Summary
En roman prøveholder til makromolekylær røntgenkrystallografi sammen med en passende håndterings protokol præsenteres. Systemet giver krystalvækst, krystal iblødsætning og in situ diffraktion dataindsamling på både omgivende og kryogen temperatur uden behov for nogen krystal manipulation eller montering.
Abstract
Macromolekylære X-ray krystallografi (MX) er den mest fremtrædende metode til at opnå høj opløsning tredimensionel viden om biologiske makromolekyler. En forudsætning for metoden er, at højt bestilt krystallinsk præparat skal dyrkes fra det makromolekyle, der skal undersøgt, og som derefter skal forberedes til diffraktion-eksperimentet. Denne forberedelse procedure typisk indebærer fjernelse af krystal fra opløsningen, hvor det blev dyrket, iblødsætning af krystal i ligand opløsning eller Cryo-protectant løsning og derefter immobilisering af krystal på en mount egnet til eksperimentet. Et alvorligt problem for denne procedure er, at makromolekylære krystaller ofte er mekanisk ustabile og temmelig skrøbelige. Derfor kan håndteringen af sådanne skrøbelige krystaller let blive en flaskehals i et forsøg på at bestemme strukturen. Enhver mekanisk kraft, der påføres sådanne sarte krystaller kan forstyrre den almindelige pakning af molekyler og kan føre til et tab af diffraktion effekt af krystaller. Her præsenterer vi en roman alt-i-én prøve indehaver, som er blevet udviklet med henblik på at minimere håndteringen trin af krystaller og dermed at maksimere succesraten af strukturen beslutsomhed eksperiment. Prøveholderen understøtter opsætningen af krystal dråber ved at udskifte de almindeligt anvendte mikroskop dæksedler. Desuden giver det mulighed for in-Place krystal manipulation såsom ligand iblødsætning, kryo-beskyttelse og kompleksdannelse uden åbning af krystalliserings hulen og uden krystal håndtering. Endelig er prøveholderen konstrueret med henblik på at muliggøre indsamlingen af in situ-røntgen diffraktion-data ved både omgivende og kryogen temperatur. Ved at bruge denne prøveholder er chancerne for at beskadige Krystallen på vej fra krystallisering til diffraktion dataindsamling betydeligt reduceret, da direkte krystal håndtering ikke længere er påkrævet.
Introduction
Kendskabet til den tredimensionale struktur af biologiske makromolekyler udgør en vigtig hjørnesten i al grundlæggende biologisk, biokemisk og biomedicinsk forskning. Dette endda strækker sig til visse translationelle aspekter af en sådan forskning, såsom for eksempel narkotika opdagelse. Blandt alle metoder til opnåelse af sådanne tredimensionale oplysninger ved atomar opløsning X-ray krystallografi er den mest magtfulde og mest fremtrædende en, som det fremgår af det faktum, at 90% af alle tilgængelige strukturelle oplysninger er bidraget af X-ray krystallografi1. Den vigtigste forudsætning for røntgenkrystallografi, som samtidig er dens største begrænsning, er, at diffraktion-kvalitet krystaller skal produceres og forberedes til diffraktion eksperiment. Dette skridt er stadig en af de største flaskehalse i metoden.
