Detektion och övervakning av tumörassocierade cirkulerande DNA i patientens Biofluider

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att detektera tumör somatiska mutationer i cirkulerande DNA som finns i patientens biologiska vätskor (biofluider). Vår dropp Digital polymeras kedjereaktion (dpcr)-baserad metod möjliggör kvantifiering av tumör mutation alleliska frekvens (MAF), underlätta ett minimalt invasiva komplement till diagnos och tidsmässig övervakning av tumörrespons.

Abstract

Komplikationer i samband med upfront och upprepa kirurgisk vävnad provtagning presentera behovet av minimalt invasiva plattformar som kan molekylär sub-klassificering och tidsmässig övervakning av tumörsvar på behandling. Här beskriver vi vår dPCR-baserade metod för detektion av tumör somatiska mutationer i cellfritt DNA (cfDNA), lätt tillgängligt i patientens biofluider. Även begränsad i antalet mutationer som kan testas för i varje analys, denna metod ger en hög grad av känslighet och specificitet. Övervakning av Mutations överflöd, som beräknas av MAF, möjliggör utvärdering av tumörsvar på behandling, vilket ger en välbehövlig komplement till radiografisk avbildning.

Introduction

På grund av begränsningar i tillgången på tumör vävnad för molekylära analyser, det finns ett behov av att utveckla mycket känsliga metoder som kan upptäcka tumör somatiska mutationer i patientens biofluider, inklusive plasma, serum och cerebrospinalvätska (CSF) . Till exempel, barn diffus mittlinjen gliom (dmgs) presentera en utmaning på grund av deras neuroanatomiska läge. Under det senaste decenniet, molekylär profilering av DMG vävnadsprov har avslöjat driver mutationer i denna tumörtyp¹ och har avslöjat rumsliga och temporala heterogenitet av mutationer, vilket gör biopsi som krävs för att karakterisera en patient inom en sjukdom undergruppen och främja molecularly-riktade terapier². Som sådan, kliniska prövningar förespråkar för att integrera kirurgiska biopsier för tumör molekylär profilering vid initial diagnos^3,4,5,6. Under behandlingen, övervakning av terapeutiska svar i DMGs är begränsad till MRI, som saknar känslighet för att upptäcka små förändringar eller tumör genomisk evolution. MRI är också benägna att upptäcka pseudoprogression, övergående inflammation på platsen för tumören som härmar sann progression på avbildning och kan vilseleda tolkning av tumörsvar⁷. Sålunda, DMGs representera en tumörtyp med ett stort behov av ett alternativ, minimalt invasiva sätt att upptäcka tumör mutationer och övervakning kliniskt svar. För att tillgodose dessa behov utvecklade och optimerade vi ett protokoll för att upptäcka, och kvantifiera den alleliska frekvensen av, tumör mutationer i cfdna från plasma, serum och CSF av barn med mittlinjen gliom⁸. Med tanke på att barndomen DMGs ofta (> 80%) Harbor en somatisk lysin till metionin mutation vid position 27 i Histon variant h 3.1 (h 3.1 k27m, 20% av fallen) eller h 3.3 (h 3.3 k27m, 60% av fallen)¹, dessa och andra mutationer karakteristiska för dmgs (dvs ACVR1, PIK3R1) var riktade till den muterade allelekvantifieringen med cfDNA⁸. Denna analys kan skräddarsys för att upptäcka hotspot mutationer i andra tumörtyper med sekvens-specifika primers och sonder. Mångsidigheten hos denna metod gör den tillämplig på en mängd olika cancerformer som skulle gynnas av integrationen av cfDNA-baserade diagnostiska verktyg och terapeutisk övervakning.

För att på ett känsligt sätt upptäcka låga alleliska frekvens mutationer i cfdna använder vi en dropp Digital PCR (dpcr)-baserad metod. I denna metod är PCR-reaktionen blandningen uppdelad i ett teoretiskt maximum av 10 000 000 droppar med hjälp av dPCR-plattformen (t. ex. RainDance), med 7-9 miljoner droppar per PCR väl typiskt sett experimentellt. På grund av den höga graden av prov partitionering, högst en till två DNA-molekyler kan förekomma i varje droppe. PCR amplifiering och sekvens-specifik fluorescerande sond hybridisering kan förekomma i varje droppe, så att miljontals reaktioner äger rum. Detta maximerar känsligheten och möjliggör detektering av sällsynta Mutant alleler, som annars kan gå oupptäckt mot en bakgrund av vildtyp DNA. Utnyttjandet av låsta nukleinsyra (lna) sonder förstärker specificiteten av analysen genom att begränsa obalans hybridisering och stödja korrekt mutation upptäckt^9,10,11. Här beskriver vi våra metoder för provbearbetning, cfDNA-extraktion, preamplifiering av mål-alleler, dPCR och dataanalys.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella Granskningsnämnden vid University of California San Francisco (San Francisco, CA; IRB #14-13895) och barnens nationella hälsovårds system (Washington, D.C.; IRB #1339). Prover samlades in och studerades efter att ha fått informerat samtycke från patienten eller patientens vårdnadshavare.

