Summary
Her presenterer vi en protokoll for å oppdage tumor somatiske mutasjoner i sirkulerende DNA tilstede i pasientens biologiske væsker (biofluids). Vår dråpe Digital polymerase kjedere reaksjon (dPCR)-basert metode muliggjør kvantifisering av tumor mutasjon allel frekvens (MAF), tilrettelegging en minimalt invasiv supplement til diagnostisering og timelig overvåking av tumor respons.
Abstract
Komplikasjoner forbundet med forhånds og gjenta kirurgiske vev prøvetaking presentere behovet for minimalt invasive plattformer i stand til molekylær sub-klassifisering og timelig overvåking av tumor respons på terapi. Her beskriver vi vår dPCR-baserte metode for påvisning av tumor somatiske mutasjoner i celle fritt DNA (cfDNA), lett tilgjengelig i pasientens biofluids. Selv om begrenset i antall mutasjoner som kan testes for i hver analyse, gir denne metoden en høy grad av følsomhet og spesifisitet. Overvåking av mutasjon overflod, som beregnes av MAF, tillater evaluering av tumor respons på terapi, og dermed gi en sårt tiltrengt supplement til radiografisk Imaging.
Introduction
På grunn av begrensninger i tilgjengeligheten av tumor vev for molekylær analyser, er det behov for utvikling av svært følsomme metoder i stand til å oppdage tumor somatiske mutasjoner i pasientens biofluids, inkludert plasma, serum og spinalvæske (CSF) . For eksempel, pediatric diffus midtlinjen gliomas (DMGs) presentere en utfordring på grunn av deres nevroanatomi plassering. I løpet av det siste tiåret, har molekylær profilering av DMG vevsprøver avdekket driver mutasjoner i denne tumor type1 og har avdekket romlige og timelige heterogenitet av mutasjoner, noe som gjør biopsi er nødvendig for karakteriserer en pasient i en sykdom undergruppe og fremme Molecularly-målrettet behandling2. Som sådan, kliniske studier talsmann for å integrere kirurgiske biopsier for tumor molekylær profilering på forhånd diagnose3,4,5,6. Under behandling, overvåking av terapeutisk respons i DMGs er begrenset til MRI, som mangler følsomhet for å oppdage små endringer eller tumor genomisk evolusjon. Mr er også tilbøyelig til å oppdage pseudoprogression, forbigående betennelse på stedet av svulsten som etterligner sann progresjon på Imaging og kan desinformere tolkning av tumor respons7. Således, DMGs representerer en svulst type med et høyt behov for en alternativ, minimalt invasiv måte å oppdage tumor mutasjoner og overvåking klinisk respons. For å møte disse behovene, har vi utviklet og optimalisert en protokoll for å oppdage, og kvantifisere den allel hyppigheten av, tumor mutasjoner i cfDNA fra plasma, serum og CSF av barn med midtlinjen gliomas8. Gitt at barndommen DMGs ofte (> 80%) havn en somatiske lysin-til-metionin mutasjon i posisjon 27 av histone variant H 3.1 (H 3.1 K27M, 20% av tilfellene) eller H 3.3 (H 3.3 K27M, 60% av tilfellene)1, disse og andre mutasjoner karakteristisk for DMGs (dvs. ACVR1, PIK3R1) ble målrettet for mutant allel kvantifisering bruker cfDNA8. Denne analysen kan skreddersys for å oppdage hotspot mutasjoner i andre tumor typer ved hjelp av sekvens-spesifikke primere og sonder. Allsidigheten til denne tilnærmingen gjør det aktuelt for en rekke kreftformer som ville ha nytte av integreringen av cfDNA-baserte diagnostiske verktøy og terapeutisk overvåking.
For å oppdage lav allel frekvens mutasjoner i cfDNA, benytter vi en dråpe Digital PCR (dPCR)-basert tilnærming. I denne metoden er PCR-reaksjonsblandingen delt opp i et teoretisk maksimum 10 000 000 dråper ved hjelp av dPCR-plattformen (for eksempel RainDance), med 7-9 millioner dråper per PCR vel vanligvis sett eksperimentelt. På grunn av den høye graden av prøve partisjonering, kan høyst bare én til to DNA-molekyler være til stede i hver dråpe. PCR forsterkning og sekvens spesifikk fluorescerende sonde hybridisering kan forekomme i hver dråpe, slik at millioner av reaksjoner finner sted. Dette maksimerer følsomheten og muliggjør påvisning av sjeldne mutant alleler, som ellers ville gå ubemerket mot en bakgrunn av wildtype DNA. Utnyttelsen av låste nukleinsyre acid (LNA) sonder forbedrer spesifisitet av analysen ved å begrense manglende samsvar hybridisering og støtte nøyaktig mutasjon deteksjon9,10,11. Her beskriver vi våre metoder for prøve behandling, cfDNA-ekstraksjon, preamplification av mål alleler, dPCR og dataanalyse.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her har blitt godkjent av den institusjonelle Review styret ved University of California San Francisco (San Francisco, CA; IRB #14-13895) og Children ' s National Health system (Washington, D.C.; IRB #1339). Prøvene ble samlet inn og studert etter å ha innhentet informert samtykke fra pasienten eller pasientens verge.