Historisk set, diffraktion data fra protein krystaller blev indsamlet ved omgivelsestemperatur. Individuelle krystaller blev omhyggeligt overført til glas eller kvarts kapillærer forud for dataindsamlingen, Moder væske blev føjet til kapillærer, således at krystallerne ikke ville tørre ud og kapillærer blev forseglet2,3, 4. for at Siden 1980 ' erne, blev det mere og mere klart, at på grund af de ioniserende egenskaber af X-stråling og den overhængende stråling følsomhed af makromolekylære krystaller, dataindsamling ved omgivelsestemperatur udgør alvorlige begrænsninger på metoden. Derfor blev der udviklet tilgange til at afbøde strålingsskader effekter ved at køle makromolekylære krystaller ned til 100 K og til at indsamle diffraktion data ved så lav temperatur5,6. Til arbejde ved lave temperaturer blev montage af prøverne i kapillærer upraktisk på grund af den lave varme overføringshastighed. På trods af dette, er der løbende bestræbelser på også at bruge kapillærer, især fra kontra diffusion krystalliserings forsøg, for lav-temperatur diffraktion arbejde7,8, men uanset det, blev det standard tilgang i makromolekylær krystallografi til at montere makromolekylære krystaller, der indehaves af en tynd film af moder væske inde i en tynd kablet sløjfe9,10. Selv om en række forbedringer (f. eks. indførelsen af litografiske sløjfer og lignende strukturer11) er blevet gjort over tid til denne loop-baseret montering, de grundlæggende principper, der blev udviklet i begyndelsen af 1990 ' erne er stadig i brug i dag. Det kan sikkert siges, at de fleste diffraktion datasamlinger på makromolekylære krystaller i dag stadig stole på denne tilgang5.
Over tid, der var nogle interessante nye udviklinger og ændringer af loop-baserede monteringsmetode, men disse tilgange er hidtil ikke blevet bredt vedtaget i samfundet. Den ene er den såkaldte loop-less montering af krystaller, som blev udviklet for at opnå lavere baggrunds spredning12,13,14. En anden er brugen af Graphene skeder at wrap de krystallinske prøver og beskytte dem mod udtørring. Graphene er et velegnet materiale i denne henseende på grund af sin meget lave røntgen spredning baggrund15.
På det seneste er udviklingen inden for prøve mounts hovedsagelig fokuseret på at standardisere beslagene med det formål at øge prøvehastigheden16 eller på at designe mounts, som kan indeholde mere end én prøve17, f. eks. mønstrede membraner på en Silicon frame, som er i stand til at holde hundredvis af små krystaller mest inden for seriel krystallografi18,19,20,21,22.
Alle de hidtidige prøve monteringsmetoder kræver stadig en vis grad af manuel indgriben, hvilket betyder, at der er en iboende fare for at forårsage mekanisk beskadigelse af prøven. Derfor er nye tilgange er ved at blive søgt ved ingeniør prøvemiljø sådan, at diffraktion data af krystaller kan indsamles i deres vækst miljø. En sådan metode er betegnet in situ eller plade-screening23,24 og det er allerede implementeret på en række makromolekylære krystallografi acceleratorens på forskellige Synchrotron kilder på verdensplan25. Anvendelsen af denne metode er dog begrænset af krystal pladens geometriske parametre og den plads, der er til rådighed omkring instrumentets prøvepunkt.
Endnu en tilgang er realiseret i det såkaldte CrystalDirect-system26. Her høstes hele krystalliserings dråber automatisk. De folier, hvor krystallerne er blevet dyrket, er brugerdefinerede-cut ved hjælp af en laser og anvendes direkte som prøveholderen27.
I det arbejde, der er beskrevet her, var målet at udvikle en prøveholder, som ville gøre det muligt for en bruger at flytte den krystallinske prøve fra sit vækstkammer til dataindsamlings anordningen uden at røre ved den, og som ville gøre det let for brugeren at manipulere prøven. Da mange forskere inden for makromolekylær krystallografi stadig bruger 24-brønd krystalliserings formatet til optimering af krystalvækst ved at ændre de betingelser, der er identificeret i store Screenings kampagner, er den nye prøve indehaver designet til at være kompatibelt med dette format. I det følgende beskrives udformningen af den nye prøveholder, og prøve indehaverens håndtering og ydeevne i forbindelse med in situ-dataindsamling og ligand-iblødsætning vil blive påvist. Endelig vil egnetheden af denne nye prøve indehaver og dens begrænsninger for de forskellige arbejdstrin blive diskuteret.
Protocol
Forsigtig: ved alt efterfølgende arbejde er det meget vigtigt, at den gule-farvede polyimid folie ikke berøres med ubeskyttede fingre på grund af mulige kontamineringer til prøveholderen. Også, brugen af beskyttede pincet er stærkt anbefales.
