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Cancer Research

रोगी Biofluids में ट्यूमर एसोसिएटेड परिसंचरण डीएनए की जांच और निगरानी

Published: June 8, 2019 doi: 10.3791/59721
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 3, 1, 4,5, 1,2,5
1Center for Genetic Medicine, Children's National Health System, 2Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 3Dana-Farber Cancer Institute, 4Department of Neurology, University of California San Francisco, 5DIPG Centre of Expertise Zurich, Universitats-Kinderspital Zurich

Summary

यहाँ, हम रोगी जैविक तरल पदार्थ (बायोफ्लूइड्स) में मौजूद डीएनए में ट्यूमर दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हमारी छोटी बूंद डिजिटल polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (dPCR) आधारित विधि ट्यूमर उत्परिवर्तन allelic आवृत्ति (MAF) के परिमाणीकरण सक्षम बनाता है, निदान और ट्यूमर प्रतिक्रिया के अस्थायी निगरानी के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव पूरक की सुविधा.

Abstract

अग्रिम और दोहराने शल्य ऊतक नमूने के साथ जुड़े जटिलताओं आणविक उप वर्गीकरण और चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के अस्थायी निगरानी में सक्षम न्यूनतम इनवेसिव प्लेटफार्मों के लिए की जरूरत मौजूद है। यहाँ, हम सेल मुक्त डीएनए (cfDNA) में ट्यूमर दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए हमारे dPCR आधारित विधि का वर्णन, रोगी biofluids में आसानी से उपलब्ध है. हालांकि उत्परिवर्तनों कि प्रत्येक परख में के लिए परीक्षण किया जा सकता है की संख्या में सीमित, इस विधि संवेदनशीलता और विशिष्टता के एक उच्च स्तर प्रदान करता है. उत्परिवर्तन बहुतायत की निगरानी, के रूप में एमएएफ द्वारा गणना, चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, जिससे रेडियोग्राफिक इमेजिंग के लिए एक बहुत जरूरी पूरक प्रदान.

Introduction

आणविक विश्लेषण के लिए ट्यूमर ऊतक की उपलब्धता में सीमाओं के कारण, प्लाज्मा, सीरम और मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) सहित रोगी biofluids में ट्यूमर दैहिक उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम अत्यधिक संवेदनशील तरीकों के विकास के लिए एक की जरूरत है . उदाहरण के लिए, बाल चिकित्सा फैलाना midline gliomas (DMGs) उनके neuroanatomical स्थान के कारण एक चुनौती मौजूद है. पिछले एक दशक में, DMG ऊतक नमूनों की आणविक रूपरेखा इस ट्यूमर प्रकार1 में ड्राइवर उत्परिवर्तनों का पर्दाफाश किया है और उत्परिवर्तनों के स्थानिक और लौकिक विषमता से पता चला है, बायोप्सी एक रोग के भीतर एक रोगी की विशेषता के लिए आवश्यक बनाने उपसमूह और आणविक-लक्षित चिकित्सा2को बढ़ावा देने | इस प्रकार, नैदानिक परीक्षण अग्रिम निदान3,4,5,6पर ट्यूमर आणविक रूपरेखा के लिए सर्जिकल बायोप्सी को एकीकृत करने के लिए वकालत करते हैं । उपचार के दौरान, DMGs में चिकित्सीय प्रतिक्रिया की निगरानी एमआरआई करने के लिए सीमित है, जो छोटे परिवर्तन या ट्यूमर जीनोमिक विकास का पता लगाने के लिए संवेदनशीलता का अभाव है. एमआरआई भी ट्यूमर की साइट पर छद्म प्रगति, क्षणिक सूजन है कि इमेजिंग पर सही प्रगति mimics और ट्यूमर प्रतिक्रिया7की गलत व्याख्या misinform हो सकता है का पता लगाने के लिए प्रवण है. इस प्रकार, DMGs ट्यूमर उत्परिवर्तनों का पता लगाने और नैदानिक प्रतिक्रिया की निगरानी के एक विकल्प, न्यूनतम इनवेसिव साधन के लिए एक उच्च आवश्यकता के साथ एक ट्यूमर प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन जरूरतों को पूरा करने के लिए, हमने पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया है, और मिडलाइन ग्लिओमास8के साथ बच्चों के प्लाज्मा, सीरम और सीएसएफ से cfDNA में ट्यूमर उत्परिवर्तनों की एलाइजा आवृत्ति, मात्रा निर्धारित की है। यह देखते हुए कि बचपन DMGs अक्सर (gt; 80%) एक दैहिक lysine-to-methionine उत्परिवर्तन की स्थिति पर 27 histone संस्करण H3.1 (H3.1K27M, 20% मामलों के) या H3.3 (H3.3K27M, मामलों के 60%)1,इन और अन्य उत्परिवर्तनों DMGs की विशेषता (यानी, ACVR1, PIK3R1)के लिए लक्षित किया गया उत्परिवर्ती allele परिमाणीकरण cfDNA8का उपयोग कर . इस परख अनुक्रम विशिष्ट प्राइमर और जांच का उपयोग कर अन्य ट्यूमर प्रकार में हॉटस्पॉट उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए सिलवाया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा यह कैंसर की एक किस्म है जो cfDNA आधारित नैदानिक उपकरण और चिकित्सीय निगरानी के एकीकरण से लाभ होगा के लिए लागू बनाता है.

संवेदनशील cfDNA में कम allelic आवृत्ति उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए, हम एक छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (dPCR) आधारित दृष्टिकोण को रोजगार. इस विधि में, पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण dPCR मंच (जैसे, RainDance) का उपयोग कर 10 लाख बूंदों की एक सैद्धांतिक अधिकतम में विभाजित है, पीसीआर प्रति 7-9 लाख बूंदों के साथ अच्छी तरह से आम तौर पर प्रयोगात्मक देखा. नमूना विभाजन के उच्च डिग्री के कारण, सबसे अधिक केवल एक से दो डीएनए अणुओं प्रत्येक छोटी बूंद में मौजूद हो सकता है. पीसीआर प्रवर्धन और अनुक्रम-विशिष्ट फ्लोरोसेंट जांच संकरीकरण प्रत्येक छोटी बूंद में हो सकता है, इस तरह है कि प्रतिक्रियाओं के लाखों जगह ले. यह संवेदनशीलता को अधिकतम और दुर्लभ उत्परिवर्ती alleles का पता लगाने में सक्षम बनाता है, जो अन्यथा wildtype डीएनए की एक पृष्ठभूमि के खिलाफ नहीं चल पाता जा सकता है. बंद न्यूक्लिक एसिड (एलएनए) जांच का उपयोग बेमेल संकरण को सीमित करके और सटीक उत्परिवर्तनकापता लगाने 9 ,10,11का समर्थन करके परख की विशिष्टता को बढ़ाता है . यहाँ, हम नमूना प्रसंस्करण, cfDNA निष्कर्षण, लक्ष्य alleles, dPCR और डेटा विश्लेषण के preamplification के हमारे तरीकों का वर्णन.

Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों कैलिफोर्निया सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है (सैन फ्रांसिस्को, CA; आईआरबी #14-13895) और बच्चों की राष्ट्रीय स्वास्थ्य प्रणाली (वाशिंगटन, डीसी; आईआरबी #1339). रोगी या रोगी के अभिभावक से सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद specimens एकत्र और अध्ययन किया गया.

1. जैविक specimens के संग्रह और भंडारण के लिए आईआरबी प्रोटोकॉल के तहत रोगियों की सहमति

  1. लिखित सूचित सहमति के बाद रोगी के नमूने लीजिए प्रत्येक रोगी, या रोगी के अभिभावक से प्राप्त की जाती है, एक नैदानिक परीक्षण में भाग लेने के लिए या संबंधित संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित के रूप में biorepository के लिए.
    1. इस अध्ययन में शामिल मरीजों को एक मस्तिष्क ट्यूमर रेडियोग्राफिक के साथ का निदान किया गया. कोई बहिष्करण मापदंड उपयोग नहीं किए गए. रोगी या रोगी के अभिभावक से सूचित सहमति प्राप्त करने के बाद specimens एकत्र और अध्ययन किया गया.

2. रक्त संग्रह और प्लाज्मा या सीरम के पृथक्करण

  1. रक्त संग्रह ट्यूबों में एक 10.0 एमएल ड्रा का उपयोग कर रक्त का नमूना ले लीजिए। यदि प्लाज्मा के लिए रक्त इकट्ठा, का उपयोग करें K2- या K3-EDTA ट्यूब, heparin या cfDNA रक्त संग्रह ट्यूबों. यदि सीरम के लिए रक्त एकत्रित करते हैं, तो सीरम को अलग करने के लिए थक्का एक्टिवेटर और जेल युक्त जेल-बैरियर ट्यूबों का उपयोग करें।
    नोट: जबकि 10 एमएल को दोहराने के प्रयोगों को सक्षम करने की सिफारिश की जाती है, कम से कम 3 एमएल पर्याप्त होगा।
  2. ध्यान से संग्रह ट्यूब 10 बार अंतर्मुखी संग्रह ट्यूब अभिकर्मकों के साथ रक्त के नमूने मिश्रण करने के लिए।
  3. रक्त के नमूनों को छोड़ दें जिसमें से सीरम को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एकत्र किया जाएगा ताकि रक्त का थक्का हो सके। यदि रक्त प्रसंस्करण प्लाज्मा प्राप्त करने के लिए, तुरंत कदम 2.4 के लिए आगे बढ़ना.
    नोट: प्लाज्मा के लिए संसाधित किया जा रहा नमूने सेंट्रीफ्यूगेशन से पहले अधिकतम 2 ज के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है। हालांकि, रक्त आकर्षित से प्रसंस्करण के लिए एक तेजी से संक्रमण cfDNA गिरावट को कम करता है.
  4. सफेद और लाल रक्त कोशिका परतों से प्लाज्मा या सीरम को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक अपकेंद्रण में 15 मिनट के लिए 2,000 x ग्राम पर रक्त संग्रह ट्यूब।
  5. ध्यान रखना सफेद रक्त कोशिका परत परेशान नहीं करने के लिए (जो ऊपरी प्लाज्मा / सीरम परत और पैक लाल रक्त कोशिकाओं की निचली परत के बीच एक पतली रेखा रूपों), पिपेट प्लाज्मा के शीर्ष परत / बाँझ पॉलीप्रोपाइलीन पेंच-कैप क्रायोविएल्स में।
  6. विषय पहचान संख्या, नमूना प्रकार (प्लाज्मा या सीरम), और cryovials के लेबल पर संग्रह की तारीख रिकॉर्ड.
  7. उपयोग करने तक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में क्राइओविएल्स स्टोर करें। यदि एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर उपलब्ध नहीं है, तो एक सप्ताह तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।

3. सीएसएफ संग्रह और प्रसंस्करण

  1. एक शंट, काठ का पंचर, या सर्जरी से सीएसएफ लीजिए।
    नोट: ऐसी प्रक्रियाएं केवल तभी आयोजित की जानी चाहिए जब चिकित्सकों द्वारा आवश्यक समझा जाए। अतिरिक्त नमूना है कि परे नैदानिक उपयोग के लिए आवश्यक है अनुसंधान प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. सीएसएफ एकत्र की मात्रा को मापने और उसके रंग (खूनी, पीले, स्पष्ट) का ध्यान दें।
  3. सेलुलर मलबे गोली करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर संग्रह ट्यूब centrifuge।
  4. सीएसएफ के सुपरनेटेंट को पॉलीप्रोपाइलीन स्क्रू कैप क्रायोविल्स में समान रूप से 500 डिग्री सेल्सियस में स्थानांतरित करें।
  5. क्रायोविलकेकेकेकेकेके लेबल पर विषय पहचान संख्या, नमूना प्रकार, और नमूना संग्रह की तारीख रिकॉर्ड करें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक उपयोग करें।

