Voeg 12 μL voorversterkte DNA-monster toe aan de juiste putjes van de PCR-strip buis. Voeg voor de negatieve controle 12 μL MB H2O toe.
Opmerking: Analyseer cfDNA-voorbeelden in replicaatwells. Voor CSF, analyseer ten minste in tweevoud, en voor plasma/serum analyseer elk monster in drievoud. - Pipetteer het volledige volume 10 keer omhoog en omlaag om het reactiemengsel met het DNA-monster te mengen.
- Verkrijg een nieuwe instrument chip voor druppel genererende instrumenten en Pipetteer het volledige volume van Wells 1-8 van de PCR-strip buis in de overeenkomstige kanalen A-H in de chip. Raak de onderkant van de kanalen niet aan met een pipetpunt.
- Een nieuwe schone PCR-strip buis en insert in het druppel genererende instrument verkrijgen. Scan of handmatig de droplet-genererende instrument chip-ID in de software op de instrument computer. Voer namen in voor elk van de 8 kanalen. Klik op Start de uitvoeren om te beginnen met dropletizing voorbeelden.
- Wanneer de dropletisatie is voltooid, verwijdert u de PCR-strip buis en past u strip buisjes toe.
- Breng de strook buis over naar een thermische cycler en weeg met een andere strook buis met 80 μL water per put.
- Program meer de thermische fiets condities14 as: 95 °c gedurende 10 min; 45 cycli van twee temperaturen: 95 °C gedurende 30 sec. en gloeien temperatuur gedurende 2 min; 98 °C gedurende 10 min; en houd deze vast bij 10 °C.
- Stel de helling snelheid in op 0,5 °C/s en stel het monstervolume in op 80 μL14.
- Wanneer thermische fietsen is voltooid, verwijdert u de strook buis en gaat u over naar het kwantificerings instrument. Verwijder de PCR-strip doppen en vervang deze door hoge-snelheidslimieten.
- Schakel het kwantificerings instrument en de aangesloten computer in met instrument software. Start de instrument software en klik op uitvoeren.
- Plaats de strip buis in het kwantificerings instrument.
- Verkrijg een nieuwe chip en scan van het kwantificerings instrument of voer de chip-ID handmatig in het instrument in. Plaats de chip in de machine.
- Plaats het metalen schild bovenop de chip en sluit de deksel van het apparaat.
- Voer in de computer software een naam in voor de dPCR-run en voor elk van de 8 kanalen (A-H). Selecteer snelle modus (die moet worden gebruikt met hoge snelheidslimieten) en klik op Start om de kwantificering te beginnen.
- Wanneer de kwantificering is voltooid, verwijder het metalen schild (om te worden opgeslagen en hergebruikt) en gooi de PCR-strip buis en-chip weg. Op de instrument computer bevat het run-logboek resultaat bestanden voor elke uitvoering. Gebruik de. FCS-bestanden voor elk voorbeeld om te analyseren met de analist software.
10. gegevensanalyse
- Start de analist software en open de. FCS bestanden om ruwe spectrale gegevens te analyseren. Selecteer onder analyseweergave de optie intact. Klik onder voorbeeldweergave op de selectievakjes naast elk van de 8 voorbeelden, zodat elk vak een vinkje heeft. De software zal signalen voor de mutanten (FAM) en wild type (HEX) allelen langs de x-en y-assen uitzetten.
- Gebruik de berekende matrixfunctie om de spectrale compensatie op intacte druppels aan te brengen volgens de instructies van de fabrikant15.
- Pas de asinstellingen aan onder Asopties. Stel de x-as in op een minimum van 0 en maximaal 30.000 en de y-as tot een minimum van-5.000 en maximaal 10.000. Wanneer druppel clusters zijn geïdentificeerd, past u de assen aan om de lege ruimte in de grafiek te verkleinen.
Opmerking: De positie van mutant en wild type clusters zal afhangen van de gebruikte sondes, de de en hun concentratie. - Selecteer het monster dat overeenkomt met de positieve controle tumorweefsel gDNA om de negatieve (cluster het dichtst bij de oorsprong), Mutant (cluster het dichtst bij de x-as), en wild type (cluster het dichtst bij de y-as) poorten instellen. Zorg ervoor dat de clusters verschillend zijn en gemakkelijk worden geïdentificeerd in een geslaagde test.
- Pas de poortinstellingen voor de positieve controle toe op alle voorbeelden door met de rechtermuisknop op het positieve controlemonster te klikken en op de optie te klikken om alle instellingen op geselecteerde samples toe te passen.