1. samtykkende pasienter under IRB protokoll for innsamling og lagring av biologiske prøver
-
Samle pasientprøver etter skriftlig informert samtykke er innhentet fra hver pasient, eller pasientens verge, for deltakelse i en klinisk studie eller for biorepository som godkjent av den respektive institusjonelle gjennomgang Board.
- Pasienter inkludert i denne studien ble diagnostisert med en hjernesvulst radiografisk. Ingen ekskluderings kriterier ble brukt. Prøvene ble samlet inn og studert etter å ha innhentet informert samtykke fra pasienten eller pasientens verge.
2. Blood innsamling og separasjon av plasma eller serum
- Samle Blodprøven med en 10,0 mL trekk inn i blodprøvetakings rørene. Hvis samle blod for plasma, bruk K2-eller K3-EDTA rør, heparin eller cfDNA blodprøvetakingsrør. Hvis samle blod for serum, bruk gel-barriere rør som inneholder Clot Aktivator og gel til separat serum.
Merk: Mens 10 mL er anbefalt for å muliggjøre replikere eksperimenter, vil et minimum av 3 mL være nok. - Snu prøvetakingsrøret forsiktig 10 ganger for å blande Blodprøven med reagensene for oppsamlings rør.
- La blodprøvene som serum skal samles i romtemperatur i 30 min for å tillate blod blodpropp. Hvis behandlingen av blod for å få plasma, Fortsett umiddelbart til trinn 2,4.
Merk: Prøvene som behandles for plasma kan oppbevares på is i maksimalt 2 timer før sentrifugering. Men en rask overgang fra blodprøve til behandling minimerer cfDNA degradering. - Sentrifuger blodprøvetakingsrør ved 2 000 x g for 15 min i en sentrifuge satt til 4 ° c for å skille plasma eller serum fra hvite og røde blodlegemer lag.
- Ta vare ikke å forstyrre det hvite blodlegemer lag (som danner en tynn linje mellom øvre plasma/serum lag og lavere lag av pakket røde blodlegemer), pipette det øverste laget av plasma/serum (som kan være klar, gul eller rosa i fargen) like i 1 mL alikvoter til steril polypropylen skrue-cap cryovials.
- Registrer subjekt identifikasjonsnummeret, prøve typen (plasma eller serum) og innsamlings datoen på cryovials etikett.
- Oppbevar cryovials i-80 ° c fryseren til den brukes. Om a-80 ° c fryser ikke er tilgjengelig, Oppbevar prøvene ved-20 ° c i opp til en uke.
3. CSF innsamling og bearbeiding
- Samle CSF fra en shunt, korsrygg punktering eller kirurgi.
Merk: Slike prosedyrer skal kun utføres dersom det anses som nødvendig av klinikere. Ekstra prøve utover det som er nødvendig for klinisk bruk kan brukes til forskningsformål. - Målvolumet av CSF samlet inn og gjøre oppmerksom på sin farge (blodig, gul, klar).
- Sentrifuger samlingen rør på 10 000 x g for 10 min ved 4 ° c til pellets mobilnettet rusk.
- Hvis du overfører CSF-supernatanten på samme måte i 500 μL alikvoter i polypropylen skrulokk cryovials.
- Registrer subjekt identifikasjonsnummeret, prøve typen og datoen for prøve samlingen på etiketten til cryovials. Oppbevares ved-80 ° c til bruk.
4. ekstraksjon av cfDNA fra flytende prøver
- Utfør cfDNA utvinnings protokoll i henhold til instruksjonene i håndboken for cfDNA Extraction Kit12.
- Rengjør benken plass og utstyr med 10% blekemiddel og 70% etanol.
Merk: Bruk av en PCR-hette, regelmessig skifte av hansker og hyppig rensing av benkplass og utstyr med 10% blekemiddel og 70% etanol under alle trinnene i protokollen er viktig for å unngå prøve kontaminering. - Klargjør alikvoter av reagenser, for eksempel vaske buffere, fra avsugs settet for å unngå krysskontaminering.
- Rengjør benken plass og utstyr med 10% blekemiddel og 70% etanol.
- Tin pasientprøver på is før du begynner ekstraksjon. For plasma/serum, Tin 1 mL alikvot av prøven. For CSF, Tin 500 μL alikvot av prøven.