1. samtyckande patienter enligt IRB-protokollet för insamling och lagring av biologiska prover

1. Samla patientprover efter skriftligt informerat samtycke erhålls från varje patient, eller patientens vårdnadshavare, för deltagande i en klinisk prövning eller för biorepository som godkänts av respektive institutionell prövnings nämnd.
   1. Patienter som ingår i denna studie diagnostiserades med en hjärntumör Radiografiskt. Inga uteslutningskriterier användes. Prover samlades in och studerades efter att ha fått informerat samtycke från patienten eller patientens vårdnadshavare.

2. blod uppsamling och separation av plasma eller serum

1. Samla blodprovet med hjälp av en 10,0 mL-dragning i blod provs rören. Om insamling av blod för plasma, Använd K₂-eller k₃-EDTA-rör, heparin eller cfdna bloduppsamlingsrör. Om du samlar blod för serum, Använd gel-barriär rör som innehåller Clot aktivator och gel för att separera serum.
   Anmärkning: Medan 10 mL rekommenderas för att möjliggöra replikat experiment räcker det med minst 3 mL.
2. Vänd samlingsröret försiktigt 10 gånger för att blanda blodprovet med uppsamlingsröret reagenser.
3. Lämna blodprov från vilka serumet kommer att samlas i rumstemperatur i 30 min för att låta blodet koagulera. Om du bearbetar blod för att få plasma, Fortsätt omedelbart till steg 2,4.
   Anmärkning: Prover som bearbetas för plasma får förvaras på is i högst 2 timmar före centrifugering. En snabb övergång från blod dragningen till bearbetningen minimerar dock cfDNA-nedbrytning.
4. Centrifugera bloduppsamlingsrör på 2 000 x g i 15 minuter i en centrifug inställd på 4 ° c för att separera plasma eller serum från vita och röda blodkroppar.
5. Noga med att inte störa den vita blodkroppar (som bildar en tunn linje mellan den övre plasma/serum lagret och nedre lagret av förpackade röda blodkroppar), Pipettera det översta lagret av plasma/serum (som kan vara klar, gul eller rosa färg) lika i 1 mL alikvoter till sterila skruvlock kryovials av polypropen.
6. Anteckna ämnes identifikationsnumret, provtypen (plasma eller serum) och insamlings datumet på kryovialens etikett.
7. Förvara cryovials i-80 ° c frys fram till användning. Om en frys på 80 ° c inte finns tillgänglig, förvara proverna vid-20 ° c i upp till en vecka.

3. insamling och bearbetning av CSF

1. Samla CSF från en shunt, lumbalpunktion, eller kirurgi.
   Anmärkning: Sådana förfaranden bör endast utföras om kliniker bedöms som nödvändiga. Extra prov utöver det som är nödvändigt för klinisk användning kan användas för forskningsändamål.
2. Mät volymen av CSF samlas in och anteckna dess färg (blodiga, gul, klar).
3. Centrifugera samlingsröret vid 10 000 x g i 10 min vid 4 ° c för att pelleten av det cellulära skräpet.
4. Överför CSF supernatanten lika i 500 μL alikvoter i polypropen skruvlock kryovials.
5. Anteckna ämnes identifikationsnumret, provtypen och datum för prov insamlingen på kryovialens etikett. Förvara vid-80 ° c till användning.