4. तरल specimens से cfDNA का निष्कर्षण

  1. CFDNA निष्कर्षण किट पुस्तिका12में दिए गए निर्देशों के अनुसार cfDNA निष्कर्षण प्रोटोकॉल निष्पादित करें।
    1. 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ बेंच अंतरिक्ष और उपकरणों को साफ करें।
      नोट: एक पीसीआर हुड का उपयोग, दस्ताने के नियमित रूप से बदलने और बेंच अंतरिक्ष और प्रोटोकॉल के सभी चरणों के दौरान 70% इथेनॉल के साथ बेंच अंतरिक्ष और उपकरणों के लगातार decontamination नमूना संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है.
    2. क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए अभिकर्मकों, जैसे, बफर्स धोने के लिए, के alicots तैयार करें।
  2. निष्कर्षण शुरू करने से पहले बर्फ पर Thaw रोगी के नमूने. प्लाज्मा/सीरम के लिए, नमूने के 1 एमएल एलिकोट को था। सीएसएफ के लिए, नमूना के 500 $L alicot thaw.
    नोट: Lysis कदम (4.5-4.8) निष्कर्षण प्रोटोकॉल के प्लाज्मा के बीच अलग /
  3. lysis चरण (4.6) के दौरान उपयोग के लिए एक हीटिंग ब्लॉक को 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  4. 12 प्रति नमूना प्रति नमूना 5ण्6 एमएल वाहक आरएनए तथा 0ण्9 एमएल लाइस बफर जोड़कर 15एमएल ट्यूब में लाइसिस बफर तथा वाहक आरएनए मिश्रण तैयार कीजिए।
  5. प्लाज़्मा/सीरम के लिए 100 एल प्रोटीने के, 1 एमएल का नमूना, और 0.8 एमएल lysis बफर/वाहक आरएनए मिश्रण जोड़ें जो चरण 4.4 में लेबल किए गए 2.0 एमएल ट्यूब के लिए तैयार किया गया है। उच्च गति12पर 30 s के लिए पल्स भंवर द्वारा मिक्स .
    1. सीएसएफ के लिए, नमूने के 125 जेडएल प्रोटीने ज, 500 डिग्री सेल्सियस, 1 एमएल लाइसिस बफर/वाहक आरएनए मिश्रण, और 250 डिग्री एल ऊतक lysis बफर को 2.0 एमएल ट्यूब में जोड़ें। 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 125 डिग्री सेल्सियस जोड़कर पूर्ण मात्रा को 2 एमएल तक ले आओ। उच्च गति12पर 30 s के लिए पल्स भंवर द्वारा मिक्स .
  6. हीटिंग ब्लॉक12में 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट के नमूने ।
  7. हीटिंग ब्लॉक से नमूने निकालें और तापमान को 56 डिग्री सेल्सियस तक कम करें। बेंच के लिए नमूने लौटें और नए लेबल 15 एमएल ट्यूबों में lysate हस्तांतरण।
  8. प्लाज़्मा/सीरम के लिए, 12 पल्स भंवरद्वारा 30 s के लिए न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग बफरऔर मिश्रण के 1.8 एमएल जोड़ें।
    1. सीएसएफ के लिए 3.6 एमएल न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग बफर जोड़ें और पल्स भंवर12द्वारा 30 s के लिए मिश्रण।
  9. बर्फ12पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट के नमूने |
  10. वैक्यूम कनेक्टर में स्तंभ डालें. कॉलम खोलें और कॉलम12में 20 एमएल ट्यूब भरनेवाला डालें।
  11. ट्यूब भरनेवाला के नीचे सीधे 15 एमएल ट्यूब की सामग्री को पिपेट करें, ट्यूब एक्सटेंडर की दीवारों पर बूंदों को छोड़ने से बचें।
  12. वैक्यूम कनेक्टर के स्विच बंद होने के साथ, वैक्यूम पंप पर स्विच करें। एक बार दबाव 900 mbar करने के लिए बनाया गया है, वैक्यूम कनेक्टर के वाल्व खोलें. नमूना अब स्तंभ के माध्यम से प्रवाह होगा.
  13. एक बार सभी lysate स्तंभ से सूखा गया है, पंप बंद कर देते हैं और वैक्यूम कनेक्टर के लिए trapdoor खुला, दबाव ढाल से राहत. एक बार दबाव 0 mbar तक पहुँच जाता है, वैक्यूम कनेक्टर और trapdoor के वाल्व बंद करो.
  14. निकालें 20 एमएल ट्यूब भरनेवाला, एक पड़ोसी स्तंभ पर एक स्तंभ के भरनेवाला पारित करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, क्योंकि यह नमूने पार contaminate कर सकते हैं. ट्यूब भरनेवाला का निपटान.
  15. स्तंभ12में पहले धोने बफर के 600 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
  16. ट्यूबों के ढक्कन खुले छोड़ दें और वैक्यूम पंप को चालू करें। दबाव गेज 900 mbar तक पहुँचने दें, फिर कॉलम के माध्यम से धोने बफर आकर्षित करने के लिए वैक्यूम कनेक्टर पर स्विच को खुली स्थिति में बदलें।
  17. वैक्यूम पंप बंद करें, दबाव जारी करने के लिए ट्रैपडोर खोलें, और 0 mbar करने के लिए दबाव से छुटकारा। बंद स्थिति के लिए वैक्यूम कनेक्टर के वाल्व मुड़ें.
  18. कॉलम में सेकंड वॉश बफर के 750 डिग्री एल जोड़ें और चरण 4.16-4.1712को दोहराएं।
  19. कॉलम में एमबी ग्रेड इथेनॉल के 750 डिग्री एल जोड़ें और चरण 4.16-4.1712दोहराएँ।
  20. स्तंभ का लिड बंद करें और स्तंभ को एक नई 2.0 एमएल संग्रह ट्यूब के अंदर रखें. वैक्यूम कनेक्टर12के निपटान |
  21. कमरे के तापमान12पर 3 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर कॉलम के साथ ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें ।
  22. एक नया संग्रह ट्यूब में स्तंभ प्लेस और ट्यूब के ढक्कन खुला. शीर्ष पर एक प्रयोगशाला ऊतक रखें और 10 मिनट12के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें .
  23. कॉलम को एक साफ 1.5 एमएल पीसीआर-क्लीन ट्यूब और पिपेट 100 डिग्री सेल्सियस के एल एल्यूशन बफर (या आण्विक जीव विज्ञान ग्रेड एच2ओ (एमबी एच2ओ)) में सीधे कॉलम के केंद्र में रखें। एक पिपेट टिप के साथ स्तंभ को स्पर्श न करें। ढक्कन बंद करें और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए छोड़ दें।
  24. कमरे के तापमान पर 20,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 1 मिनट से इल्यूट cfDNA12.
  25. पिपेट को वापस कॉलम में और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  26. उपज बढ़ाने के लिए दूसरी बार (निर्माता की सिफारिश के अनुसार) को 1 मिनट के लिए पूरी गति से अपकेंद्रण दोहराएँ।
  27. 4 डिग्री सेल्सियस पर लेबल DNase/RNase मुक्त पीसीआर-क्लीन ट्यूबों में cfDNA स्टोर करें या सीधे चरण 5 पर आगे बढ़ें।

5. cfDNA की वैक्यूम एकाग्रता

  1. वैक्यूम कंथास्टर पर धारकों में eluted cfDNA युक्त ट्यूबों को सम्मिलित करें और संतुलित करें। नलों के ढक्कन खोलें। निर्वात संकेंद्रक के ताप को 23 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. वैक्यूम concentrator चालू करें, तो वाष्प जाल पर बारी. 40 मिनट के लिए या 10.5-11 डिग्री सेल्सियस के अंतिम खंड तक पहुंच गया है जब तक सेंट्रीफ्यूज नमूने.
    1. यदि आयतन 10.5 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, तो 10ण्5$ल के अंतिम खंड तक पहुँचने के लिए डीएनए निलंबन बफर या एमबी एच2ओ जोड़ें।
  3. अवशिष्ट डीएनए टुकड़े को दूर करने के लिए ट्यूब की दीवारों के साथ पूर्ण मात्रा पिपेट।
  4. नलों की दीवारों पर बूंदों को इकट्ठा करने के लिए टेबलटॉप अपकेंद्रित्र पर नमूनों को संक्षेप में अपकेंद्रण करें।
  5. preamplification चरण (चरण 8) के लिए सीधे आगे बढ़ें या 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने की दुकान।
    1. ट्यूब ों को प्रयोगशाला में लपेटें ताकि यदि बाद में उपयोग के लिए संग्रहित किया जाए तो संदूषण से बचा जा सके।