Merk: Lyse trinn (4,5-4.8) av utvinnings protokollen varierer mellom plasma/serum og CSF, men fra trinn 4,9 og framover, er protokollen identisk for begge typer biofluids. - Sett en varme blokk til 60 ° c for bruk under lyse Rings trinnet (4,6).
- Klargjør lyseringsbufferen og transportør RNA-blandingen i et 15 mL rør ved å tilsette 5,6 μL av bære-RNA og 0,9 mL lyseringsbuffer per prøve12.
- For plasma/serum, tilsett 100 μL proteinase K, 1 mL prøve, og 0,8 mL av lyseringsbuffer/carrier RNA-blanding fremstilt i trinn 4,4 til en merket 2,0 mL slange. Bland med puls virvlingen for 30 s ved høy hastighet12.
- For CSF, tilsett 125 μL proteinase K, 500 μL av prøven, 1 mL lyseringsbuffer/carrier RNA-blanding og 250 μL vevs lyseringsbuffer til et 2,0 mL rør. Ta med hele volumet opptil 2 mL ved å tilsette 125 μL av 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Bland med puls virvlingen for 30 s ved høy hastighet12.
- Ruge prøver i 30 minutter ved 60 ° c i varme blokken12.
- Fjern prøvene fra varme blokken og Senk temperaturen til 56 ° c. Returner prøvene til benken og Overfør lysat til nye merket 15 mL rør.
- For plasma/serum, tilsett 1,8 mL nukleinsyre syre binding bufferand mix for 30 s ved puls virvlingen12.
- For CSF, tilsett 3,6 mL nukleinsyre syre binding buffer og bland i 30 s ved puls virvlingen12.
- Ruge prøver for 5 min på is12.
- Sett kolonnen inn i vakuum kontakten. Åpne kolonnen og sett inn en 20 mL tube Extender-enhet i kolonnen12.
- Pipetter innholdet i 15 mL rør direkte inn i bunnen av røret Extender, unngå å forlate dråper på veggene i røret Extender.
- Med bryteren på vakuum kontakten lukket, slå på vakuumpumpen. Når trykket har bygget til 900-mbar, åpner du ventilen til vakuum kontakten. Prøven vil nå flyte gjennom kolonnen.
- Når alle lysat har blitt drenert fra kolonnen, slå av pumpen og åpne falldør til vakuum kontakten, lindre trykket gradient. Når trykket når 0 mbar, Steng ventilen på vakuum kontakten og falldør.
- Fjern 20 mL tube Extender, vær forsiktig så du ikke passerer Extender av en kolonne over en nærliggende kolonne, da dette kan kryss-forurense prøvene. Kast slangen Extender-enheten.
- Tilsett 600 μL av første vaskebuffer i kolonne12.
- La lokk av rør være åpne og slå på vakuumpumpen. La trykkmåleren nå 900 mbar, og Drei deretter bryteren på vakuum kontakten til den åpne posisjonen for å trekke vaske bufferen gjennom søylen.
- Slå av vakuumpumpen, åpne falldør for å løsne trykket, og avlaste trykket til 0 mbar. Skru ventilen på vakuum kontakten til lukket stilling.
- Tilsett 750 μL av andre vaskebuffer i kolonnen og gjenta trinn 4.16-4.1712.
- Legg 750 μL av MB grad etanol til kolonnen og gjenta trinn 4.16-4.1712.
- Lukk lokket på kolonnen og plasser kolonnen inne i et nytt 2,0 mL prøvetakingsrør. Kast vakuum kontakten12.
- Sentrifuger røret med søylen ved 20 000 x g i 3 min ved romtemperatur12.
- Plasser kolonnen i et nytt oppsamlings rør og åpne lokket på røret. Plasser et laboratorie vev over toppen og ruge ved 56 ° c i 10 min12.
- Plasser kolonnen i en ren 1,5 mL PCR-Clean slange og pipette 100 μL av eluering buffer (eller molekylærbiologi klasse H2O (MB H2o)) direkte inn i midten av kolonnen. Ikke berør kolonnen med en pipette. Lukk lokket og la det ligge i romtemperatur i 3 minutter.
- Sentrifuger ved 20 000 x g ved romtemperatur i 1 min til eluere cfDNA12.
- Pipetter eluatet tilbake i kolonnen og ruge ved romtemperatur i 3 min.
- Gjenta sentrifugering ved full hastighet i 1 min til eluere cfDNA en gang til for å øke utbyttet (i henhold til produsentens anbefaling).
- Oppbevar cfDNA i merket DNase/RNase gratis PCR-Clean rør ved 4 ° c eller gå direkte til trinn 5.