4. extraktion av cfDNA från flytande prover

1. Utför cfDNA Extraction Protocol enligt instruktionerna i cfDNA Extraction Kit handbok¹².
   1. Rengör bänkutrymme och utrustning med 10% blekmedel och 70% etanol.
      Anmärkning: Användning av en PCR-huva, regelbunden byte av handskar och frekvent dekontaminering av bänk utrymmet och utrustning med 10% blekmedel och 70% etanol under alla steg i protokollet är viktigt för att undvika prov förorening.
   2. Bered portioner av reagenser, t. ex., tvättbuffertar, från extraktionssatsen för att undvika korskontaminering.
2. Tina patientprover på is innan extraktionen påbörjas. För plasma/serum, Tina 1 ml alikvot av provet. För CSF, Tina 500 μL alikvot av provet.
   Anmärkning: Lys steg (4.5-4.8) av extraktionprotokollet skiljer sig mellan plasma/serum och CSF, men från steg 4,9 och framåt är protokollet identiskt för båda typerna av biofluider.
3. Ställ ett värmeblock till 60 ° c för användning under Lys-steget (4,6).
4. Bered lyseringsbufferten och bär-RNA-blandningen i ett 15 mL-rör genom att tillsätta 5,6 μL bärare RNA och 0,9 mL lyseringsbuffert per prov¹².
5. För plasma/serum, tillsätt 100 μl proteinas K, 1 ml prov, och 0,8 ml lyseringsbuffert/bärare RNA blandning beredd i steg 4,4 till en märkt 2,0 ml rör. Blanda med Pulse vortexa för 30 s vid hög hastighet¹².
   1. För CSF, tillsätt 125 μl proteinas K, 500 μl av provet, 1 ml lyseringsbuffert/bärar-RNA-blandning, och 250 μl vävnads lyseringsbuffert till ett 2,0 ml-rör. Ta hela volymen upp till 2 mL genom att tillsätta 125 μL 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Blanda med Pulse vortexa för 30 s vid hög hastighet¹².
6. Inkubera prover i 30 min vid 60 ° c i värmeblocket¹².
7. Ta bort prover från värmeblocket och Sänk temperaturen till 56 ° c. Returnera proverna till bänken och överför lysatet till nya märkta 15 mL-rör.
8. För plasma/serum, tillsätt 1,8 ml nukleinsyra bindning buffrand mix för 30 s av Pulse vortexa¹².
   1. För CSF, tillsätt 3,6 ml av nukleinsyra bindning buffert och blanda för 30 s av Pulse vortexa¹².
9. Inkubera prover för 5 min på is¹².
10. För in kolonnen i vakuum kopplingen. Öppna kolonnen och sätt i en 20 mL rör förlängare i kolumn¹².
11. Pipettera innehållet i 15 mL röret direkt i botten av röret förlängaren, undvika att lämna droppar på väggarna i röret förlängaren.
12. Med brytaren på vakuum kontakten stängd, slå på vakuumpumpen. När trycket har byggts till 900 mbar, öppna ventilen av vakuum kontakten. Exemplet kommer nu att flöda genom kolumnen.
13. När alla lysat har tömts från kolonnen, stänga av pumpen och öppna luckor till vakuum kontakten, lindra tryckgradienten. När trycket når 0 mbar, Stäng ventilen av vakuum kontakten och Trapdoor.
14. Ta bort 20 mL-rörförlängaren, var noga med att inte passera Extender-enheten i en kolumn över en angränsande kolumn, eftersom detta kan korsförorena prover. Kassera rör förlängaren.
15. Tillsätt 600 μL första tvättbuffert i kolumn¹².
16. Lämna locken på rören öppna och slå på vakuumpumpen. Låt tryckmätaren nå 900 mbar, vrid sedan reglaget på vakuum kopplingen till öppet läge för att dra tvättbufferten genom kolonnen.
17. Stäng av vakuumpumpen, öppna luckor för att frigöra tryck, och lindra trycket till 0 mbar. Vrid ventilen på vakuum kontakten till stängt läge.
18. Tillsätt 750 μL andra tvättbuffert i kolonnen och upprepa steg 4.16-4.17¹².
19. Tillsätt 750 μL etanol av MB-kvalitet till kolonnen och upprepa steg 4.16-4.17¹².
20. Stäng locket på kolonnen och placera kolonnen inuti ett nytt 2,0 mL uppsamlings rör. Kassera vakuum kopplingen¹².
21. Centrifugera röret med kolonnen vid 20 000 x g i 3 min vid rumstemperatur¹².
22. Placera kolonnen i ett nytt samlingsrör och öppna locket på röret. Placera en laboratorie vävnad över toppen och inkubera vid 56 ° c i 10 min¹².
23. Placera kolonnen i ett rent 1,5 mL PCR-Clean-rör och Pipettera 100 μL elueringbuffert (eller molekylärbiologi klass H₂o (MB h₂o)) direkt i mitten av kolonnen. Vidrör inte kolonnen med pipettspetsen. Stäng locket och låt verka i rumstemperatur i 3 min.
24. Centrifugera vid 20 000 x g vid rumstemperatur under 1 min till eluera cfdna¹².
25. Pipettera tillbaka eluatet i kolonnen och inkubera i rumstemperatur i 3 minuter.
26. Upprepa centrifugering med full hastighet i 1 min för att eluera cfDNA en andra gång för att öka avkastningen (enligt tillverkarens rekommendation).
27. Förvara cfDNA i märkta DNase/RNase fria PCR-Clean-rör vid 4 ° c eller Fortsätt direkt till steg 5.

5. vakuum koncentration av cfDNA

1. Sätt in och balansera rören som innehåller eluerat cfDNA till hållarna på vakuum koncentratorn. Öppna locken på rören. Ställ in temperaturen på vakuum koncentratorn på 23 ° c.
2. Slå på vakuum koncentratorn och slå sedan på ång fällan. Centrifugera prover för 40 min eller tills en slutlig volym på 10,5-11 μL uppnås.
   1. Om volymen är under 10,5 μL, tillsätt DNA suspension buffert eller MB H₂O för att nå en slutlig volym av 10,5 μl.
3. Pipettera hela volymen längs rörens väggar för att avlägsna rester av DNA-fragment.
4. Centrifugera proverna på en bordcentrifug för att samla upp droppar på rörväggarna.
5. Gå direkt till preamplifieringssteget (steg 8) eller förvara proverna vid 4 ° c.
   1. Linda lock av rör i en laboratorie film för att undvika kontaminering om de lagras för senare användning.