1. prøveholderen
- Brug en af de tre typer prøveholder.
Bemærk: tre forskellige udgaver af den nye, udviklede prøveholder er vist i figur 1. Alle af dem indeholder en sort plastik støttestruktur, en lufttæt COC folie på ydersiden og en Mikroporøs struktureret polyimid folie på indersiden. Type 1 (figur 1a) indeholder en fast udvendig plastring, hvorimod den ydre ring for type 2 og 3 (figur 1b,1c) kan afbrydes mekanisk ved de udpegede respektive brudpunkter til brug i automatiserede prøve overførings systemer (se rødt pilene i figur 1b). Udformningen af prøverne holdere tillader opsætningen af flere krystalliserings dråber på den gule polyimid folie. Det kompromitterer ikke overvågningen af krystalliserings forsøget, da materialet er meget gennemsigtigt for synligt lys. Den 21 μm tykke polyimid folie har også 5 μm porer, som tillader enkel krystal manipulation ved iblødsætning senere. Da transmissionen af røntgenstråler er tæt på 1,0 på alle almindeligt anvendte diffraktion dataindsamling energier i makromolekylær krystallografi, bidraget af folien til baggrunden spredning i et diffraktion eksperiment er ubetydelig28.
2. opsætning af krystalliserings dråber
- Opret en ren og støvfri overflade med en fugtig, fnugfri klud. Tag en prøveholder ud af æsken, og Anbring forsigtigt den gule folie opad på den rensede overflade for at undgå beskadigelse eller uønsket punktering af bagsiden af COC-folien.
- Indstil krystalliserings dråberne med et maksimalt anbefalet volumen på 2 μL på den gule folie, da det ville ske på almindeligt anvendte dækglas. Anbring dråberne forsigtigt for at undgå brud eller piercing af folien ved hjælp af en pipette. På en prøveholder af type 1 (figur 2a) kan der anbringes op til tre dråber, mens der på prøve indehavere af type 2-og 3 2-dråber er det anbefalede maksimum (figur 2c).
- Vend prøveholderen om, og anbring den på et forsmurt hulrum i en 24-brønd Linbro-stil plade. Brug positionerings hjælpemidler (Se røde pile i figur 1a) på prøveholderen til at styre den til den optimale position.
- Sørg for, at prøveholderen har den korrekte placering for at undgå uønsket fordampning (figur 2a).
3. observation af krystalvækst
- Ved at placere krystalliserings pladen under et transmissionslymikroskop, med eller uden polarisatorer, skal der overvåges krystalvækst uden nogen forstyrrelse af forsøget (figur 4).
- Ved brug af de mindre 18-mm prøveholdere af type 3 (figur 1c), som er konstrueret til brug på SBS-fodaftryk, skal der anvendes en billedbehandlings robot, der er i stand til at håndtere SBS-footprint-plader for at overvåge krystalvæksten på en mere automatiseret måde.
4. krystal manipulation
Bemærk: det anbefales at udføre alle efterfølgende trin under et transmissions lysmikroskop.
-
Cryo-beskyttelse
- Perforér forsigtigt den ydre COC-folie med en fin kanyle. Sørg for, at den indvendige gule folie forbliver uberørt. Punkturen skal være lige ved siden af det fald, der skal manipuleres (figur 3a,3c).
- Brug en fin papir væge, og sæt den i hullet. Skub forsigtigt vægen fremad, indtil den rører ved den gule polyimid folie. Hold vægen i kontakt med den perforerede folie. Vægen vil suge væk alle overskydende opløsning. Den nødvendige tid til fuldstændig væske fjernelse afhænger af opløsningernes viskositet og moderen spiritus sammensætning (figur 3b).
- Når al væsken er suget væk, trækkes papir vægen forsigtigt tilbage. Husk positionen af drop, da det ikke kan være synlige efter fjernelse af moderen spiritus.