5. vakuum konsentrasjon av cfDNA
- Sett inn og balanser rørene som inneholder eluert cfDNA, til holdere på vakuum konsentratoren. Åpne lokkene på rørene. Still inn temperaturen på vakuum konsentratoren til 23 ° c.
-
Slå på vakuum konsentratoren, og slå deretter på damp fellen. Sentrifuge prøver for 40 min. eller til et endelig volum på 10,5-11 μL er nådd.
- Hvis volumet er under 10,5 μL, tilsett DNA suspensjon buffer eller MB H2O for å nå et endelig volum på 10,5 μL.
- Pipetter hele volumet langs veggene i røret for å fjerne rester av DNA-fragmenter.
- Kort sentrifuge prøvene på en tabletop sentrifuge å samle dråper på veggene i rørene.
- Gå direkte til preamplification trinn (trinn 8) eller lagre prøver ved 4 ° c.
- Pakk lokk av rør i en laboratorie film for å unngå forurensning hvis de er lagret for senere bruk.
6. design og utarbeidelse av primere og sonder
- Design forover og bakover primere, og wildtype og mutant LNA sonder, for mål (s) av interesse. Kommersielt bestille lyofilisert primere og sonder (se tabell over materialer).
Merk: sekvenser for primere og sonder rettet mot H3F3A p. K27M og andre mål mutasjoner for pediatric midtlinjen gliomas finnes i supplerende tabell 3 av Panditharatna et al., 20188. - Før åpning av lyofilisert primere og sonder, sentrifuge rørene kort. Tilsett riktig volum av DNA suspensjon buffer eller MB H2O, som notert på produkt spesifikasjonsarket, for å resuspend lyofilisert primere og sonder til en konsentrasjon av 100 μM.
- Forsiktig Vortex, Pipetter opp og ned flere ganger for å mikse og kort sentrifuger primere og sonder ved hjelp av en tabletop sentrifuge.
- Klargjør 10 μM-alikvoter av primere og sonder ved å tilsette 10 μL av 100 μM-lager til 90 μL av DNA-suspensjon buffer eller MB H2O.
- Forbered 1 μM-alikvoter fremover og omvendt grunning (som skal brukes til preamplification) ved å tilsette 10 μL av 10 μM primer til 90 μL av DNA-suspensjon buffer eller MB H2O.
- Store primere og sonder ved 4 ° c i lufttette mørke beholdere. Wrap laboratorie film rundt lokk for å unngå forurensning, og dekke sonder i aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys. Store sonder ved-20 ° c for langtidslagring hvis de ikke brukes regelmessig.
7. valg av positive kontroller
-
Velg tumor vev genomisk DNA (gDNA) sample (s) med kjent DNA-konsentrasjon, som havner mutasjon av interesse på en kjent allel frekvens som skal brukes som en positiv kontroll.
- Bruk 0,025 ng av positiv kontroll tumor vev DNA i preamplification trinn (trinn 8).
Merk: Dette DNA-inngang gir et robust positivt signal på dPCR (som bestemmes ved å utføre seriell fortynninger av tumor vev gDNA harboring H3F3A p. K27M mutasjon8) mens minimere mengden av prøven som kreves.
- Bruk 0,025 ng av positiv kontroll tumor vev DNA i preamplification trinn (trinn 8).
8. Preamplification av mål alleler
Merk: Preamplification protokollen er som per Jackson et al., 201613.
- Rengjør benken plass og utstyr med 10% blekemiddel og 70% etanol.
- Få 1 μM forover og bakover primere, cfDNA prøver, gDNA positive kontroller, og DNA polymerase Master mix, og satt på isen.
-
Beregn volumet av reagenser som trengs for å preamplify det ønskede antall cfDNA-prøver og positiv kontroll, for enten singleplex eller multiplex preamplification som følger:
- For singleplex preamplification (for å preamplify wildtype og mutant alleler for en enkelt mutasjon av interesse), klargjør du PCR reaksjonsblandingen ved å tilsette 17,5 μL av DNA-polymerase Master mix, og 3,5 μL forover og revers primere (100 nM) per prøve13.
- For multiplex preamplification (for å preamplify to sett med wildtype og mutant alleler for to mutasjoner av interesse), klargjør du PCR reaksjonsblandingen ved å tilsette 17,5 μL av DNA-polymerase Master mix og 1,75 μL av hvert sett med forover-og revers-primere (50 nM) per prøve 13 i år.
Merk: klargjør nok PCR reaksjons blanding for antall prøver pluss 10% ekstra for å gjøre rede for eventuelle pipettering feil.
- Dispensere 24,5 μL av PCR-reaksjonsblandingen i hver brønn på en 8-brønn PCR-rør13.