6. utformning och beredning av primers och sonder

1. Design framåt och omvänd primers, och vildtyp och Mutant lna sonder, för mål (er) av intresse. Kommersiellt beställa frystorkade primers och sonder (se tabell över material).
   Obs: sekvenser för primers och sonder inriktning H3F3A p. K27M och andra mål mutationer för pediatriska mittlinjen gliom finns i kompletterande tabell 3 i panditharatna et al., 2018⁸.
2. Innan du öppnar den frystorkade primers och sonder, kort Centrifugera rören. Tillsätt lämplig volym av DNA suspension buffert eller MB H₂O, som noteras på produktens Specifikationsblad, att Omsuspendera den frystorkade primers och sonder till en koncentration av 100 μm.
3. Försiktigt Vortex, Pipettera upp och ner flera gånger för att blanda och kortfattat Centrifugera primers och sonder med hjälp av en bordsskiva centrifug.
4. Bered 10 ìm alikvoter av primrar och sonder genom att tillsätta 10 μL 100 μM i lager till 90 μL DNA-upphängningsbuffert eller MB H₂O.
5. Bered 1 μM alikvoter av framåt och omvänd primers (som skall användas för preamplifiering), genom att tillsätta 10 μL av 10 μM primer till 90 μL DNA suspension buffert eller MB H₂O.
6. Förvara primers och sonder vid 4 ° c i lufttäta mörka behållare. Wrap laboratorie film runt locken för att undvika kontaminering, och täck sonder i aluminiumfolie för att undvika exponering för ljus. Förvara sonderna vid-20 ° c för långtidsförvaring om de inte används regelbundet.

7. Val av positiva kontroller

1. Välj tumör vävnad genomisk DNA (gDNA) prov (s) med känd DNA-koncentration, som hamnar den mutation av intresse vid en känd alleliska frekvens som ska användas som en positiv kontroll.
   1. Använd 0,025 ng av positiv kontroll tumör vävnad DNA i ger steg (steg 8).
      Anmärkning: denna DNA-ingång ger en robust positiv signal på dPCR (bestäms genom att utföra seriella utspädningar av tumör vävnad gDNA härda H3F3A p. K27M mutation⁸) och samtidigt minimera mängden prov som krävs.

8. preamplifiering av mål-alleler

Anmärkning: Preamplification protokollet är enligt Jackson et al., 2016¹³.

1. Rengör bänkutrymme och utrustning med 10% blekmedel och 70% etanol.
2. Få 1 μm framåt och bakåt primers, cfdna prover, gDNA positiva kontroller, och DNA polymeras Master Mix, och set på is.
3. Beräkna volymen av reagenser som behövs för att preamplifiera önskat antal cfDNA prover och positiv kontroll, för antingen singleplex eller multiplex preamplifiering enligt följande:
   1. För enplex preamplifiering (för att preamplify vildtyp och Mutant alleler för en enda mutation av intresse), Förbered PCR-reaktion blandning genom att tillsätta 17,5 μl av DNA-polymeras Master Mix, och 3,5 μl av framåt och omvänd primers (100 nm) per prov¹³.
   2. För multiplex preamplifiering (för att förförstärka två uppsättningar av vildtyp och Mutant alleler för två mutationer av intresse), Förbered PCR-reaktionen blandning genom att tillsätta 17,5 μl av DNA-polymeras Master Mix och 1,75 μl av varje uppsättning av framåt och omvänd primers (50 nm) per prov ¹³.
      Anmärkning: Förbered tillräckligt med PCR-reaktionsblandning för antalet prover plus 10% extra för att ta hänsyn till eventuella pipettering fel.
4. Fördela 24,5 μL PCR-reaktionsblandning i varje brunn i ett 8-och PCR-bandrör¹³.
5. Fördela 10,5 μL DNA-prov i lämplig brunn för att få den totala reaktions volymen till 35 μL¹³. Pipettera försiktigt hela volymen upp och ner 10 gånger för att blanda.
6. Utför PCR-amplifiering vid 98 ° c i 3 minuter. 9 cykler av 98 ° c för 10 s, glödgnings temperatur i 3 min, 72 ° c för 30 s; och en förlängning vid 72 ° c för 2 min¹³.
7. Överför den fullständiga volymen preamplifierad produkt till märkta DNase/RNase-fria PCR-rena rör och späd i 140 μL TE DNA suspension buffert (pH 8,0)¹³.
8. Linda in locken på rören i laboratorie film. Förvara den preamplifierade produkten vid 4 ° c. För långtidsförvaring, förvara vid-20 ° c.