6. डिजाइन और प्राइमर और जांच की तैयारी

  1. आगे डिजाइन और रिवर्स प्राइमर, और wildtype और उत्परिवर्ती LNA जांच, ब्याज के लक्ष्य (ओं) के लिए. वाणिज्यिक आदेश lyophilized प्राइमर और जांच (सामग्री की तालिका को देखें).
    नोट: प्राइमर के लिए अनुक्रम और H3F3A p.K27M और बाल चिकित्सा मिडलाइन ग्लिओमास के लिए अन्य लक्ष्य उत्परिवर्तनों को लक्षित करने के लिए अनुक्रम पंडितरत्न एट अल की पूरक तालिका 3 में पाया जा सकता है, 20188.
  2. lyophilized प्राइमर और जांच खोलने से पहले, संक्षेप में ट्यूबों centrifuge. डीएनए निलंबन बफर या एमबी एच2ओ की उचित मात्रा जोड़ें, जैसा कि उत्पाद विनिर्देश शीट पर उल्लेख किया गया है, lyophilized प्राइमर को पुन: असाइन करने के लिए और 100 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता के लिए जांच।
  3. धीरे भंवर, पिपेट ऊपर और नीचे कई बार मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में अपकेंद्रित्र प्राइमर और एक tabletop अपकेंद्रित्र का उपयोग कर जांच.
  4. डीएनए निलंबन बफर या एमबी एच2ओ के 90 डिग्री एल के लिए 10 डिग्री सेल्सियस स्टॉक के 10 डिग्री एल जोड़कर प्राइमर और जांच के 10 डिग्री सेल्सियस तैयार करें।
  5. आगे और रिवर्स प्राइमर के 1 $M alicots तैयार (पूर्वाप्लीकरण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए), डीएनए निलंबन बफर या एमबी एच2ओ के 90 डिग्री एल करने के लिए 10 $M प्राइमर के 10 $L जोड़कर।
  6. हवा तंग अंधेरे कंटेनरों में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर और जांच स्टोर। प्रदूषण से बचने के लिए ढक्कन के आसपास प्रयोगशाला फिल्म लपेटें, और प्रकाश के संपर्क से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में जांच को कवर करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जांच स्टोर अगर वे नियमित रूप से इस्तेमाल नहीं किया जा रहा है।

7. सकारात्मक नियंत्रण का चयन

  1. ज्ञात डीएनए एकाग्रता के साथ ट्यूमर ऊतक जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) नमूना (एस) का चयन करें, जो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक ज्ञात एलीलिक आवृत्ति पर ब्याज के उत्परिवर्तन बंदरगाह।
    1. preamplification कदम (चरण 8) में सकारात्मक नियंत्रण ट्यूमर ऊतक डीएनए के 0.025 एनजी का प्रयोग करें।
      नोट: यह डीएनए इनपुट डीपीसीआर पर एक मजबूत सकारात्मक संकेत प्रदान करता है (के रूप में ट्यूमर ऊतक gDNA H3F3A p.K27M उत्परिवर्तन 8) के धारावाहिक कमजोर पड़ने के प्रदर्शन से निर्धारित है, जबकि आवश्यक नमूना की मात्रा को कम से कम.

8. लक्ष्य एलील्स का पूर्वार्धीकरण

नोट: Preamplification प्रोटोकॉल जैक्सन एट अल के अनुसार है, 201613|

  1. 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ बेंच अंतरिक्ष और उपकरणों को साफ करें।
  2. 1 $M आगे और रिवर्स प्राइमर, cfDNA नमूने, gDNA सकारात्मक नियंत्रण, और डीएनए polymerase मास्टर मिश्रण प्राप्त करें, और बर्फ पर सेट.
  3. cfDNA नमूनों और सकारात्मक नियंत्रण की वांछित संख्या preamplify करने के लिए आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा की गणना, या तो एकल plex या मल्टीप्लेक्स preamplification के लिए निम्नानुसार:
    1. एकल प्लेप्लेक्स preamplification के लिए (ब्याज की एक एकल उत्परिवर्तन के लिए wildtype और उत्परिवर्ती alleles preamplify करने के लिए), डीएनए पॉलिमरेज मास्टर मिश्रण के 17.5 $L जोड़कर पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करते हैं, और आगे और रिवर्स प्राइमर के 3.5 $L (100 एनएम) प्रति नमूना13.
    2. मल्टीप्लेक्स preamplification के लिए (ब्याज के दो उत्परिवर्तनों के लिए wildtype और उत्परिवर्ती alleles के दो सेट preamplify करने के लिए), डीएनए polymerase मास्टर मिश्रण के 17.5 $L और आगे और रिवर्स प्राइमर के प्रत्येक सेट के 1.75 डिग्री एल जोड़कर पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार (50 एनएम) नमूना प्रति 13.
      नोट: नमूनों की संख्या के लिए पर्याप्त पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार प्लस 10% किसी भी pipeting त्रुटि के लिए खाते के लिए अतिरिक्त.
  4. एक 8 अच्छी तरह से पीसीआर पट्टी ट्यूब13के प्रत्येक कुएं में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण के 24.5 डिग्री सेल्सियस का वितरण ।
  5. कुल अभिक्रिया मात्रा को 35 डिग्री सेल्सियल13तक लाने के लिए 10ण्5 डिग्री सेल्सियस डीएनए नमूने को उपयुक्त कूप में वितरित करें . धीरे pipette पूर्ण मात्रा ऊपर और नीचे 10 बार मिश्रण करने के लिए.
  6. 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन; 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 9 चक्र, 3 मिनट के लिए annealing तापमान, 30 s के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; और 2 मिनट13के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक विस्तार .
  7. पूर्वाल्पित उत्पाद की पूर्ण मात्रा को लेबल ्डनास/आरNase मुक्त पीसीआर-क्लीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 140 डिग्री सेल्सियस ते डीएनए निलंबन बफर (पीएच 8.0)13में पतला करें।
  8. प्रयोगशाला फिल्म में ट्यूबों के ढक्कन लपेटें. preamplified उत्पाद को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। दीर्घकालिक संरक्षण के लिए,-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