- Dispensere 10,5 μL av DNA-prøven i riktig brønn for å bringe det totale reaksjons volumet til 35 μL13. Pipetter hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande.
- Utfør PCR forsterkning ved 98 ° c i 3 min; 9 sykluser med 98 ° c i 10 s, annealing temperatur i 3 min, 72 ° c i 30 s; og en forlengelse ved 72 ° c for 2 min13.
- Overfør hele volumet av preamplified produkt til merket DNase/RNase-frie PCR-Clean-rør og fortynnet i 140 μL TE DNA fjærings buffer (pH 8,0)13.
- Pakk lokkene på rørene i laboratorie film. Oppbevar det preamplified produktet ved 4 ° c. Oppbevares ved-20 ° c for langtidsbevaring.
9. deteksjon og kvantifisering av Target DNA bruke dPCR
- Rengjør benken plass og utstyr med 10% blekemiddel og 70% etanol.
- Sett 10 μM primere og sonder, genotyperingteknologi Master mix, og DNA-prøver på isen. Oppbevar dråpe stabiliserings oljen ved romtemperatur.
- Vortex og kort sentrifuger alle reagenser med unntak av dråpe stabiliserende olje.
- Sørg for at den komprimerte nitrogen gassflasken som er festet til dråpe-generering instrumentet og det kvantifisering instrumentet (materialfortegnelsen) er satt til 90 PSI.
- Slå på den drop-generering instrument og datamaskinen med instrumentet programvare. Start programvaren, og klikk Start initialisering.
- Kjør et høyt trykk flush på drop generere instrumentet hvis det ikke har vært brukt i en uke eller mer.
- Klargjør dPCR reaksjons blanding for 8 brønner på PCR-båndet pluss 10% ekstra, ved å tilsette 220 μL av genotyperingteknologi Master mix, 8,8 μL hver av 10 μM wildtype og mutant sonder, 39,6 μL hver av 10 μM forover og bakover primere, og 17,6 μL av dråpe stabiliserings olje14 .
- Bland forsiktig dPCR reaksjonsblandingen ved å pipettering hele volumet opp og ned 10-20 ganger. Ikke Vortex eller sentrifuger etter dråpe stabiliserende olje har blitt tilsatt til reaksjonsblandingen.
- Skaff en PCR 8-brønn stripe rør og dispensere 38 μL av dPCR reaksjons blanding direkte inn i bunnen av hver brønn14. Fjern eventuelle bobler med en ren pipette.
Merk: PCR-interlocked som er pakket sammen, kan føre til statiske elektriske ladninger, noe som forårsaker Koalesens og støyende signaler ved analysering av dPCR data. For å unngå dette, alikvot stripe rør i separate Biohazard poser, unngå over-pakking posene, og holde rørene fra å gni sammen. - Tilsett 12 μL av preamplified DNA-prøve til de riktige brønnene til PCR strimmelen røret. For negativ kontroll, tilsett 12 μL av MB H2O.
Merk: Analyser cfDNA-prøver i replikere brønner. For CSF, analysere minst i duplikat, og for plasma/serum analysere hver prøve i tre eksemplarer. - Pipetter hele volumet opp og ned 10 ganger for å blande reaksjonsblandingen med DNA-prøven.
- Skaff en ny dråpe-generering instrument chip og pipette hele volumet fra brønner 1-8 av PCR Strip tube inn i tilsvarende kanaler A-H i chip. Unngå å berøre bunnen av kanalene med en pipette spissen.
- Skaff en ny ren PCR strimmel tube og sett inn i dråpe-generering instrumentet. Skann eller manuelt angi dråpe-generering instrument chip ID i programvaren på instrumentet datamaskinen. Angi navn for hver av de åtte kanalene. Klikk Start Kjør for å starte dropletizing prøver.
- Når dropletization er ferdig, fjerner du PCR strimmel røret og påfører bånd rør dekslene.
- Overfør strimmel røret til en termisk cycler og balanse med en annen stripe rør som inneholder 80 μL av vann per brønn.
- Programmere de termiske sykkel forholdene14 som: 95 ° c i 10 min; 45 sykluser med to temperaturer: 95 ° c for 30 s og annealing temperatur i 2 minutter; 98 ° c i 10 min; og hold ved 10 ° c.
- Still inn rampe hastigheten til 0,5 ° c/s og sett prøvevolumet til 80 μL14.
- Når termisk sykling er fullført, fjerner du strimmel røret og overfører det til det kvantifisering instrumentet. Fjern PCR-caps og Skift ut med høyhastighets caps.
- Slå på det kvantifisering instrumentet og den tilkoblede datamaskinen med instrument programvare. Start instrumentet programvare og klikk setup en Kjør.
