Summary
En ny prov hållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi tillsammans med ett lämpligt hanterings protokoll presenteras. Systemet tillåter kristall tillväxt, kristall blöt läggning och in situ diffraktion data insamling på både, omgivande och kryogena temperatur utan behov av någon kristall manipulation eller montering.
Abstract
Makro molekyl ära röntgenkristallografi (MX) är den mest framträdande metoden för att erhålla hög upplöst tredimensionell kunskap om biologiska makro molekyler. En förutsättning för metoden är att högt beställt kristallint prov måste odlas från den makro molekyl som ska studeras, som sedan måste förberedas för diffraktions försöket. Detta förberedelse förfarande innebär typiskt avlägsnande av kristallen från lösningen, där den odlades, blöt läggning av kristallen i ligand lösning eller Cryo-Protectant lösning och sedan immobilisera kristallen på ett fäste som lämpar sig för experimentet. Ett allvarligt problem för detta förfarande är att makro molekyl ära kristaller ofta är mekaniskt instabila och ganska bräckliga. Följaktligen kan hanteringen av sådana ömtåliga kristaller lätt bli en Flask hals i ett struktur bestämnings försök. Varje mekanisk kraft appliceras på sådana ömtåliga kristaller kan störa den vanliga packning av molekylerna och kan leda till en förlust av diffraktion makt kristaller. Här presenterar vi en ny allt-i-ett prov hållare, som har utvecklats för att minimera hanteringen steg av kristaller och därmed maximera framgången för strukturen beslutsamhet experiment. Prov hållaren stöder inställning av kristall droppar genom att ersätta de ofta använda Mikroskop täckglasen. Vidare tillåter det på plats kristall manipulation såsom ligand blöt läggning, Cryo-skydd och komplex bildning utan någon öppning av kristallisation hålighet och utan kristall hantering. Slutligen har prov hållaren utformats för att möjliggöra insamling av in situ-röntgen diffraktions data vid både omgivnings-och kryogena temperaturer. Genom att använda denna prov hållare, chanserna att skada kristallen på väg från kristallisation till diffraktion data insamling reduceras avsevärt eftersom direkt kristall hantering inte längre behövs.
Introduction
Kunskapen om den tredimensionella strukturen hos biologiska makro molekyler utgör en viktig hörnsten i alla grundläggande biologiska, biokemiska och biomedicinska undersökningar. Detta omfattar även vissa translationella aspekter av sådan forskning, såsom till exempel läkemedels upptäckt. Bland alla metoder för att erhålla sådan tredimensionell information vid atomär upplösning är röntgenkristallografi den mest kraftfulla och mest framträdande som bevisas av det faktum att 90% av all tillgänglig strukturell information bidrar med röntgen Kristallografi1. Den stora förutsättningen för röntgenkristallografi, som samtidigt är dess stora begränsning, är att kristaller av diffraktions kvalitet måste framställas och förberedas för diffraktions experimentet. Detta steg utgör fortfarande en av de största Flask halsarna i metoden.
Historiskt sett samlades diffraktions data från protein kristaller vid rums temperatur. Enskilda kristaller var omsorgsfullt överföras till glas eller kvarts kapillärer före data insamling, mor sprit lades till kapillärerna så att kristallerna inte skulle torka ut och kapillärerna var förseglade2,3, med 4. Sedan 1980-talet blev det mer och mer uppenbart att på grund av röntgenstrålningens joniseringsegenskaper och den förestående strålnings känsligheten hos makro molekyl ära kristaller utgör data insamlingen vid omgivnings temperatur stränga begränsningar för metoden. Därför utvecklades metoder för att mildra effekterna av strålnings skador genom kylning av makro molekyl ära kristaller ner till 100 K och för att samla in diffraktions data vid en sådan låg temperatur på5,6. För att arbeta vid låga temperaturer, montering av proverna i kapillärer blev opraktiskt på grund av den låga värme överföring. Trots detta finns det pågående insatser för att också använda kapillärer, särskilt från Counter-diffusion kristalliserings experiment, för låg temperatur diffraktion arbete7,8, men oavsett det, det blev standard metod i Makromolekylär kristallografi för att montera Makro molekyl ära kristaller som innehas av en tunn film av Moder sprit inuti en tunn tråd slinga9,10. Även om ett antal förbättringar (t. ex. införandet av litografiska slingor och liknande strukturer11) har gjorts över tid till denna loop-baserade montering, är de grundläggande principer som utvecklades i början av 1990-talet fortfarande i bruk idag. Det kan säkert anges att de flesta diffraktion data samlingar på makro molekyl ära kristaller nuförtiden fortfarande förlita sig på denna metod5.