- Tag en standard pipette til at anvende en lille mængde kryo-protectant opløsning, maks. 3 μL ved hjælp af en ekstruderet spids (f. eks. en gel-læsse spids) gennem det samme hul. Når væsken er dispenseret, trække spidsen. Porøsiteten af den gule folie giver mulighed for Diffusion på tværs af folien. Tiden til at opnå Cryo-beskyttelse af dine krystaller meget afhænger af den beskæftigede løsning og dens komponenter.
- For at forsegle den selvhelbredende COC-folie skal du forsigtigt placere en beskyttet finger på hullet i ca. 1 s og skubbe den hen over punkturen. Det lette tryk i kombination med den forhøjede temperatur vil fremme genforsegling af punkteringer, som ikke er for store.
-
Ligand iblødsætning
Bemærk: overskydende moder væske kan fjernes før ligand iblødsætning. For at gøre dette, skal du følge trinene beskrevet i 4.1.1 til 4.1.3.- Opløs ligand i moder væske i den ønskede koncentration i et reagensglas.
- Opløsningen centrifuger i 10 minutter ved 12.000 x g for at fjerne uopløselige partikler. Brug en temperaturkontrolleret centrifuge, hvis det er nødvendigt.
- Anbring forsigtigt et volumen på maks. 3 μl ligand indeholdende opløsning i hullet mellem COC folie og polyimid film ved hjælp af en lang, ekstruderet pipet spids. Træk spidsen tilbage.
- For at forsegle den selvhelbredende COC-folie skal du forsigtigt anbringe en beskyttet finger på hullet i ca. 1 s og skubbe den hen over punkturen (Se også 4.1.5).
- Inkupér eksperimentet i et stykke tid for at give mulighed for Diffusion på tværs af membranen. Iblødsætning afhænger i høj grad af viskositeten af sprede opløsningen og dens komponenter29.
- Gentag trin 4.2.1 til 4.2.5 flere gange for efterfølgende at suge forskellige ligander.
5. in situ diffraktion dataindsamling ved omgivelsestemperatur
Bemærk: for at minimere opløsningsmiddel spredning skal du fjerne overskydende opløsning før dataindsamlingen.
- Sikre et stabilt fugtigheds kontrolleret stråle miljø med forudfast satte betingelser30.
- Løft forsigtigt den transparente COC-folie på det angivne punkt ved hjælp af pincet og skræl den af, som om man ville fjerne låget fra en yoghurt kop ( figur 6b).
- Løft forsigtigt prøveholderen fra dens hulrum, og Indsæt den straks i en forud forberedt magnetisk prøveholder base. Ingen lim er nødvendig for dette trin (figur 6b).
- Der skal anvendes et forsigtigt Tryk for at sikre korrekt positionering af prøveholderen i bunden.
- Prøveholderen monteres på en stråle måler med en beamline, og holderen sikres korrekt positionering. Afhængigt af goniometer geometrien kan prøveholderen drejes op til 160 ° uden at forårsage nogen shadowing under diffraktions forsøget.
- Brug en papir væge, og Berør forsigtigt den gule polyimid folie fra bagsiden for at fjerne overskydende moder væske. Bemærk venligst, at der på dette stadium ligand iblødsætning eller Cryo-beskyttelse kan udføres lige så godt. Eksemplet er nu klar til centrering og diffraktion dataindsamling.
- Når du bruger en prøveholder med aftagelig ydre ring, skal du anvende et forsigtigt tryk ved at holde fast i den ydre ring og afbryde den ved de angivne brudpunkter (figur 6c). Eksemplet er nu klar til centrering og diffraktion dataindsamling.
6. in situ diffraktion dataindsamling ved kryogen temperatur
Bemærk: det anbefales at fjerne den resterende moder væske fra prøven ved at udføre trinene 4.1.1. til 4.1.3. før du fortsætter med de næste trin for at minimere opløsningsmiddel spredning. De fleste prøver kan overføres til flydende kvælstof uden forudgående kryo-beskyttelse31. Hvis der er behov for kryo beskyttelse, se trin 4.1.1. til 4.1.5.
- Løft forsigtigt COC-folien ved det angivne punkt med en tang, og skræl den af (Se trin 5.1.2) (figur 6a).