- Sett strimmel røret inn i det kvantifisering instrumentet.
- Skaff en ny kvantifisering instrument brikke og Skann eller angi chip-ID-en manuelt i instrumentet. Sett brikken inn i maskinen.
- Plasser metall skjoldet på toppen av brikken og Lukk lokket på instrumentet.
- Skriv inn et navn for dPCR Run og for hver av de 8 kanalene (A-H) i datamaskinprogramvaren. Velg fast Mode (som må brukes med høyhastighets caps) og klikk Start for å starte kvantifisering.
- Når kvantifisering er fullført, fjerner du metall skjoldet (som skal lagres og gjenbrukes) og kaster PCR-røret og chip-en. På instrument datamaskinen vil Run log inneholde resultat filer for hver kjøring. Bruk. FCS filer for hver prøve å analysere med analytiker programvaren.
10. data analyse
- Start analytiker programvaren og åpne. FCS filer for å analysere rå Spectral data. Under analysevisning velger du intakt. Under eksempel visning klikker du boksene ved siden av hvert av de åtte eksemplene slik at det er en hake i hver boks. Programvaren vil plotte signaler for mutant (FAM) og wildtype (HEX) alleler langs x-og y-akser, henholdsvis.
- Bruk beregnet matrise-funksjonen for å søke om Spectral kompensasjon på intakt dråper, i henhold til produsentens instruksjoner15.
- Juster innstillingene for akse under Alternativer for akse. Sett x-aksen til minimum 0 og maksimum 30 000, og y-aksen til minimum-5 000 og maksimum 10 000. Når dråpe grupper er identifisert, justerer du akser for å redusere tom plass i grafen.
Merk: Plasseringen av mutant og wildtype klynger vil avhenge av sonder som brukes, fluoroforen og deres konsentrasjon. - Velg eksempel tilsvarende den positive kontrollen tumor vev gDNA å sette den negative (klyngen nærmest opprinnelsen), mutant (klynge nærmest x-aksen), og wildtype (klynge nærmest y-aksen) portene. Kontroller at klynger er distinkte og lett identifiseres i en vellykket analysen.
- Bruk portinnstillingene for den positive kontrollen til alle eksempler ved å høyreklikke på den positive kontroll prøven og klikke på alternativet for å bruke alle innstillingene på utvalgte prøver.
- Under den grafiske visningen klikker du flere eksempler -fanen for å vise plott for alle valgte eksempler. Eksporter bildet som en. TIF-fil.
- Under kategorien arbeidsområde øverst til venstre på skjermen velger du Eksporter analyse (CSV) og lagrer den analyserte datafilen som en CSV-fil.
- Åpne CSV-filen i regnearkprogramvaren for å vise negative, wildtype og mutant dråpe teller for hver prøve. Beregn MAF ved å dele Poisson-korrigerte mutant dråpe telling med summen av Poisson-korrigerte mutant pluss wildtype dråpe teller for hver prøve.
Merk: Bruk det korrigerte Poisson-antallet fordi Poisson-statistikker utgjør det faktum at positive dråper kan inneholde mer enn én enkelt kopi av mål-DNA, og dermed summere de positive dråpene kan ikke gi en nøyaktig telling16.
Representative Results
Figur 1 viser representative resultater for vellykket påvisning av H3F3A p. K27M mutasjon i preamplified plasma (øverst til venstre panel) og CSF (øverst til høyre panel) cfDNA fra to barn med dmg. cfDNA-prøver ble analysert i replikere, men bare én representativ graf vises for hver prøve type. DPCR-tomter viser vellykket dråpe generering, med 7-9 millioner dråper per PCR-brønn (hvorav de fleste er negative dråper som ikke inneholder mål-DNA). Et minimum av 7 000 000 dråper per PCR indikerer vel en vellykket dropletization, mens færre enn 7 000 000 indikerer svikt i analysen, i så fall brukeren ikke skal fortsette med dataanalyse. Figur 1 viser et klart skille mellom mutant og wildtype klynger langs henholdsvis x-og y-aksene. Robuste wildtype klynger tyder på at cfDNA-ekstraksjon var vellykket fordi mal-DNA er til stede. Mutant klynger viser en MAF på 1,60% og 39,92% for plasma og CSF prøver, henholdsvis demonstrere positiv påvisning av mutasjonen. For disse pasientene, dPCR resultatene er i samsvar med tumor mutasjon status, som bekreftes av genomisk analyse av biopsi tumor vev8. Den negative kontrollen (nederste venstre panel) viser 0 mutant og 0 wildtype dråper, noe som indikerer at det ikke var noen forurensning av PCR reaksjonsblandingen. Den positive kontroll tumor vev gDNA (nederst til høyre panel) viser mutasjonen blir oppdaget ved forventet allel frekvens for den spesielle tumor prøven valgt.