Med tiden fanns det en del intressanta nya utvecklingar och modifieringar av den loopbaserade monterings metoden, men dessa tillvägagångs sätt har hittills inte varit allmänt antagna i samhället. En är den so-called kretsa-mindre monteringen av kristaller, som framkallades för att uppnå lägre bakgrundscattering12,13,14. En annan är användningen av grafensheaths att linda de kristalliska proverna och för att skydda dem från uttorkning. Grafen är ett väl lämpat material i det avseendet på grund av dess mycket låga X-ray spridnings bakgrund15.
På senare tid har utvecklingen på området för prov fästen främst inriktats på att standardisera monteringar i syfte att öka prov kapaciteten16 eller på att designa fästen, som kan rymma mer än ett prov17, till exempel mönstrade membran på en kisel ram, som kan hålla hundratals små kristaller främst inom serie kristallografi18,19,20,21,22.
Alla de prov monterings metoder som diskuterades hittills kräver en viss grad av manuell intervention, vilket innebär att det finns en inneboende risk för att orsaka mekaniska skador på provet. Därför söks nya angrepps sätt genom att iscensätta prov miljön så att diffraktions data från kristaller kan samlas in i deras tillväxt miljö. En sådan metod kallas in situ eller plåt-screening23,24 och det är redan genomförts på ett antal makro molekyl ära kristallografi linjer på olika Synchrotron källor över hela världen25. Användningen av denna metod begränsas dock av kristall plåtarnas geometriska parametrar och det utrymme som finns runt instrumentets provtagnings punkt.
Ännu en metod realiseras i den så kallade CrystalDirect system26. Här skördas hela kristalliserings droppar automatiskt. Folier på vilka kristallerna har odlats är skräddarsydda med hjälp av en laser och används direkt som prov hållare27.
I det arbete som beskrivs här var syftet att utveckla en prov hållare, vilket skulle göra det möjligt för en användare att flytta det kristall klara provet från sin tillväxt kammare till data insamlings anordningen utan att röra vid den och som skulle göra det möjligt för användaren att enkelt manipulera provet. Eftersom många forskare inom Makromolekylär kristallografi fortfarande använder ett 24-väl kristalliserings format för att optimera kristall tillväxten genom att modifiera förhållanden som identifierats i stora screening kampanjer, utformades den nya prov hållaren för att kompatibelt med detta format. I det följande beskrivs utformningen av den nya prov hållaren, och prov innehavarens hantering och utförande för in situ-uppgiftsinsamling och ligand-blöt läggning kommer att påvisas. Slutligen kommer lämpligheten hos denna nya prov tagare och dess begränsningar för de olika arbets stegen att diskuteras.
Protocol
Varning: för alla efterföljande arbeten är det mycket viktigt att den gulfärgade polyimid-folien inte får vidröras med oskyddade fingrar, på grund av eventuella kontamineringar i prov hållaren. Dessutom är användningen av skyddade pincett rekommenderas starkt.
1. prov hållaren
- Använd en av de tre typerna av prov hållare.
Obs: tre olika versioner av den nya utvecklade prov hållaren visas i figur 1. Alla av dem innehåller en svart plast stöd struktur, en lufttät COC folie på utsidan och en microporös strukturerad polyimid folie på insidan. Typ 1 (figur 1a) innehåller en fast yttre plast ring, medan för typerna 2 och 3 (figur 1b,1c) den yttre ringen kan brytas av mekaniskt vid de angivna respektive Bryt punkterna för användning i automatiserade prov överförings system (se röd pilarna i figur 1b). Utformningen av provet innehavare tillåter installation av flera kristallisation droppar på den gula polyimid folie. Det äventyrar inte övervakningen av kristalliserings experiment, eftersom materialet är mycket transparent för synligt ljus. Den 21 μm tjocka polyimid folie har också 5 μm porer, vilket möjliggör enkel kristall manipulation genom blöt läggning senare. Eftersom överföring av röntgen strålar är nära 1,0 vid alla allmänt använda diffraktion data insamling energier i Makromolekylär kristallografi, bidraget av folien till bakgrunden spridning i ett diffraktion experiment är försumbar28.