- Klik onder de grafische weergave op meerdere voorbeelden tab om plots voor alle geselecteerde samples te bekijken. Exporteer de afbeelding als een. TIF-bestand.
- Selecteer onder het tabblad werkruimte linksboven in het scherm de optie analyse exporteren (CSV) en sla het geanalyseerde gegevensbestand op als CSV-bestand.
- Open het CSV-bestand in Spreadsheet software om voor elk voorbeeld de aantallen negatief, wild type en Mutant druppel weer te geven. Bereken het MAF door het aantal door Poisson gecorrigeerde Mutante druppeltjes te delen door de som van de druppel aantallen van Poisson gecorrigeerde Mutant plus wild voor elk monster.
Opmerking: Gebruik het gecorrigeerde aantal van Poisson omdat Poisson-statistieken voor dat feit dat positieve druppeltjes meer dan één kopie van het doel-DNA kunnen bevatten, en dus het optellen van de positieve druppels mogelijk niet een nauwkeurige telling16opleveren.
Representative Results
Figuur 1 toont representatieve resultaten voor een succesvolle detectie van H3F3A p. K27M mutatie in voorversterkt plasma (linksboven) en CSF (rechtsboven paneel) cfdna van twee kinderen met dmg. cfDNA-monsters werden geanalyseerd in repliceren, maar slechts één representatieve grafiek wordt weergegeven voor elk type monster. De dPCR-plots vertonen een succesvolle druppel generatie, met 7-9 miljoen druppels per PCR-put (waarvan de meeste negatieve druppels zijn die geen doel-DNA bevatten). Een minimum van 7.000.000 druppels per PCR-goed duidt op een succesvolle dropletisatie, terwijl minder dan 7.000.000 duiden op falen van de test, in welk geval de gebruiker niet door moet gaan met gegevensanalyse. Figuur 1 toont een duidelijke scheiding tussen Mutant en wild type clusters langs respectievelijk de x-en y-as. Robuuste wild type clusters geven aan dat de cfDNA-extractie is gelukt omdat template DNA aanwezig is. Mutant clusters vertonen respectievelijk een MAF van 1,60% en 39,92% voor de plasma-en CSF-monsters, die een positieve detectie van de mutatie aantonen. Voor deze patiënten, dPCR resultaten zijn in overeenstemming met de tumor mutatie status, zoals bevestigd door genomische analyse van biopsie tumorweefsel8. De negatieve controle (onderste linker paneel) toont 0 Mutant en 0 wild type druppeltjes, wat aangeeft dat er geen besmetting van het PCR-reactiemengsel was. De positieve controle tumorweefsel gdna (onderste rechter paneel) toont de mutatie wordt gedetecteerd op de verwachte allel frequentie voor het specifieke tumor monster geselecteerd.
In Figuur 2worden representatieve resultaten getoond voor de mislukte opsporing van de mutatie van belangstelling, H3F3A p. K27M, in plasma cfdna van een kind met dmg. Mutatie status werd bevestigd door genomische analyse van tumorweefsel8. Representatieve resultaten van twee duplo-PCR-putten worden getoond (toppanelen). Het totale aantal druppels, inclusief negatieve druppels, is tussen de 7-9 miljoen per PCR-put, wat duidt op een succesvolle dropletisatie. De wild type clusters, uitgezet langs de y-as, vertonen ongeveer 7-8000 wild druppeltjes per PCR-goed voor het plasma cfdna, wat duidt op een succesvolle cfdna-extractie (omdat er een doel wild-DNA in het monster is). Echter, 0 Mutant druppeltjes worden gedetecteerd in het plasma monster. Het paneel linksonder toont negatieve controle (MB H2O) zonder wild type of Mutante druppeltjes; en de onderste rechter paneel toont de positieve controle voorversterkte tumorweefsel gDNA (0,025 ng) met positieve mutatie detectie. Zoals blijkt uit dit cijfer, kan de afwezigheid van mutatie detectie in het plasma niet noodzakelijkerwijs betekenen dat de patiënt wild type is voor de mutatie van belang, aangezien valse negatieven optreden8. In sommige gevallen, wanneer de mutatie wordt gemist in het plasma verzameld op vooraf biopsie, het wordt gedetecteerd in het plasma verkregen van dezelfde patiënt op een later tijdstip punt8.