9. डीपीसीआर का उपयोग करलक्ष्य डीएनए का पता लगाने और परिमाणीकरण

  1. 10% ब्लीच और 70% इथेनॉल के साथ बेंच अंतरिक्ष और उपकरणों को साफ करें।
  2. बर्फ पर 10 डिग्री एम प्राइमर और जांच, जीनोटाइपिंग मास्टर मिश्रण, और डीएनए नमूने सेट करें। कमरे के तापमान पर छोटी बूंद स्थिर तेल स्टोर.
  3. धीरे भंवर और संक्षेप में अपकेंद्रण बूंद स्थिर तेल को छोड़कर सभी अभिकर्मकों.
  4. सुनिश्चित करें कि छोटी बूंद पैदा करने वाले उपकरण और परिमाणीकरण उपकरण (सामग्रीकीतालिका) से जुड़ा संपीडित नाइट्रोजन गैस सिलेंडर 90 साई पर सेट किया गया है।
  5. साधन सॉफ्टवेयर के साथ ड्रॉप पैदा साधन और कंप्यूटर पर बारी. सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें और प्रारंभ करना प्रारंभ करें क्लिक करें.
    1. यह एक सप्ताह या उससे अधिक में इस्तेमाल नहीं किया गया है, तो ड्रॉप उत्पादन साधन पर एक उच्च दबाव फ्लश चलाएँ।
  6. पीसीआर पट्टी ट्यूब के 8 कुओं के लिए dPCR प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार प्लस 10% अतिरिक्त, जीनोटाइपिंग मास्टर मिश्रण के 220 $L जोड़कर, 8.8 $L प्रत्येक 10 $M wildtype और उत्परिवर्ती जांच, 39.6L प्रत्येक 10 $M आगे और रिवर्स प्राइमर के, और 17.6L के स्थिर तेल14 / >.
  7. DPCR प्रतिक्रिया मिश्रण को 10-20 बार पूर्ण मात्रा को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। बूंद स्थिर तेल प्रतिक्रिया मिश्रण करने के लिए जोड़ा गया है के बाद भंवर या अपकेंद्रित्र मत करो.
  8. एक पीसीआर 8 अच्छी तरह से पट्टी ट्यूब प्राप्त करें और प्रत्येक अच्छी तरह से14के नीचे में सीधे dPCR प्रतिक्रिया मिश्रण के 38 डिग्री सेल्सियस वितरित . एक साफ पिपेट टिप के साथ किसी भी बुलबुले निकालें।
    नोट: पीसीआर स्ट्रिप ट्यूब जो इंटरलॉक्ड या कसकर एक साथ पैक किए जाते हैं, स्थिर विद्युत आवेशों में परिणाम दे सकते हैं, जिससे डीपीसीआर डेटा का विश्लेषण करते समय कोयला और शोर संकेत हो सकता है। इससे बचने के लिए, अलग बायोहैज़र बैग में एलिकोट स्ट्रिप ट्यूब, बैग को अधिक पैक करने से बचें, और ट्यूबको एक साथ रगड़ने से रखें।
  9. पीसीआर पट्टी ट्यूब के उपयुक्त कुओं के लिए preamplified डीएनए नमूने के 12 डिग्री एल जोड़ें. ऋणात्मक नियंत्रण के लिए 12 डिग्री सेल्सियस MB H2O जोड़ें।
    नोट: कुओं को दोहराने में cfDNA नमूनों का विश्लेषण करें। सीएसएफ के लिए, कम से कम डुप्लिकेट में विश्लेषण, और प्लाज्मा के लिए /
  10. डीएनए नमूने के साथ प्रतिक्रिया मिश्रण मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पूर्ण मात्रा धीरे pippette.
  11. एक नई छोटी बूंद पैदा साधन चिप प्राप्त करें और पाइपेट चिप में इसी चैनल ए-एच में पीसीआर पट्टी ट्यूब के 1-8 कुओं से पूर्ण मात्रा। एक पिपेट टिप के साथ चैनलों के नीचे को छूने से बचें।
  12. एक नया साफ पीसीआर पट्टी ट्यूब प्राप्त करने और छोटी बूंद पैदा करने के साधन में डालें। स्कैन या मैन्युअल रूप से साधन कंप्यूटर पर सॉफ्टवेयर में छोटी बूंद पैदा साधन चिप आईडी दर्ज करें। 8 चैनलों में से प्रत्येक के लिए नाम दर्ज करें. ड्रॉपलेटिंग नमूने प्रारंभ करने के लिए चलाएँ प्रारंभ करें क्लिक करें।
  13. जब dropletization पूरा हो गया है, पीसीआर पट्टी ट्यूब को हटाने और पट्टी ट्यूब टोपियां लागू होते हैं.
  14. एक थर्मल साइकिलर के लिए पट्टी ट्यूब स्थानांतरण और एक और पट्टी ट्यूब प्रति अच्छी तरह से पानी के 80 डिग्री एल युक्त के साथ संतुलन.
  15. कार्यक्रम थर्मल साइकिल चालन की स्थिति14 के रूप में: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस; दो तापमान के 45 चक्र: 30 s के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 2 मिनट के लिए अनीलन तापमान; 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; और 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    1. रैम्प दर को 0ण्5 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें तथा प्रतिदर्श मात्रा को 80 डिग्री एल14पर सेट करें।
  16. थर्मल साइकिल चालन पूरा हो गया है, पट्टी ट्यूब को हटाने और परिमाणीकरण साधन के लिए स्थानांतरण। पीसीआर पट्टी टोपियां निकालें और उच्च गति टोपियां के साथ बदलें।
  17. परिमाणीकरण साधन और साधन सॉफ्टवेयर के साथ जुड़े कंप्यूटर पर बारी. उपकरण सॉफ्टवेयर लॉन्च और एक रन सेटअपक्लिक करें।
  18. परिमाणीकरण उपकरण में पट्टी ट्यूब प्लेस.
  19. एक नया परिमाणीकरण साधन चिप प्राप्त करें और स्कैन या मैन्युअल रूप से साधन में चिप आईडी दर्ज करें। मशीन में चिप डालें.
  20. चिप के शीर्ष पर धातु ढाल प्लेस और साधन के ढक्कन बंद करें।
  21. कंप्यूटर सॉफ़्टवेयर में, dPCR चलाने के लिए और प्रत्येक 8 चैनल (A-H) के लिए कोई नाम दर्ज करें। फास्ट मोड का चयन करें (जो उच्च गति टोपियां के साथ इस्तेमाल किया जाना चाहिए) और परिमाणीकरण शुरू करने के लिए शुरू क्लिक करें.
  22. जब परिमाणीकरण पूरा हो गया है, धातु ढाल को दूर (बचाया और पुन: उपयोग किया जा करने के लिए) और पीसीआर पट्टी ट्यूब और चिप के निपटान. साधन कंप्यूटर पर, चलाएँ लॉग प्रत्येक रन के लिए परिणाम फ़ाइलें हो जाएगा। विश्लेषक सॉफ़्टवेयर के साथ विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए .fcs फ़ाइलों का उपयोग करें.