2. ställa in kristalliserings droppar
- Skapa en ren och dammfri yta med en fuktig, luddfri trasa. Ta en prov hållare från dess låda och försiktigt placera den, gul folie uppåt, på den rengjorda ytan för att undvika skador eller oönskad punktering av bak sidan COC folie.
- Ställ in kristalliserings droppar med en maximal Rekommenderad volym på 2 μL på den gula folien som det skulle göras på vanliga omslags bilder. Placera dropparna försiktigt för att undvika bristning eller piercing av folien med hjälp av en pipett. På en prov hållare av typ 1 (figur 2A) kan upp till tre droppar placeras, medan på prov hållare av typ 2 och 3 2 droppar är det rekommenderade maximivärdet (figur 2C).
- Vänd prov hållaren över och placera den på en pre-smord hålighet av en 24-väl Linbro stil tallrik. Använd positionerings stöden (se de röda pilarna i figur 1a) på prov hållaren för att styra den till dess optimala position.
- Se till att prov hållaren är korrekt positionera för att undvika oönskad avdunstning (figur 2A).
3. observation av kristall tillväxt
- Genom att placera kristalliserings plattan under ett transmissions ljus Mikroskop, med eller utan polarisatorer, kan du övervaka kristall tillväxten utan någon störning av experimentet (figur 4).
- Vid användning av de mindre 18 mm-Provhållarna av typ 3 (figur 1c), som utformats för användning på plattor med SBS-avtryck, använder man en avbildnings robot som kan hantera SBS-footprint-plåtar för att övervaka kristall tillväxten på ett mer automatiserat sätt.
4. kristall manipulation
Obs: det rekommenderas att utföra alla efterföljande steg under ett transmissions ljus Mikroskop.
-
Cryo-skydd
- Stick försiktigt in den yttre COC-folien med en fin kanyl. Se till att den inre gula folien förblir orörd. Punkteringen bör vara precis bredvid den droppe som ska manipuleras (figur 3a,3c).
- Använd en fin pappersveke och sätt in den i det petade hålet. Skjut försiktigt veken framåt tills den vidrör den gula polyimid folie. Håll veken i kontakt med den perforerade folien. Veken kommer att suga bort all överflödig lösning. Den tid som krävs för fullständig vätske sanering beror på lösningarnas viskositet och moderns sprit sammansättning (figur 3b).
- När all vätska sugs bort, försiktigt återkalla pappersveken. Kom ihåg positionen för Drop, eftersom det inte kan vara synlig efter avlägsnande av mamman sprit.
- Ta en standard pipett för att applicera en liten mängd Cryo-Protectant lösning, max. 3 μL, med hjälp av en extruderad spets (t. ex. en gel påfyllnings spets) genom samma hål. När vätskan är dispenseras, dra tillbaka spetsen. Den porositet av den gula folien möjliggör diffusion över folien. Tiden för att uppnå Cryo-skydd av dina kristaller beror mycket på den sysselsatta lösningen och dess komponenter.
- För att återförringa den självläkande COC-folien, placera försiktigt ett skyddat finger på hålet i ca 1 s och skjut det över punkteringen. Det lätta trycket i kombination med den förhöjda temperaturen kommer att främja återförslutning av punkteringar, som inte är för stora.
-
Ligand blöt läggning
Obs: överskott av moderlut kan avlägsnas innan ligand blöt läggning. För att göra detta, Följ stegen som beskrivs i 4.1.1 till 4.1.3.- Lös upp ligand i moders sprit i önskad koncentration i ett reaktions rör.
- Snurra lösningen i 10 minuter på 12 000 x g för att ta bort olösliga partiklar. Använd en temperaturkontrollerad centrifug vid behov.
- Placera försiktigt en volym på max. 3 μl ligand innehåll ande lösning i gapet mellan COC folie och polyimid filmen med en lång, extruderad Pipettera spets. Dra tillbaka spetsen.
- För att återförvisa den självläkande COC-folien, placera försiktigt ett skyddat finger på hålet i ca 1 s och skjut det över punkteringen (se även 4.1.5).
- Inkubera experimentet under en tid för att möjliggöra diffusion över membranet. Blöt läggnings tiden beror mycket på viskositeten hos den diffusa lösningen och dess komponenter29.
- Upprepa steg 4.2.1 till 4.2.5 flera gånger för att därefter suga olika ligander.