I figur 2, representative resultater er vist for mislykket påvisning av mutasjon av interesse, H3F3A p. K27M, i plasma cfDNA fra et barn med dmg. Mutasjon status ble bekreftet ved genomisk analyse av tumor vev8. Representative resultater fra to replikere PCR-brønner vises (øverste paneler). Det totale antall dråper, inkludert negative dråper, er mellom 7-9 millioner per PCR-brønn, noe som indikerer vellykket dropletization. De wildtype klynger, plottet langs y-aksen, viser ca 7-8000 wildtype dråper per PCR godt for plasma cfDNA, indikerer vellykket cfDNA ekstraksjon (som det er målet wildtype DNA i utvalget). Det oppdages imidlertid 0 mutant dråper i plasma prøven. Nederste venstre panel viser negativ kontroll (MB H2O) uten wildtype eller mutant dråper; og den nederste høyre panel viser positiv kontroll preamplified tumor vev gDNA (0,025 ng) med positiv mutasjon deteksjon. Som vist i dette tallet, kan fraværet av mutasjon deteksjon i plasma ikke nødvendigvis bety at pasienten er wildtype for mutasjon av interesse, som falske negativer forekommer8. I noen tilfeller, når mutasjonen er savnet i plasma samlet på forhånd biopsi, det er oppdaget i plasma innhentet fra samme pasient på et senere tidspunkt8.
Figur 1 : Vellykket påvisning av H3F3A p. K27M mutasjon i preamplified plasma og CSF cfDNA fra barn med midtlinjen gliomas. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Falske negative resultater Hentet fra analyse av en preamplified plasma cfDNA prøve fra en pasient kjent for å havne på mutasjon av interesse, H3F3A p. K27M, i svulsten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her har vi presentert vår metode for å oppdage og kvantifisere den allel hyppigheten av tumor mutasjoner i cfDNA fra pasientens flytende biopsi. Vi understreker kritiske skritt for suksessen til denne metoden, inkludert pre-analytisk prøve behandling, cfDNA ekstraksjon, PCR-analysen design, og dataanalyse. For å begrense prøvevolumet som brukes, cfDNA er Hentet fra 1 mL plasma, men bare 500 μL av CSF. Når du trekker ut fra CSF, brukes protokollen for ekstraksjon fra 1 mL urin (følge håndbok12i cfDNA Extraction Kit, i henhold til produsentens anbefaling. Forskjellen i sample volum kreves mellom plasma og CSF skyldes lavere nivåer av tumor spesifikke cfDNA i plasma sammenlignet med CSF av pasienter med hjernesvulster, nødvendiggjør større utvalg volumer for mutasjon deteksjon8. Hvis prøven er tilgjengelig, kan mer enn 1 mL plasma trekkes ut fra for å produsere høyere DNA-utbytte. Men i tilfelle av pediatriske pasienter, er det viktig å minimere mengden av blod som brukes når det er mulig, som selv en enkel prosedyre som blodprøve er fatiguing til pediatriske pasienter med kreft gjennomgår strålebehandling. Trekke fra 1 mL alikvoter av plasma også muliggjør replikere utdrag, slik at analysen kan gjentas (f. eks, i tilfeller av svikt i DNA-ekstraksjon eller prøve forurensning).
I et forsøk på å redusere enhver prøve bruk som ikke er strengt nødvendig, er cfDNA vanligvis ikke kvantifisert. Vi har imidlertid funnet en rekke cfDNA konsentrasjoner mellom 0,2-2 ng/μL og 0,6-13 ng/μL i plasma og CSF, henholdsvis. Gitt den lave mengden av cfDNA, og det faktum at tumor spesifikke mutant alleler er tilstede på en lav frekvens, en pre-forsterkning trinn med samme sett av primere brukes til dPCR er nødvendig for å signifikant øke mengden av mål DNA i utvalget, hjelpe i mutasjon deteksjon8. Fortynning av pre-forsterket produkt i DNA suspensjon buffer gir tilstrekkelig volum for tekniske replikerer, som hjelpemidler i å skille sanne positive. Fordi antall mutant dråper kan være lav (for eksempel mellom 0-2 mutant dråper i en plasma prøve), er inkludering av tekniske replikerer nøkkelen for å løse mutasjon status. Selv om en PCR-brønn kan gi 0 mutant dråper, kan de to andre gi 1-2 for en enkelt Plasma prøve analysert i tre eksemplarer; Dermed, inkludering av replikerer gir større nøyaktighet ved fastsettelse mutasjon status. MAF beregnes deretter som gjennomsnittet av replikering verdiene.