9. detektion och kvantifiering av Måldna med dPCR

1. Rengör bänkutrymme och utrustning med 10% blekmedel och 70% etanol.
2. Ställ 10 μM primers och sonder, genotypning Master Mix, och DNA-prover på is. Förvara droppets stabiliserande olja vid rumstemperatur.
3. Skaka försiktigt och kort Centrifugera alla reagenser utom dropp stabiliserande olja.
4. Se till att den komprimerade kvävgascylindern som är fastsatt på dropp Generator instrumentet och kvantifieringsinstrumentet (tabell över material) är satt till 90 psi.
5. Slå på dropp Generator instrumentet och datorn med instrumentets programvara. Starta programvaran och klicka på Starta initialisera.
   1. Kör en högtrycksspolning på dropp Generator instrumentet om det inte har använts på en vecka eller mer.
6. Förbered dPCR-reaktionsblandningen för 8 brunnar i PCR-bandröret plus 10% extra, genom att tillsätta 220 μL genotypning Master Mix, 8,8 μL vardera av 10 μM vildtyp och mutantprober, 39,6 μL vardera av 10 μM framåt och bakåt primers, och 17,6 μL av DROPP stabiliserande olja^{14 .}
7. Blanda försiktigt dPCR-reaktionsblandningen genom att Pipettera hela volymen upp och ner 10-20 gånger. Blanda inte ihop eller Centrifugera efter att dropp stabiliserande olja har tillsatts i reaktionsblandningen.
8. Skaffa en PCR 8-brunn Strip Tube och fördela 38 μL av dPCR reaktionsblandningen direkt i botten av varje brunn¹⁴. Ta bort eventuella bubblor med en ren pipettspets.
   Anmärkning: PCR-bandrör som är förreglade eller förpackade tätt tillsammans kan resultera i statiska elektriska laddningar som orsakar koalescens och bullrig signal vid analys av dPCR-data. För att undvika detta, alikvot Strip rör i separata biologiskt farliga påsar, undvika överpackning säckarna, och hålla rören från att gnugga ihop.
9. Tillsätt 12 μL preamplifierade DNA-prov till lämpliga brunnar i PCR-bandröret. För den negativa kontrollen, tillsätt 12 μL MB H₂O.
   Anmärkning: Analysera cfDNA-prover i replikat brunnar. För CSF, analysera åtminstone i två exemplar, och för plasma/serum analysera varje prov i tre exemplar.
10. Pipettera försiktigt upp och ned hela volymen 10 gånger för att blanda reaktionsblandningen med DNA-provet.
11. Skaffa en ny dropp-genererande instrument krets och Pipettera hela volymen från brunnar 1-8 av PCR-bandröret till motsvarande kanaler A-H i kretsen. Undvik att vidröra botten av kanalerna med pipettspetsen.
12. Skaffa ett nytt rent PCR-bandrör och sätt in det i droplet-genereringsinstrumentet. Skanna eller ange manuellt det droplet-genererade instrumentets chip-ID i programvaran på instrument datorn. Ange namn för var och en av de 8 kanalerna. Klicka på Starta körningen för att börja dropletizing exempel.
13. När dropletization har slutförts, ta bort PCR-bandröret och tillämpa band röret mössor.
14. Överför band röret till en termisk apparat och balansera med ett annat band rör som innehåller 80 μl vatten per brunn.
15. Program mera termiska cyklings förhållanden¹⁴ som: 95 ° c i 10 min; 45 cykler av två temperaturer: 95 ° c för 30 s och glödgnings temperatur i 2 min; 98 ° c i 10 min; och håll vid 10 ° c.
    1. Ställ in ramphastigheten på 0,5 ° c/s och Ställ in provvolymen på 80 μL¹⁴.
16. När termisk cykling är klar, ta bort band röret och överför till kvantifieringsinstrumentet. Ta bort PCR-bandlock och Ersätt med hög hastighetstak.
17. Slå på kvantifieringsinstrumentet och den anslutna datorn med instrument programvaran. Starta instrument programvaran och klicka på Setup a Run.
18. Placera band röret i kvantifieringsinstrumentet.
19. Skaffa ett nytt chip för kvantitetsinstrument och skanna eller ange chip-ID manuellt i instrumentet. Sätt in chippet i maskinen.
20. Placera metallplåten ovanpå chippet och Stäng locket på instrumentet.
21. I datorprogramvaran anger du ett namn för dPCR-körningen och för var och en av de 8 kanalerna (A-H). Välj snabbläge (som måste användas med hög hastighet Caps) och klicka på Start för att påbörja kvantifieringen.
22. När kvantifieringen är slutförd, ta bort metall skölden (som ska sparas och återanvändas) och kassera PCR-bandröret och kretsen. På instrument datorn kommer Run-loggen att innehålla resultatfiler för varje körning. Använd. FCS-filerna för varje sampling för att analysera med analytikerprogrammet.