10. डेटा विश्लेषण

  1. विश्लेषक सॉफ्टवेयर लॉन्च करें और कच्चे वर्णक्रमीय डेटा का विश्लेषण करने के लिए .fcs फ़ाइलें खोलें. विश्लेषण दृश्य के अंतर्गत, अक्षुण्णका चयन करें. नमूना दृश्य के अंतर्गत, प्रत्येक 8 नमूनों में से प्रत्येक के आगे वाले बॉक्स क्लिक करें ताकि प्रत्येक बॉक्स में कोई चेक मार्क हो. सॉफ्टवेयर क्रमशः एक्स और वाई-एक्सल्स के साथ उत्परिवर्ती (FAM) और wildtype (HEX) alleles के लिए संकेत साजिश होगी।
  2. निर्माता के निर्देशों15के अनुसार, बरकरार बूंदों पर वर्णक्रमीय मुआवजे के लिए आवेदन करने के लिए परिकलित मैट्रिक्स समारोह का उपयोग करें।
  3. अक्ष विकल्प के अंतर्गत अक्ष सेटिंग्स समायोजित करें. x-अक्ष को न्यूनतम 0 और अधिकतम 30,000, और y-अक्ष को -5,000 और अधिकतम 10,000 पर सेट करें. जब छोटी बूंद क्लस्टर की पहचान की गई है, तो ग्राफ़ में रिक्त स्थान को कम करने के लिए अक्षों को समायोजित करें।
    नोट: उत्परिवर्ती और wildtype समूहों की स्थिति इस्तेमाल किया जांच पर निर्भर करेगा, फ्लोरोफोर और उनकी एकाग्रता.
  4. नकारात्मक (मूल के लिए निकटतम क्लस्टर), उत्परिवर्ती (एक्स-अक्ष के लिए निकटतम क्लस्टर), और wildtype (y-अक्ष के लिए निकटतम क्लस्टर) फाटकों सेट करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण ट्यूमर ऊतक gDNA के लिए इसी नमूना का चयन करें। सुनिश्चित करें कि समूहों अलग हैं और आसानी से एक सफल परख में पहचान की.
  5. सकारात्मक नियंत्रण नमूने पर राइट-क्लिक करके और चयनितनमूनों के लिए सभी सेटिंग्स को लागू करने के लिए विकल्प पर क्लिक करके सभी नमूनों के लिए सकारात्मक नियंत्रण के लिए गेट सेटिंग्स लागू करें।
  6. ग्राफ़िकल दृश्य के अंतर्गत, सभी चयनित नमूनों के लिए प्लॉट देखने के लिए एकाधिक नमूने टैब क्लिक करें. छवि को एक के रूप में निर्यात करें. TIF फ़ाइल.
  7. स्क्रीन के ऊपर बाईं ओर कार्यस्थान टैब के अंतर्गत, विश्लेषण निर्यात करें (csv) का चयन करें और विश्लेषण ित डेटा फ़ाइल को .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  8. प्रत्येक नमूने के लिए नकारात्मक, वाइल्डटाइप, और उत्परिवर्ती छोटी बूंद मायने रखता है देखने के लिए स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर में .csv फ़ाइल खोलें। Poisson सही उत्परिवर्ती छोटी बूंद गिनती का योग द्वारा Poisson सही उत्परिवर्ती और प्रत्येक नमूने के लिए जंगली टाइप छोटी बूंद मायने रखता है विभाजित करके एमएएफ की गणना।
    नोट: Poisson सही गिनती का प्रयोग करें क्योंकि Poisson आँकड़े उस तथ्य के लिए खाते है कि सकारात्मक बूंदों लक्ष्य डीएनए की एक प्रति से अधिक हो सकता है, और इस तरह सकारात्मक बूंदों संक्षेप एक सटीक गिनती16उपज नहीं हो सकता है .

Representative Results

चित्रा 1 DMG के साथ दो बच्चों से H3F3A p.K27M उत्परिवर्तन के सफल पता लगाने के लिए प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है (ऊपर बाएँ पैनल) और सीएसएफ (ऊपर सही पैनल) cfDNA. cfDNA नमूनों को दोहराने में विश्लेषण किया गया, लेकिन प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए केवल एक प्रतिनिधि ग्राफ दिखाया गया है. डीपीसीआर भूखंडों में सफल बूंद पीढ़ी दिखाई देती है, जिसमें पीसीआर प्रति 7-9 मिलियन बूंदें अच्छी तरह से होती हैं (जिनमें से अधिकांश नकारात्मक बूंदें होती हैं जिनमें लक्ष्य डीएनए शामिल नहीं होते हैं)। पीसीआर प्रति 7 लाख बूंदों की एक न्यूनतम अच्छी तरह से एक सफल dropletization इंगित करता है, जबकि कम से कम 7 लाख परख की विफलता का संकेत है, जो मामले में उपयोगकर्ता डेटा विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना नहीं चाहिए. चित्र1 क्रमशः x और y-axes के साथ उत्परिवर्ती और wildtype समूहों के बीच एक स्पष्ट जुदाई से पता चलता है. सशक्त वाइल्डटाइप क्लस्टर्स इंगित करते हैं कि cfDNA निष्कर्षण सफल रहा क्योंकि टेम्पलेट DNA मौजूद है. उत्परिवर्ती समूहों क्रमशः प्लाज्मा और सीएसएफ के नमूनों के लिए 1.60% और 39.92% की एक एमएएफ दिखाने के लिए, उत्परिवर्तन के सकारात्मक पता लगाने का प्रदर्शन. इन रोगियों के लिए, dPCR परिणाम ट्यूमर उत्परिवर्तन स्थिति के अनुसार कर रहे हैं, के रूप में बायोप्सी ट्यूमर ऊतक8के जीनोमिक विश्लेषण द्वारा पुष्टि की. नकारात्मक नियंत्रण (नीचे बाएँ पैनल) 0 उत्परिवर्ती और 0 wildtype बूंदों से पता चलता है, यह दर्शाता है कि पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण का कोई संदूषण नहीं था. सकारात्मक नियंत्रण ट्यूमर ऊतक gDNA (नीचे सही पैनल) विशेष रूप से चयनित ट्यूमर नमूना के लिए उम्मीद एलर्जी आवृत्ति पर पता लगाया जा रहा उत्परिवर्तन से पता चलता है.

चित्र 2में, प्रतिनिधि परिणाम ब्याज के उत्परिवर्तन का असफल पता लगाने के लिए दिखाए जाते हैं, H3F3A p.K27M, प्लाज्मा cfDNA में DMG के साथ एक बच्चे से. उत्परिवर्तन स्थिति ट्यूमर ऊतक8के जीनोमिक विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई थी . दो प्रतिकृति पीसीआर कुओं से प्रतिनिधि परिणाम (शीर्ष पैनल) दिखाए जाते हैं। नकारात्मक बूंदों सहित बूंदों की कुल संख्या, पीसीआर प्रति 7-9 मिलियन के बीच अच्छी तरह से है, सफल ड्रॉलेटाइजेशन का संकेत. Wildtype समूहों, y-अक्ष के साथ साजिश रची, प्लाज्मा cfDNA के लिए अच्छी तरह से पीसीआर प्रति लगभग 7-8,000 wildtype बूंदों दिखाने के लिए, सफल cfDNA निष्कर्षण का संकेत (के रूप में वहाँ लक्ष्य wildtype डीएनए नमूना में है). हालांकि, 0 उत्परिवर्ती बूंदों प्लाज्मा नमूने में पाए जाते हैं. नीचे बाएँ पैनल कोई wildtype या उत्परिवर्ती बूंदों के साथ नकारात्मक नियंत्रण (एमबी एच2ओ) से पता चलता है; और नीचे सही पैनल सकारात्मक नियंत्रण preamplified ट्यूमर ऊतक gDNA (0.025 एनजी) सकारात्मक उत्परिवर्तन का पता लगाने के साथ पता चलता है. जैसा कि इस चित्र में दिखाया गया है, प्लाज्मा में उत्परिवर्तन का पता लगाने के अभाव का मतलब यह नहीं हो सकता है कि रोगी ब्याज के उत्परिवर्तन के लिए वाइल्डटाइप है, क्योंकि झूठी नकारात्मकता8होती है। कुछ मामलों में, जब अग्रिम बायोप्सी पर एकत्र प्लाज्मा में उत्परिवर्तन याद किया जाता है, यह एक बाद के समय बिंदु8पर एक ही रोगी से प्राप्त प्लाज्मा में पाया जाता है।