Figuur 1 : Succesvolle opsporing van H3F3A p. K27M mutatie in voorversterkt plasma en CSF cfdna van kinderen met middellijn gliomas. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Vals negatieve resultaten verkregen uit de analyse van een voorversterkt plasma-cfDNA-monster van een patiënt die bekend is om de mutatie van belang, H3F3A p. K27M, in de tumor. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Hier hebben we onze methode voor het opsporen en kwantificeren van de allelische frequentie van tumor mutaties in cfDNA van patiënt vloeistof biopsie gepresenteerd. We benadrukken cruciale stappen voor het succes van deze methode, waaronder pre-analytische monsterverwerking, cfDNA-extractie, PCR-assay ontwerp en gegevensanalyse. Om het gebruikte monstervolume te beperken, wordt cfDNA geëxtraheerd uit 1 mL plasma, maar slechts 500 μL CSF. Bij het uitpakken uit CSF, het protocol voor extractie van 1 mL urine (na de cfDNA-extractie Kit handboek12) wordt gebruikt, volgens de aanbeveling van de fabrikant. Het verschil in monstervolume vereist tussen plasma en CSF is te wijten aan lagere niveaus van tumor-specifieke cfDNA in plasma in vergelijking met CSF van patiënten met hersentumoren, vereisen grotere monstervolumes voor mutatie detectie8. Als het monster beschikbaar is, kan meer dan 1 mL plasma worden geëxtraheerd om een hogere DNA-opbrengst te produceren. In het geval van pediatrische patiënten is het echter belangrijk om de hoeveelheid bloed zoveel mogelijk te minimaliseren, omdat zelfs een eenvoudige procedure zoals bloedverlies vermoeiend is voor pediatrische patiënten met kanker die stralings therapieën ondergaan. Extractie van 1 mL aliquots van plasma maakt ook het repliceren van extracties mogelijk, zodat de test kan worden herhaald (bijvoorbeeld in gevallen van falen in DNA-extractie of monster verontreiniging).
In een poging om elk monster gebruik dat niet strikt noodzakelijk is te verminderen, wordt cfDNA meestal niet gekwantificeerd. We hebben echter een bereik van cfDNA-concentraties gevonden tussen 0,2-2 ng/μL en 0,6-13 ng/μL in respectievelijk plasma en CSF. Gezien de geringe hoeveelheid cfDNA en het feit dat tumor-specifieke Mutante allelen op een lage frequentie aanwezig zijn, is een pre-amplificatie stap met behulp van dezelfde set primers die voor dPCR worden gebruikt nodig om de hoeveelheid doel-DNA in het monster significant te verhogen, wat helpt bij Mutatie detectie8. Het verdunnen van het voorversterkte product in de DNA-suspensie buffer biedt voldoende volume voor technische replicaten, wat helpt bij het onderscheiden van echte positieven. Omdat het aantal Mutante druppeltjes laag kan zijn (bijvoorbeeld tussen 0-2 Mutante druppeltjes in een plasma monster), is het opnemen van technische replicaten essentieel voor het oplossen van de mutatie status. Terwijl een PCR-goed 0 Mutant druppeltjes kan opleveren, kunnen de andere twee 1-2 opleveren voor een enkel plasma monster dat in drievaat wordt geanalyseerd; de opname van replicaten zorgt dus voor een grotere nauwkeurigheid bij het bepalen van de mutatie status. Het MAF wordt vervolgens berekend als het gemiddelde van de repliceer waarden.
Multiplexed pre-amplificatie (het voorversterkend wild type en het Mutante allelen van twee mutaties van belang) vergroot het nut van een enkel monster, omdat hetzelfde uitgangsmateriaal kan worden gebruikt om te testen op twee mutaties. Belangrijk is dat een multiplex preamplificatie product in singleplex kan worden geanalyseerd tijdens dPCR voor meer eenvoud, zoals hier beschreven. Beide preamplificatie-PCR en dPCR kunnen echter Multiplexed zijn. Wanneer multiplexing, voorwaarden moeten worden geoptimaliseerd voor beide sets van primers en sondes: primer gloeien temperaturen moeten vergelijkbaar zijn om samen te lopen in PCR-versterking, en sondes moeten worden ontworpen om verschillende clusters te genereren (op basis van fluorescerende signaal en intensiteit). Voer bij het valideren van een nieuwe set primers en voelers een gloeien temperatuurgradiënt uit om de optimale gloeien temperatuur te bepalen op basis van het door de fabrikant voorgestelde bereik. Voordat testen sondes op patiënt cfDNA specimens, valideren met behulp van synthetische DNA-constructies en/of tumorweefsel gDNA van verschillende ingangen (d.w.z., tot 10 ng).