10. analys av data

1. Starta analytikerprogrammet och öppna. FCS-filerna för att analysera rå spektrala data. Välj intaktaunder analysvy. Under Exempelvyn klickar du på rutorna bredvid vart och ett av de 8 exemplen så att varje ruta är bockmarkering. Programvaran kommer att rita signaler för Mutant (FAM) och vildtyp (hex) alleler längs x-och y-axlarna, respektive.
2. Använd den beräknade mat ris funktionen för att ansöka om spektralkompensation på intakta droppar, enligt tillverkarens anvisningar¹⁵.
3. Justera axel inställningarna under Axelalternativ. Ställ in x-axeln på minst 0 och maximum 30 000 och y-axeln till minst-5 000 och högst 10 000. När dropp-kluster har identifierats justerar du axlarna för att minska det tomma utrymmet i diagrammet.
   Anmärkning: Positionen av mutant och vildtyp kluster kommer att bero på de sonder som används, fluorophore och deras koncentration.
4. Välj det prov som motsvarar den positiva kontrollen tumör vävnad gDNA att ställa in den negativa (klustret närmast ursprunget), Mutant (kluster närmast x-axeln), och vildtyp (kluster närmast y-axeln) grindar. Se till att klustren är distinkta och lätt identifieras i en lyckad analys.
5. Använd grind inställningarna för den positiva kontrollen på alla exempel genom att högerklicka på det positiva kontroll exemplet och klicka på alternativet för att tillämpa alla inställningar på valda exempel.
6. Under den grafiska vyn klickar du på fliken flera exempel för att visa diagram för alla valda exempel. Exportera bilden som en. TIF-fil.
7. Under fliken arbetsyta längst upp till vänster på skärmen väljer du Exportera analys (CSV) och sparar den analyserade datafilen som en CSV-fil.
8. Öppna CSV-filen i kalkylprogram om du vill visa negativa, jokertecken och muterade dropp-värden för varje exempel. Beräkna MAF genom att dividera det Poisson-korrigerade mutantdroplet-antalet med summan av de totala antalet av Poisson-korrigerad Mutant plus vildtyp-dropp för varje prov.
   Anmärkning: Använd Poisson-korrigerad räkning eftersom poissonstatistik står för det faktum att positiva droppar kan innehålla mer än en enda kopia av mål-DNA, och därmed summera de positiva dropparna kanske inte ger en exakt räkning¹⁶.

Representative Results

Figur 1 visar representativa resultat för lyckad detektion av H3F3A p. K27M mutation i förförstärkt plasma (övre vänstra panelen) och CSF (övre högra panelen) cfdna från två barn med dmg. cfDNA-prover analyserades i replikat men endast ett representativt diagram visas för varje prov typ. DPCR-diagram visar framgångsrik dropp produktion, med 7-9 miljoner droppar per PCR-brunn (varav de flesta är negativa droppar som inte innehåller måldna). Minst 7 000 000 droppar per PCR-brunn indikerar en lyckad dropletization, medan färre än 7 000 000 indikerar fel på analysen, i vilket fall användaren inte bör fortsätta med dataanalys. Figur 1 visar en tydlig separation mellan Mutant-och vildtyp-kluster längs x-respektive y-axlarna. Robusta vildtyp-kluster indikerar att cfdna-extrahering lyckades eftersom mallDNA finns. Mutant kluster visar en MAF på 1,60% och 39,92% för plasma och CSF prover, respektive, visar positiv detektion av mutationen. För dessa patienter, dPCR resultat är i enlighet med tumör mutation status, som bekräftas av genomisk analys av biopsi tumör vävnad⁸. Den negativa kontrollen (nedre vänstra panelen) visar 0 Mutant och 0 vildtyp droppar, vilket indikerar att det inte fanns någon förorening av PCR-reaktionsblandningen. Den positiva kontrollen tumör vävnad gDNA (nedre högra panelen) visar mutationen som upptäcks vid den förväntade alleliska frekvensen för den specifika tumörprovet valt.