Figure 1
चित्र 1 : का सफल पता लगाने H3F3A p.K27M उत्परिवर्तन preamplified प्लाज्मा और सीएसएफ cfDNA में मिडलाइन gliomas के साथ बच्चों से. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : ब्याज के उत्परिवर्तन बंदरगाह के लिए जाना जाता है एक रोगी से एक preamplified प्लाज्मा cfDNA नमूने के विश्लेषण से प्राप्त झूठी नकारात्मक परिणाम, H3F3A पी.के.27एम, ट्यूमर में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहाँ हम का पता लगाने और रोगी तरल बायोप्सी से cfDNA में ट्यूमर उत्परिवर्तनों के एलीक आवृत्ति मात्रा निर्धारित करने के लिए हमारी विधि प्रस्तुत किया है. हम पूर्व विश्लेषणात्मक नमूना प्रसंस्करण, cfDNA निष्कर्षण, पीसीआर परख डिजाइन, और डेटा विश्लेषण सहित इस विधि की सफलता के लिए महत्वपूर्ण कदम पर जोर। इस्तेमाल किया नमूना मात्रा को सीमित करने के लिए, cfDNA प्लाज्मा के 1 एमएल लेकिन सीएसएफ के केवल 500 डिग्री एल से निकाला जाता है। सीएसएफ से निकालने पर, 1 एमएल मूत्र से निष्कर्षण के लिए प्रोटोकॉल (cfDNA निष्कर्षण किट पुस्तिका12का पालन करना) का उपयोग किया जाता है, निर्माता की सिफारिश के अनुसार। प्लाज्मा और सीएसएफ के बीच आवश्यक नमूना मात्रा में अंतर मस्तिष्क ट्यूमर के साथ रोगियों के सीएसएफ की तुलना में प्लाज्मा में ट्यूमर-विशिष्ट cfDNA के निचले स्तर के कारण है, उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता8. यदि नमूना उपलब्ध है, प्लाज्मा के अधिक से अधिक 1 एमएल उच्च डीएनए उपज का उत्पादन करने से निकाला जा सकता है. हालांकि, बाल चिकित्सा रोगियों के मामले में, यह जब भी संभव इस्तेमाल किया रक्त की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में भी रक्त आकर्षित के रूप में एक सरल प्रक्रिया विकिरण उपचार के दौर से गुजर कैंसर के साथ बाल चिकित्सा रोगियों के लिए fatiguing है. प्लाज्मा के 1 एमएल alicots से निकालने भी extractions को दोहराने में सक्षम बनाता है, इस तरह है कि परख दोहराया जा सकता है (जैसे, डीएनए निष्कर्षण या नमूना संदूषण में विफलता के मामलों में).

किसी भी नमूना उपयोग है कि सख्ती से आवश्यक नहीं है को कम करने के प्रयास में, cfDNA आम तौर पर मात्रा निर्धारित नहीं है. तथापि, हमने प्लाज्मा तथा सीएसएफ में क्रमश 0ण्2-2 एनजी/जेडएल तथा 0ण्6-13 एनजी/जेडएल के बीच cfDNA सांद्रता की एक श्रेणी पाई है। cfDNA की कम मात्रा को देखते हुए, और तथ्य यह है कि ट्यूमर विशेष उत्परिवर्ती alleles एक कम आवृत्ति पर मौजूद हैं, एक पूर्व amplification कदम dPCR के लिए इस्तेमाल किया प्राइमर का एक ही सेट का उपयोग कर काफी नमूना में लक्ष्य डीएनए की मात्रा में वृद्धि करने के लिए आवश्यक है, में सहायता उत्परिवर्तन का पता लगाने8| डीएनए निलंबन बफर में पूर्व amplified उत्पाद को कम करने तकनीकी प्रतिकृति के लिए पर्याप्त मात्रा प्रदान करता है, जो सच सकारात्मक भेद में एड्स. क्योंकि उत्परिवर्ती बूंदों की संख्या कम हो सकती है (उदाहरण के लिए, प्लाज्मा नमूने में 0-2 उत्परिवर्ती बूंदों के बीच), तकनीकी प्रतिकृतियां का समावेश उत्परिवर्तन स्थिति को हल करने के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि एक पीसीआर अच्छी तरह से 0 उत्परिवर्ती बूंदों उपज सकता है, अन्य दो एक एकल प्लाज्मा नमूने के लिए 1-2 उपज हो सकता है triplicate में विश्लेषण; इस प्रकार, प्रतिकृति का समावेश अधिक सटीकता के लिए अनुमति देता है जब उत्परिवर्तन की स्थिति का निर्धारण. MAF तब प्रतिकृति मान के औसत के रूप में परिकलित की जाती है।

एकाधिकएक्सड पूर्व amplification (पूर्व प्रकार और ब्याज के दो उत्परिवर्तनों के उत्परिवर्ती alleles) एक ही नमूना की उपयोगिता बढ़ जाती है, के रूप में एक ही प्रारंभिक सामग्री दो उत्परिवर्तनों के लिए परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात यह है कि एक मल्टीप्लेक्स preamplification उत्पाद अधिक से अधिक सादगी के लिए dPCR के दौरान एकल plex में विश्लेषण किया जा सकता है, के रूप में यहाँ वर्णित. हालांकि, दोनों preamplification पीसीआर और डीपीसीआर multiplexed किया जा सकता है। जब multiplexing, शर्तों प्राइमर और जांच के दोनों सेट के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए: प्राइमर अनीलन तापमान पीसीआर प्रवर्धन में एक साथ चलाने के लिए समान होना चाहिए, और जांच अलग समूहों उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया जाना चाहिए ( फ्लोरोसेंट संकेत के आधार पर और तीव्रता)। प्राइमर और जांच का एक नया सेट मान्य करते समय, निर्माता द्वारा सुझाए गए रेंज के आधार पर इष्टतम अनीलन तापमान निर्धारित करने के लिए एक अनीलन तापमान ढाल चलाएं। रोगी cfDNA नमूनों पर जांच परीक्षण से पहले, उन्हें सिंथेटिक डीएनए का उपयोग कर मान्य निर्माण और / या ट्यूमर ऊतक विभिन्न आदानों के gDNA (यानी, अप करने के लिए 10 एनजी).