5. in situ diffraktion data insamling vid omgivnings temperatur
Anmärkning: för att minimera spridningen av lösnings medel, avlägsna överflödig lösning innan data insamlingen.
- Säkerställ en stabil luft fuktighet kontrollerad beamline miljö med förutbestämda villkor30.
- Lyft försiktigt upp den genomskinliga COC-folien vid den utsedda punkten med hjälp av pincett och dra av den som om den skulle ta bort locket från en yoghurtkopp ( figur 6b).
- Lyft försiktigt prov hållaren från håligheten och sätt in den direkt i en förberedd magnet prov hållare. Inget lim behövs för detta steg (figur 6b).
- Tryck försiktigt för att säkerställa korrekt placering av prov hållaren i basen.
- Montera prov hållaren på en beamline goniometer och säkerställ korrekt positionering av hållaren. Beroende på goniometergeometri kan prov hållaren roteras med upp till 160 ° utan att orsaka någon skuggning under diffraktions försöket.
- Använd en pappersveke och försiktigt röra den gula polyimid folie från bak sidan för att ta bort överflödig mamma sprit. Observera, att i det skedet ligand blöt läggning eller Cryo-skydd kan utföras lika bra. Provet är nu redo för centrering och diffraktion data insamling.
- När du använder en prov hållare med avtagbar yttre ring, tryck försiktigt genom att hålla på den yttre ringen och Bryt av den vid de angivna Bryt punkterna (figur 6C). Provet är nu redo för centrering och diffraktion data insamling.
6. in situ diffraktion data insamling vid Kryogen temperatur
Anmärkning: det är rekommenderat att ta bort restmoderlut från provet genom att utföra stegen 4.1.1. till 4.1.3. innan du fortsätter med nästa steg för att minimera spridningen av lösnings medel. De flesta prover kan överföras till flytande kväve utan föregående Cryo-skydd31. Om Cryo-skydd behövs, se steg 4.1.1. till 4.1.5.
- Lyft försiktigt upp COC-folien vid den utsedda punkten med hjälp av en pincett och dra av den (se steg 5.1.2) (figur 6a).
- Ta prov hållaren från håligheten och montera den på en magnetisk prov hållare bas. Lätt tryck kan användas för att säkerställa korrekt och åtsittande montering (se steg 5.1.5, figur 6b).
Anmärkning: de symmetriskt ordnade brytpunkterna gör det möjligt att enkelt ta bort prov hållarens yttre ring genom att använda ett lätt tryck (se steg 5.1.8., figur 6c). Nu är prov hållaren klar och kan kastas i flytande kväve. Geometrin hos prov hållarens typ 2 och 3 (figur 1b,1c) gör det möjligt att överföra dem till standard prov flaskor för ryggrad, som kan användas för prov montering med hjälp av robotar (figur 6d).
Representative Results
Prov hållaren typ 1 har utformats så att den passar på en brunn av en 24-brunn Linbro stil plattan. Varje enskild prov hållare innehåller positionerings hjälpmedel på vardera sidan om den yttre fälgen för att säkerställa optimal positionering på brunnen (figur 1a, figur 2A). Upp till tre individuella kristalliserings droppar av maximal volym 2 μL vardera kan placeras på den gula polyimid folie (figur 2b). För prov hållare av typ 2 och 3 rekommenderas att maximalt två droppar av Max volymen 2 μL vardera anges. 24 prov hållare kan monteras på 1 24-väl Linbro platta (figur 3D).
Ett kristalliserings experiment på en 24-väl Linbro plåt med prov hållare typ 1 inrättades. 1 μL hönsägg-vit lysozymlösning (15 mg/mL) blandades med 1 μL moder-sprit bestående av 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl och 25% (vikt/volym) PEG-6000 på den gula polyimidefolien på prov hållaren (tabell 1). Droppen var utjämna vid 293 K mot 500 μL av Moder-sprit och kristaller av storlek 40-50 μm observerades efter 5 timmar (figur 4). Crystal tillväxt kan observeras med hjälp av ett transmissions ljus Mikroskop (figur 4) med eller utan en polarisator. Hög transparens filmer säkerställa bästa observation och övervakning av kristall odlings förhållanden med hjälp av både en konventionell ljus Mikroskop eller en automatiserad kristall bild system. Kristall tillväxt observation med UV-ljus testades inte.