Multiplekset pre-forsterkning (preamplifying wildtype og mutant alleler av to mutasjoner av interesse) øker nytten av en enkelt prøve, som det samme utgangsmaterialet kan brukes til å teste for to mutasjoner. Viktigere, en multiplex preamplification produkt kan analyseres i singleplex under dPCR for større enkelhet, som beskrevet her. Både preamplification PCR og dPCR kan imidlertid være multiplekset. Når multipleksing, må forholdene optimaliseres for begge settene med primere og sonder: primer annealing temperaturer må være lik kjøre sammen i PCR forsterkning, og sonder bør utformes for å generere distinkte klynger (basert på fluorescerende signal og og intensitet). Når du validerer et nytt sett med primere og sonder, kjøre en annealing temperatur gradient å bestemme optimal annealing temperatur basert på området foreslått av produsenten. Før testing sonder på pasienten cfDNA prøver, validere dem ved hjelp av syntetiske DNA konstruerer og/eller tumor vev gDNA av ulike innganger (dvs. opp til 10 ng).
For påvisning av mutant alleler med større spesifisitet og reduserte uoverensstemmelser i hybridisering av sonden til målet DNA, er låst nukleinsyre syre (LNA) sonder brukes. LNA er en nukleinsyre syre analog med en metylen bro forbinder 2 '-oksygen og 4 '-karbon av ribose ringen9. Den metylen broen låser nukleinsyre syre i en stiv bicyklisk konformasjon som begrenser fleksibiliteten, øker termisk dupleks stabilitet, og forbedrer spesifisitet av sonde hybridisering å målrette DNA10,18, 19. Hvis det foreligger en enkelt grunn konflikt mellom LNA-sonde og mal-DNA, vil dupleks dannelse mellom sonde og målet destabilisere. Som sådan, LNA sonder forbedre spesifisitet av sonde bindende og resultere i et høyere signal-til-støy-forhold11. Analyse av plasma og CSF fra ikke-CNS-syke pediatriske pasienter har etablert spesifisitet av våre analysen med LNA sonder målretting H3F3A p. K27M, å fastslå at en allel frekvens lik eller mindre enn 0,001% regnes som en falsk positiv 8. for ytterligere hensyn for å optimalisere utformingen av sonder og primere, inkludert GC-innhold, amplicon størrelse, sonde reporter fargestoffer og quenchers, se dPCR produsentens retningslinjer14,17. Selv om metoden vår er optimalisert for bruk med RainDance-systemet, kan protokollen tilpasses for bruk med andre dPCR-plattformer.
Metoden som presenteres her trekker styrke fra den høye følsomheten og målet berikelse oppnås ved dPCR, som fortsatt er den plattform av valget for å oppdage sjeldne tumor mutasjoner i cfDNA. Selv om kraftig, dPCR er begrenset i antall mutasjoner som kan testes for i en enkelt analysen. Et alternativ til dPCR er neste generasjons sekvensering (NGS), som kan oppdage flere mutasjoner over mange gener, øke nytten av en enkelt prøve. NGS kan oppdage mutasjoner i CSF og plasma av pasienter med hjernestammen gliomas20, men er for tiden mindre følsomme enn dPCR på å oppdage tumor mutasjoner i cfDNA, med deteksjons grenser på 0,1-10% MAF sammenlignet med 0,001% i PCR-baserte tilnærminger21 . dPCR også oppnår raskere behandlingstid enn NGS, slik at rask påvisning av mutasjoner av interesse. PCR-tilnærmingen gjelder på tvers av krefttyper og kan utvides til å påvise hotspot mutasjoner og denaturert cfDNA22.
Den flytende biopsi er faktisk i sin spede begynnelse, og vil kreve videre utvikling for skreddersøm til bestemte sykdommer. Tumor overvåking i sammenheng med tumor evolusjon vil bli den neste utfordringen, der en plattform i stand til å oppdage nye mutasjoner med høy følsomhet ville være nødvendig. I tillegg vil plattformer som er i stand til å påvise en rekke biomolekyler (peptider, cytokiner, RNA) være svært gunstige for å vurdere tumor respons på behandling, samt fremme personlig tilpassede kliniske intervensjoner.
Disclosures
Metoden som er beskrevet i dette manuskriptet er inkludert i en internasjonal patentsøknad "metoder for å oppdage kreft biomarkører" av Javad Nazarian & Eshini Panditharatna.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne erkjenne gavmildhet av alle pasienter og deres familier. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Smashing valnøtter Foundation (Middleburg, VA), V Foundation (Atlanta, GA), The Gabriella Miller Kids First data Resource Center, klinisk og translational Science Institute at Children ' s National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), den Childhood Brain tumor Foundation (Germantown, MD), barnas Brain Tumor tissue Consortium (Philadelphia, PA), og Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