I figur 2visas representativa resultat för misslyckad detektion av mutationen av intresse, H3F3A p. K27M, i plasma cfdna från ett barn med dmg. Mutationsstatus bekräftades genom genomisk analys av tumör vävnad⁸. Representativa resultat från två replikerade PCR-brunnar visas (övre paneler). Det totala antalet droppar, inklusive negativa droppar, är mellan 7-9 miljoner per PCR-brunn, vilket indikerar lyckad dropletization. De vildtyp-kluster som ritas längs y-axeln visar ungefär 7-8000 vildtyp-droppar per PCR-brunn för plasma-cfdna, vilket indikerar lyckad cfdna-extraktion (eftersom det finns mål-vildtyp-DNA i provet). Emellertid, 0 muterade droppar upptäcks i plasma provet. Den nedre vänstra panelen visar negativ kontroll (MB H₂O) utan vildtyp eller muterade droppar; och den nedre högra panelen visar den positiva kontrollen förförstärkt tumör vävnad gDNA (0,025 ng) med positiv mutation upptäckt. Som framgår av denna siffra, kan avsaknaden av mutation detektion i plasma inte nödvändigtvis betyda att patienten är vildtyp för mutationen av intresse, som falska negativen inträffar⁸. I vissa fall, när mutationen missas i plasman som samlats in vid initial biopsi, det upptäcks i plasma som erhållits från samma patient vid en senare tidpunkt punkt⁸.

Figur 1 : Lyckad detektering av H3F3A p. K27M mutation i förförstärkt plasma och CSF cfdna från barn med mittlinjen gliomas. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Falskt negativa resultat från analys av ett preamplifierat plasma-cfDNA-prov från en patient som är känd för att hysa mutationen av intresse, H3F3A p. K27M, i tumören. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här har vi presenterat vår metod för att detektera och kvantifiera den alleliska frekvensen av tumör mutationer i cfDNA från patientens vätskebiopsi. Vi betonar kritiska steg för framgången för denna metod, inklusive pre-analytisk provbearbetning, cfDNA utvinning, PCR-analys design och dataanalys. För att begränsa provvolymen som används extraheras cfDNA från 1 mL plasma, men endast 500 μL CSF. Vid extraktion från CSF används protokollet för extraktion från 1 mL urin (enligt handboken för cfDNA Extraction Kit¹²), enligt tillverkarens rekommendation. Skillnaden i provvolym som krävs mellan plasma och CSF beror på lägre nivåer av tumörspecifika cfDNA i plasma jämfört med CSF av patienter med hjärntumörer, kräver större provvolymer för mutation Detection⁸. Om provet finns tillgängligt kan mer än 1 mL plasma extraheras från för att ge högre DNA-avkastning. Men, när det gäller pediatriska patienter, det är viktigt att minimera mängden blod som används när det är möjligt, som även ett enkelt förfarande såsom blod dragning är trött på pediatriska patienter med cancer som genomgår strålbehandling. Extraktion från 1 mL-alikvoter av plasma möjliggör även replikeringar, så att analysen kan upprepas (t. ex. vid fel i DNA-extraktion eller prov förorening).

I ett försök att minska alla provanvändning som inte är strikt nödvändigt, är cfDNA vanligtvis inte kvantifieras. Emellertid, vi har funnit en rad cfDNA koncentrationer mellan 0,2-2 ng/μL och 0,6-13 ng/μL i plasma och CSF, respektive. Med tanke på den låga mängden cfDNA, och det faktum att tumörspecifika muterade alleler är närvarande vid en låg frekvens, är ett för förstärknings steg med samma uppsättning primrar som används för dPCR nödvändigt för att avsevärt öka mängden måldna i provet, medhjälp i mutation detektion⁸. Spädning av pre-Amplified produkten i DNA suspension buffert ger tillräcklig volym för tekniska replikat, som hjälper till att skilja sanna positiva. Eftersom antalet muterade droppar kan vara lågt (till exempel mellan 0-2 Mutant droppar i ett plasmaprov), är införandet av tekniska replikat nyckeln för att lösa mutationsstatus. Medan en PCR-brunn kan ge 0 muterade droppar, kan de andra två ge 1-2 för ett enda plasmaprov som analyseras i tre exemplar; Sålunda, införandet av replikat möjliggör större noggrannhet vid bestämning av mutationsstatus. MAF beräknas sedan som medelvärdet av de replikerade värdena.

Multiplexed pre-amplifiering (preamplifying vildtyp och Mutant alleler av två mutationer av intresse) ökar nyttan av ett enda prov, som samma utgångsmaterial kan användas för att testa för två mutationer. Viktigt, en multiplex ger produkt kan analyseras i singleplex under dpcr för större enkelhet, som beskrivs här. Både ger PCR och dpcr kan dock multiplexeras. Vid multiplexering måste villkoren optimeras för båda uppsättningarna primrar och sonder: primerglödgningstemperatur måste likna vid att köras tillsammans i PCR-amplifiering, och sonderna bör utformas för att generera distinkta kluster (baserat på fluorescerande signaler och intensitet). Vid validering av en ny uppsättning primers och sonder, kör en glödgning temperaturgradient för att bestämma optimal glödgning temperatur baserat på det intervall som föreslagits av tillverkaren. Innan tester sonder på patienten cfDNA prover, validera dem med hjälp av syntetiska DNA-konstruktioner och/eller tumör vävnad gDNA av olika ingångar (dvs., upp till 10 ng).