Efter avlägsnande av mamman sprit från runt kristaller, en prov hållare med höna ägg-vita lysozym kristaller togs från kristallisation plattan och placeras i en luft fuktighet-kontrollerad luft ström på HZB-MX beamline 14,332. Diffraktions data samlades in vid omgivnings temperatur i 1 °-steg med hjälp av en 150 μm stråle vid 13,8 keV energi med 4 x 1010 fotoner/s och en exponerings tid på 5 s per bild. En typisk diffraktions bild visas i figur 5. Ingen förhöjd bakgrunds spridning på diffraktions bilden kan upptäckas. Ytterligare experimentella uppgifter samt tillhör ande data behandlings statistik listas i tabell 2.
Figur 1 : Schematisk vy över de nya prov hållarna. Prov hållarna består av ett svart plast stöd, som täcks på den yttre sidan med en amorf cyklisk olefin sampolymer (COC) folie. Denna folie (färgad i blått) är mycket transparent och självläkande. Det säkerställer också gas täthet av experimentet. Den inre folie (färgad i gult) är gjord av bio-inert polyimid, som är mycket transparent för röntgen strålar. På denna folie, kan kristallisation droppar placeras. Prov hållarens yttre kant innehåller två positionerings hjälpmedel som indikeras av den röda pilen (panel A), som möjliggör noggrann placering av prov hållaren på den individuella förfettade håligheten i kristalliserings plattan. (A) prov hållare (typ 1) med 22 mm diameter med en fast extern stöd ring. (B) prov hållare (typ 2) med 22 mm diameter med löstagbar extern stöd ring. (C) prov hållare (typ 3) med 18 mm diameter med löstagbar extern stöd ring. De två sistnämnda har utvecklats för att använda dem i en hög genom strömning mode med automatiserade prov monterings robotar med hjälp av SPINE standard. De angivna Bryt punkterna markeras med de röda pilarna i panel B. Den svarta pilen i panelen C anger positions markören. Den utskjutande stift i den yttre omkrets av den gula folien är nödvändiga för att anpassa polyimid folie under produktions processen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Prov hållaren får användas på en 24-väl Linbro-plåt på samma sätt som de ofta använda Mikroskop täckglasen. Det tätar håligheten lufttät. Positionerings hjälpmedel säkerställer korrekt placering av prov hållaren i håligheten (Röda pilar i panel a). Upp till tre enskilda droppar kan placeras på en typ 1-provhållare (panel B), medan det rekommenderade maximala antalet droppar som placerats på en typ 2-eller 3-provhållare är två. Den maximala rekommenderade volymen för varje droppe är 2 μL. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : 24 typ 1-provhållare passar på en 24-brunn tallrik. Prov hållarna kan placeras i två riktningar på 24-välts plattan enligt indikerad (panel D). En kanyl används för att tränga in i ryggen COC folie för att avlägsna överskott sprit från en kristallisation droppe (paneler a och C) genom att använda en pappersveke försiktigt in i samma hål (panel B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bild av höna ägg-vita lysozym kristaller observerats genom ett transmissions Mikroskop utrustad med en polarisator. Individuella kristaller diskrimineras lätt från utfällda protein lösningar. Kristallerna i denna bild är av en genomsnittlig storlek på 40 μm x 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : En typisk röntgen diffraktions bild av en lysozym kristall som odlas på prov hållaren. Före exponering för röntgen strålar alla överskott moder sprit bort från runt kristallen. Diffraktions data samlades in vid omgivnings temperatur på BL 14.3 på elektron lagrings ringen BESSY II32 med hjälp av en fuktighets kontrollerad prov miljö med 97,5% relativ fuktighet. Ingen förhöjd bakgrund på grund av prov hållarna kan observeras. De streckade linjerna i bilden anger upplösnings ringarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Prov hållaren är för beredd för data insamling med diffraktion. Först, COC filmen lyfts försiktigt med hjälp av en pincett och sedan skalas av (panel a). Därefter avlägsnas prov hållaren från håligheten och sätts in i det centrala hålet i en magnetisk bas tills den indikeras av markören (panel B). Genom att hålla fast vid den centrala delen appliceras ett lätt tryck på den yttre ringen för att frigöra den centrala delen med hjälp av symmetriskt ordnade utbrytpunkter (panel C). Efter avlägsnandet kan prov hållaren kastas i flytande kväve och överföras till vanliga SPINE-injektionsflaskor. Placerad, till exempel, i puckar de kan transporteras till Synchrotron platser där automatiserade prov montering robotar känner igen dem som vanliga prover (panel D). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kristalliserings Detaljer | |
| Metod | Hängande droppe, ångdiffusions metod |
| Typ av plåt | SuperClear tallrikar |
| Temperatur (K) | 293 |
| Protein koncentration (mg mL-1) | 15 |
| Sammansättning av reservoarlösning | 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25% (vikt/volym) PEG-6000 |
| Volym och förhållande av tappa | 2 μL totalt, 1:1 ratio (protein: moderlut |
| Reservoarens volym | 500 μL |
| Inkubations tid | 12 timmar |
Tabell 1: experimentella uppgifter om det beskrivna kristalliserings experimentet.