Voor de detectie van mutant allelen met een grotere specificiteit en minder mismatches in de hybridisatie van de sonde naar het doel-DNA, worden vergrendelde nucleïnezuur (LNA) sondes gebruikt. LNA is een nucleïnezuur analoog met een methyleen brug die de 2 '-zuurstof en 4 '-koolstof van de ribose ring9verbindt. De methyleen brug vergrendelt het nucleïnezuur in een stijve bicyclische conformatie die flexibiliteit beperkt, thermische duplex stabiliteit verhoogt en de specificiteit van sonde hybridisatie verbetert om DNA10,18te targeten, 19. als er een enkele basis mismatch bestaat tussen LNA-sonde en template-DNA, zal de duplex vorming tussen sonde en doelwit destabiliseren. Als zodanig, LNA sondes verbeteren de specificiteit van sonde binding en resulteren in een hogere signaal-ruis verhouding11. Analyse van plasma en CSF van niet-CZS-zieke pediatrische patiënten heeft de specificiteit vastgesteld van onze assay met LNA-sondes gericht op H3F3A p. K27M, om te bepalen dat een allelische frequentie van gelijk aan of kleiner dan 0,001% als vals-positief wordt beschouwd 8. voor aanvullende overwegingen voor het optimaliseren van het ontwerp van sondes en primers, met inbegrip van GC-inhoud, ampliconlengte voor temp grootte, probe reporter kleurstoffen, en quenchers, verwijzen naar de richtlijnen van de dpcr-fabrikant14,17. Hoewel onze methode is geoptimaliseerd voor gebruik met het RainDance-systeem, kan het protocol worden aangepast voor gebruik met andere dPCR-platformen.
De hier gepresenteerde methode haalt kracht uit de hoge gevoeligheid en doel verrijking van dPCR, die het platform van keuze blijft voor het opsporen van zeldzame tumor mutaties in cfDNA. Hoewel krachtig, is dPCR beperkt in het aantal mutaties dat in één test kan worden getest. Een alternatief voor dPCR is Next generation sequencing (NGS), die meerdere mutaties in veel genen kan detecteren, waardoor het nut van een enkel monster toeneemt. NGS kan mutaties in CSF en plasma van patiënten met hersenstam gliomen20detecteren, echter, is momenteel minder gevoelig dan dpcr bij het opsporen van tumor mutaties in cfdna, met detectiegrenzen van 0,1-10% MAF vergeleken met 0,001% in PCR-gebaseerde benaderingen21 . dPCR realiseert ook een snellere doorlooptijd dan NGS, waardoor mutaties van belang snel kunnen worden opgespoord. De PCR-benadering is toepasbaar voor verschillende soorten kanker en kan worden uitgebreid om hotspot mutaties en gemethyleerd cfDNA22te detecteren.
De vloeibare biopsie is inderdaad in de kinderschoenen en zal verdere ontwikkeling vereisen voor het afstemmen van specifieke ziekten. Tumor monitoring in de context van tumor evolutie zal de volgende uitdaging zijn, waarbij een platform dat in staat is om opkomende mutaties met een hoge gevoeligheid te detecteren nodig zou zijn. Bovendien zullen platforms die in staat zijn om een verscheidenheid aan biomoleules (peptiden, cytokines, RNA) te detecteren, zeer nuttig zijn bij het beoordelen van de tumorrespons op de behandeling, evenals het bevorderen van gepersonaliseerde klinische interventies.
Disclosures
De methode die in dit manuscript wordt beschreven, is opgenomen in een internationale octrooiaanvraag "methoden voor het opsporen van kanker biomarkers" door Javad Nazarian & Eshini Panditharatna.
Acknowledgments
De auteurs willen de vrijgevigheid van alle patiënten en hun families erkennen. Dit werk werd gesteund door de financiering van de Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), de V Foundation (Atlanta, GA), het Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, klinisch en translationeel wetenschaps Instituut bij Children's National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), de Lilabean Stichting voor pediatrisch hersenkanker onderzoek (Silver Spring, MD), de jeugd hersenen tumor Foundation (Germantown, MD), de hersenen van de kinderen Tumor tissue Consortium (Philadelphia, PA), en rally Foundation voor kinderkanker onderzoek (Atlanta, GA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