अधिक विशिष्टता और लक्ष्य डीएनए के लिए जांच के संकरीकरण में कम बेमेल के साथ उत्परिवर्ती alleles का पता लगाने के लिए, बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) जांच का उपयोग किया जाता है. LNA एक न्यूक्लिक एसिड एक मेथिलीन पुल के साथ अनुरूप है जो 2'-ऑक्सीजन और राइबोस रिंग9के 4'कार्बन को जोड़ता है। मेथिलीन पुल न्यूक्लिक एसिड को एक कठोर bicyclic conformation में बंद कर देता है जो लचीलापन को प्रतिबंधित करता है, थर्मल डुप्लेक्स स्थिरता को बढ़ाता है, और डीएनए10,18को लक्षित करने के लिए जांच संकरीकरण की विशिष्टता में सुधार करता है, 19. यदि LNA जांच और टेम्पलेट डीएनए के बीच एक एकल आधार बेमेल मौजूद है, तो जांच और लक्ष्य के बीच डुप्लेक्स गठन अस्थिर हो जाएगा. इस प्रकार, LNA जांच जांच बाध्यकारी की विशिष्टता में सुधार और एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात11में परिणाम. गैर-सीएनएस रोगग्रस्त बाल चिकित्सा रोगियों से प्लाज्मा और सीएसएफ का विश्लेषण LNA जांच H3F3A p.K27M को लक्षित करने के साथ हमारे परख की विशिष्टता की स्थापना की है, यह निर्धारित करने के लिए कि बराबर या उससे कम की एक allelic आवृत्ति 0.001% एक झूठी सकारात्मक माना जाता है 8. जांच और प्राइमर के डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त विचार के लिए, जिसमें जीसी सामग्री, amplicon आकार, जांच रिपोर्टर रंगों, और शमनक शामिल हैं , डीपीसीआर निर्माता दिशानिर्देश14,17का संदर्भ लें . हालांकि हमारी विधि RainDance प्रणाली के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित है, प्रोटोकॉल अन्य dPCR प्लेटफार्मों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

यहाँ प्रस्तुत विधि उच्च संवेदनशीलता और लक्ष्य संवर्धन dPCR द्वारा हासिल की है, जो cfDNA में दुर्लभ ट्यूमर उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पसंद का मंच बनी हुई है से शक्ति खींचता है. हालांकि शक्तिशाली, dPCR उत्परिवर्तनों कि एक ही परख में के लिए परीक्षण किया जा सकता है की संख्या में सीमित है. dPCR के लिए एक विकल्प अगली पीढ़ी अनुक्रमण (एनजीएस), जो कई जीन भर में कई उत्परिवर्तनों का पता लगा सकते है, एक ही नमूने की उपयोगिता में वृद्धि. NGS सीएसएफ में उत्परिवर्तन ों का पता लगाने और brainstem gliomas के साथ रोगियों के प्लाज्मा कर सकते हैं20, तथापि, वर्तमान में cfDNA में ट्यूमर उत्परिवर्तनों का पता लगाने में dPCR से कम संवेदनशील है, का पता लगाने की सीमा के साथ 0.1-10% MAF पीसीआर आधारित दृष्टिकोण में 0.001% की तुलना में21 . dPCR भी NGS की तुलना में तेजी से बदलाव समय प्राप्त करता है, ब्याज के उत्परिवर्तनों का तेजी से पता लगाने में सक्षम. पीसीआर दृष्टिकोण कैंसर के प्रकार में लागू है और हॉटस्पॉट उत्परिवर्तनों और methylated cfDNA22का पता लगाने के लिए विस्तार किया जा सकता है.

तरल बायोप्सी वास्तव में अपनी प्रारंभिक अवस्था में है और विशिष्ट रोगों के लिए सिलाई के लिए आगे के विकास की आवश्यकता होगी. ट्यूमर विकास के संदर्भ में ट्यूमर की निगरानी अगली चुनौती होगी, जहां उच्च संवेदनशीलता के साथ उभरते उत्परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम एक मंच की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, विभिन्न प्रकार के जैव अणुओं (पेप्टाइड्स, साइटोकिन्स, आरएनए) का पता लगाने में सक्षम प्लेटफार्म उपचार के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया का आकलन करने में अत्यधिक फायदेमंद होंगे, साथ ही व्यक्तिगत नैदानिक हस्तक्षेपों को आगे बढ़ाना।

Disclosures

इस पांडुलिपि में वर्णित विधि एक अंतरराष्ट्रीय पेटेंट आवेदन में शामिल है "कैंसर biomarkers का पता लगाने के लिए विधि" जावेद Nazarian और Eshini पंडितारत्न द्वारा.

Acknowledgments

लेखक सभी रोगियों और उनके परिवारों की उदारता को स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम मुंहतोड़ अखरोट फाउंडेशन (मध्यबर्ग, VA), वी फाउंडेशन (अटलांटा, GA), गैब्रिएला मिलर बच्चों के पहले डेटा संसाधन केंद्र, बच्चों के राष्ट्रीय में नैदानिक और अनुवाद विज्ञान संस्थान से धन द्वारा समर्थित किया गया था ( 5UL1TR001876-03), Musella फाउंडेशन (Hewlett, NY), मैथ्यू लार्सन फाउंडेशन (Franklin झील, एनजे), बाल चिकित्सा मस्तिष्क कैंसर अनुसंधान के लिए Lilabean फाउंडेशन (सिल्वर स्प्रिंग, एमडी), बचपन मस्तिष्क ट्यूमर फाउंडेशन (जर्मन शहर, एमडी), बच्चों के मस्तिष्क ट्यूमर ऊतक कंसोर्टियम (फिलाडेल्फिया, पीए), और बचपन कैंसर अनुसंधान के लिए रैली फाउंडेशन (अटलांटा, GA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) Teknova T0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) Becton Dickinson Diagnostics 367525 For plasma collection
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) Becton Dickinson Diagnostics 367895 For serum collection
Bleach General Lab Supplier
Buffer ATL Qiagen 19076
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes Streck 218961 cfDNA blood collection tubes (optional)
CentriVap Concentrator Labconco 7810010
Forward Primer Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
MiniAmp Thermal Cycler Thermofisher Scientific A37834
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) General Lab Supplier
Mutant Probe Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
PAXgene Blood ccfDNA tubes PreAnalytiX 768115 cfDNA blood collection tubes (optional)
PCR 8 well strip tube caps VWR 10011-786
PCR 8 well strip tubes Axygen PCR-0208-C
Pipette (p20, p200, p1000) General Lab Supplier
Pipette filter tips (p20, p200, p1000) General Lab Supplier
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix New England Biolabs Inc M0494S
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook  Qiagen cfDNA extraction kit handbook (2013 edition)
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Qiagen 55114 cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) 
QIAamp MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704 Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes
Qiavac 24 Plus Qiagen 19413 For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit
Raindance Consumable Kit Bio-Rad 20-04411 Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil
Raindance Sense Instrument Bio-Rad Quantification instrument (used in Protocol Step 9)
Raindance Source Instrument Bio-Rad Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9)
RainDrop Analyst II Software RainDance Technologies Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10)
Refrigerated Vapor Trap Savant RVT5105-115
Reverse Primer Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design
Smartblock 2 mL Eppendorf 05 412 506
TaqMan Genotyping Master Mix Thermofisher Scientific 4371353
Thermomixer C Eppendorf 14 285 562PM
WT Probe Integrated DNA Technologies, Inc. Custom design

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References

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Bonner, E. R., Saoud, K., Lee, S., Panditharatna, E., Kambhampati, M., Mueller, S., Nazarian, J. Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids. J. Vis. Exp. (148), e59721, doi:10.3791/59721 (2019).

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