| Insamling och behandling av uppgifter | |
| Våglängd (Å) | 0,89429 |
| Temperatur (K) | 293 |
| Detektor | Rayonix MX225 CCD |
| Avstånd för kristall detektor (mm) | 120 |
| Rotations intervall per bild (°) | 0,5 |
| Totalt rotations område (°) | 120 |
| Exponerings tid per bild (er) | 5 |
| Rymd grupp | P43212 |
| Enhets cells parametrar (Å) | a = 79,01, b = 79,01, c = 37,95 |
| Mosacity (°) | 0,07 |
| Upplösning spänner (Å) | 39,50-1,35 (1,37-1,35) |
| Totalt antal reflektioner | 191940 (8932) |
| Antal unika reflektioner | 27020 (1292) |
| Fullständighet (%) | 99,88 (99,20) |
| Multiplicity | 7,1 (6,9) |
| Medelvärde I/σ (I) | 15,0 (1,9) |
| R-Meas35 (%) | 6,3 (107,0) |
| Rpim36 (%) | 2,4 (40,4) |
| CC1/237 | 99,9 (68,5) |
| ISa38 | 16,1 |
| Wilson B-Factor (Å2) | 17,0 |
Tabell 2: data insamling och bearbetning av diffraktions statistik.
Discussion
Lämplighet för kristalliserings experiment. De nya prov hållarna kan användas för standard hängande fallkristalliserings experiment med hjälp av antingen 24-well Linbro typ plåtar (typ 1 och 2), eller 24-väl SBS fot avtryck plåtar där varje brunn har en diameter på 18 mm (Type 3). De kan användas i stället för de vanliga Mikroskop täckglasen. Den amorfa COC folie säkerställer luft täthet i systemet. Övervakningen av kristalliserings experiment är möjligt med hjälp av ett transmissions ljus Mikroskop, på grund av användning av hög klarhet folier. Såvitt vi vet finns det inga andra prov hållare för 24-väl kristalliserings plattor, vilket skulle möjliggöra kristall manipulation eller diffraktions experiment, utan att mekaniskt ta bort kristallen från den droppe där den odlas. Detta är av särskild betydelse, eftersom många forskare inom området fortfarande förlitar sig på sådana plattor för kristall optimering, på grund av det faktum att större Drop volymer kan användas jämfört med 96-well sittande-Drop tallrikar. Med dessa större Drop volymer, större kristaller kan erhållas.
Lämplighet för kristall manipulation. Tack vare de självläkande egenskaperna hos den yttre COC-folien och den mikroporösa strukturen hos den inre gula polyimidefolien är kristall miljön tillgänglig och kristallerna kan manipuleras utan att mekaniskt överföra dem till andra behållare. Detta gör att prov hållarna är mycket bekväma. Det enda andra systemet vi känner till, vilket gör att denna indirekta och skonsam till gång till kristallen, är CrystalDirect systemet26. Men CrystalDirect är mindre flexibelt eftersom speciella 96-och kristalliserings plattor måste användas. Folien, som kristallerna växer, är densamma som tätar kristalliserings experiment och det är inte självläkande. Detta innebär att en bländare som har genomborrat i folien genom laser ablation för ligand eller Cryo-Protectant leverans till kristallerna kommer att förbli öppen, vilket ökar chansen för flytande avdunstning. Detta är i motsats till vår design, där kristaller inte kommer att exponeras direkt för miljön även om COC folie blir genomborrade ett antal gånger.