För detektion av muterade alleler med större specificitet och minskad missmatchningar i hybridisering av sonden till mål-DNA, låst nukleinsyra (LNA) sonder används. Lna är en nukleinsyra analog med en metylenblått bro som förbinder 2 '-syre och 4 '-Carbon av ribose ring⁹. Den metylenblått Bridge låser nukleinsyran i en styv bicykliska konformation som begränsar flexibiliteten, ökar termisk duplex stabilitet, och förbättrar specificiteten hos sond hybridisering till mål-DNA^{10,18, 19}. om en enda bas obalans finns mellan lna sond och mall DNA, duplex formation mellan sond och Target kommer att destabilisera. Som sådan, LNA sonder förbättra specificiteten av sond bindning och resultera i en högre signal-till-brus-förhållande¹¹. Analys av plasma och CSF från icke-CNS-diseased pediatriska patienter har etablerat specificiteten av vår analys med lna sonder inriktning H3F3A p. K27M, att fastställa att en alleliska frekvens av lika med eller mindre än 0,001% anses vara en falsk positiv ⁸. för ytterligare överväganden för att optimera utformningen av sonder och primers, inklusive GC innehåll, amplikon storlek, PROBE reporter färgämnen, och quenchers, hänvisa till dpcr tillverkarens riktlinjer^14,17. Även om vår metod är optimerad för användning med RainDance-systemet, kan protokollet anpassas för användning med andra dPCR-plattformar.

Den metod som presenteras här drar styrka från hög känslighet och mål berikning uppnås genom dPCR, som förblir den plattform för val för att upptäcka sällsynta tumör mutationer i cfDNA. Även kraftfull, dPCR är begränsad i antalet mutationer som kan testas för i en enda analys. Ett alternativ till dPCR är nästa generations sekvensering (NGS), som kan detektera flera mutationer över många gener, vilket ökar nyttan av ett enda prov. NGS kan detektera mutationer i CSF och plasma hos patienter med hjärnstammen gliom²⁰är dock för närvarande mindre känslig än dpcr vid detektering av tumör mutationer i cfdna, med detektionsgränser på 0,1-10% MAF jämfört med 0,001% i PCR-baserade metoder²¹ . dPCR uppnår också snabbare handläggningstid än NGS, vilket möjliggör snabb detektering av mutationer av intresse. PCR-metoden gäller för olika cancertyper och kan utökas för att detektera hotspot-mutationer och metylerat cfDNA²².

Den flytande biopsi är verkligen i sin linda och kommer att kräva ytterligare utveckling för att skräddarsy till specifika sjukdomar. Tumör övervakning i samband med tumörutveckling kommer att bli nästa utmaning, där en plattform som kan upptäcka nya mutationer med hög känslighet skulle krävas. Dessutom, plattformar som kan upptäcka en mängd olika biomolekyler (peptider, cytokiner, RNA) kommer att vara mycket fördelaktigt att bedöma tumörsvar på behandling, samt avancera personliga kliniska interventioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0)	Teknova	T0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL)	Becton Dickinson Diagnostics	367525	For plasma collection
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL)	Becton Dickinson Diagnostics	367895	For serum collection
Bleach	General Lab Supplier
Buffer ATL	Qiagen	19076
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes	Streck	218961	cfDNA blood collection tubes (optional)
CentriVap Concentrator	Labconco	7810010
Forward Primer	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design
MiniAmp Thermal Cycler	Thermofisher Scientific	A37834
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof)	General Lab Supplier
Mutant Probe	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design
PAXgene Blood ccfDNA tubes	PreAnalytiX	768115	cfDNA blood collection tubes (optional)
PCR 8 well strip tube caps	VWR	10011-786
PCR 8 well strip tubes	Axygen	PCR-0208-C
Pipette (p20, p200, p1000)	General Lab Supplier
Pipette filter tips (p20, p200, p1000)	General Lab Supplier
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs Inc	M0494S
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook	Qiagen		cfDNA extraction kit handbook (2013 edition)
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	cfDNA extraction kit (Protocol Step 4)
QIAamp MinElute Virus Spin Kit	Qiagen	57704	Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes
Qiavac 24 Plus	Qiagen	19413	For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit
Raindance Consumable Kit	Bio-Rad	20-04411	Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil
Raindance Sense Instrument	Bio-Rad		Quantification instrument (used in Protocol Step 9)
Raindance Source Instrument	Bio-Rad		Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9)
RainDrop Analyst II Software	RainDance Technologies		Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10)
Refrigerated Vapor Trap	Savant	RVT5105-115
Reverse Primer	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design
Smartblock 2 mL	Eppendorf	05 412 506
TaqMan Genotyping Master Mix	Thermofisher Scientific	4371353
Thermomixer C	Eppendorf	14 285 562PM
WT Probe	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design