Lämplighet för in situ diffraktions experiment vid omgivnings temperatur. Provet hållaren kan tas bort från kristallisation plattan i ett rakt framåt sätt, fastnat på en magnetisk bas och sätta på en beamline goniometer. För en diffraktion experiment vid rums temperatur, är det lämpligt att sätta provet i en luft ström av definierad fuktighet33. Mamman sprit runt kristallen kan avlägsnas innan du sätter prov hållaren på goniometer för att minska bakgrunds spridningen. En sådan uppsättning är stabil i timmar.
Lämpligheten av det använda materialet för drift och förvaring vid 100 K. Varken materialet som används vid tillverkningen av prov hållaren eller polyimid-filmen påverkas negativt av nedkylning till låga temperaturer34. Att arbeta med prov hållaren vid låg temperatur (t. ex. 100 K) utgör därför inget allvarligt problem.
Lämplighet för in situ diffraktions experiment vid 100 K. För data insamling vid 100 K i en kväve ström, måste prov hållaren avlägsnas från kristalliserings plattan som i föregående stycke, fast på en magnetisk bas och placeras i en gasformig kväve ström vid 100 K på en beamline goniometer. Om så önskas kan provet också vara kryoskyddat, även om det är troligt att det för nakna prover kanske inte är nödvändigt i de flesta fall31. För experiment på 100 K är prov hållarna typ 2 och 3 bättre lämpade eftersom den yttre plast ringen kan avlägsnas. Därför är de av mindre storlek och bör därmed vara mindre benägna att isbildning. Även en prov innehavare av typ 1 får dock användas. Med tanke på en inte alltför hög luft fuktighet i den experimentella kaninbur och en korrekt justerad Cryo-system isbildning av innehavaren är egentligen inte ett problem.
Begränsade begränsningar. Prov innehavarens geometri medger obehindrat insamling av diffraktions data med rotations metoden över ett totalt rotations område på 160 °. Detta är tillräckligt så att kompletta diffraktion data uppsättningar kan erhållas för de flesta kristall system. I fall där detta inte är möjligt måste data från mer än kristall slås samman. När kristaller odlas tillsammans, kan det vara möjligt att justera storleken på incidenten röntgen stråle så att endast delar av enskilda kristaller exponeras. I extrema fall kan man behöva tillgripa en data insamlings strategi som liknar MeshAndCollect-metoden35. Sammanfattnings vis, medan det finns vissa begränsningar i samband med urvalet innehavare, dessa kan övervinnas i de flesta fall. Naturligtvis är det alltid möjligt att situationer påträffas, där inget av detta är möjligt. I sådana fall kan man behöva tillgripa andra kristall monterings metoder.
Vi har beskrivit en ny typ av prov hållare för Makromolekylär kristallografi och vi har visat prov hållarnas lämplighet för olika tillämpningar. Med hänsyn till den enkla och reproducerbara hanteringen av protein kristaller, liksom de unika egenskaperna hos prov tagarna, anser vi att dessa prov hållare kommer att visa sig vara ett värdefullt komplement till den arsenal av prov hållare för makro molekyl ära Kristallografi.
Disclosures
Patent ansökningar avseende den anmälda prov innehavaren har lämnats in av Helmholtz-Zentrum Berlin med följande registrerings nummer och registrerings datum med det tyska patent-och varumärkes kontoret: DE 10 2018 129 125,6, anmälnings datum 20 november th, 2018; DE 10 2018 125 129,7, anmälnings datum 11 oktober, 2018; DE 10 2017 129 761,8, anmälnings datum december 13th, 2017. En efterföljande internationell patent ansökan via PCT rutten, med prioritet av DE 10 2017 129 761,8 har lämnats in, PCT/DE2018/101007. En registrering av en nyttighets modell med nummer DE 20 2018 106 955,1 lämnades in på December 6th, 2018. Prov hållaren har gjorts kommersiellt tillgänglig under firma namnen XtalTool och XtalTool/HT av Jena Bioscience, Jena, Tyskland.
Acknowledgments
Författarna vill tacka BESSY II, som drivs av Helmholtz-Zentrum Berlin för beam tid till gång och stöd, och avdelningarna för Sample miljö och teknisk design för deras hjälp med design och konstruktion och till gång till 3D-skrivare anläggningar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 - 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 - 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
References
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
- Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
- Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
- Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
- Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
- Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
- Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
- Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
- Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
- Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
- Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
- Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
- Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
- Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
- Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
- Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
- Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
- Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
- McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
- Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).