- Tag prøveholderen ud af hulrummet og Monter den på en magnetisk prøveholder base. Der kan anvendes et forsigtigt Tryk for at sikre korrekt og stram montering (Se trin 5.1.5, fig. 6b).
Bemærk: de symmetrisk arrangerede brudpunkter gør det muligt at fjerne den ydre ring af prøveholderen ved at anvende et forsigtigt tryk (Se trin 5.1.8., fig. 6c). Nu er prøveholderen klar og kan kastes ud i flydende nitrogen. Prøve indehaverens geometri type 2 og 3 (figur 1b,1c) gør det muligt at overføre dem til prøveglassene i standard rygsøjlen, som kan anvendes til robot assisteret prøvemontering (figur 6d).
Representative Results
Prøveholderen type 1 er konstrueret således, at den passer ind i en brønd af en 24-brønd Linbro stil plade. Hver enkelt prøveholder indeholder positionerings hjælpemidler på begge sider af den ydre rand for at sikre optimal positionering på brøndens rand (figur 1a, figur 2a). Op til tre individuelle krystalliserings dråber af maksimal volumen 2 μl kan hver anbringes på den gule polyimid folie (figur 2b). For eksempel holdere af type 2 og 3 anbefales det at indstille højst to dråber af maksimal volumen 2 μL pr. stk. 24 prøveholdere kan monteres på 1 24-Well Linbro plade (figur 3D).
Et krystalliserings eksperiment på en 24-brønd Linbro-plade med prøveholder type 1 blev oprettet. 1 μl hønseæg-hvid lysozym opløsning (15 mg/ml) blev blandet med 1 μl moder væske bestående af 50 mm naac pH 4,7, 500 mm NaCl og 25% (w/v) pind-6000 på den gule polyimid folie på prøveholderen (tabel 1). Faldet blev ækvilibreret ved 293 K mod 500 μL moder væske og krystaller af størrelse 40-50 μm blev observeret efter 5 timer (figur 4). Krystalvækst kan observeres ved hjælp af et transmissionslys mikroskop (figur 4) med eller uden en polarisator. Film med høj gennemsigtighed sikrer den bedste observation og overvågning af krystal voksende forhold ved hjælp af både et konventionelt lysmikroskop eller et automatiseret krystal billedsystem. Krystalvækst observation ved hjælp af UV-lys blev ikke testet.
Efter fjernelse af moder væsken fra omkring krystallerne blev der udtaget en prøveholder med hønseæg-hvide lysozym-krystaller fra krystalliserings pladen og anbragt i en fugtigheds kontrolleret luftstrøm på HZB-MX beamline 14,332. Diffraktion data blev indsamlet ved omgivelsestemperatur i 1 °-intervaller ved hjælp af en 150 μm stråle ved 13,8 keV energi med 4 x 1010 fotoner/s og en eksponeringstid på 5 s per billede. Et typisk diffraktion billede er vist i figur 5. Ingen forhøjet baggrunds spredning på difbrøk billedet kan detekteres. Yderligere eksperimentelle detaljer samt tilhørende statistik over databehandling er anført i tabel 2.
Figur 1 : Skematisk visning af de nye prøveholdere. Prøve holderne består af en sort plastik støtte, som er dækket på ydersiden med en amorf, cyklisk olefin copolymer (COC) folie. Denne folie (farvet i blåt) er meget transparent og selv-healing. Det sikrer også gastæthed af eksperimentet. Den indvendige folie (farvet i gult) er fremstillet af bio-inert polyimide, som er meget transparent for røntgenstråler. På denne folie, krystalliserings dråber kan placeres. Prøveholderens ydre rand indeholder to positionerings hjælpemidler, der er angivet med den røde pil (panel A), som giver mulighed for nøjagtig anbringelse af prøveholderen på krystalliserings pladens individuelle, forsmurte hulrum. A) prøveholder (type 1) med en diameter på 22 mm med en fast udvendig støttering. B) prøveholder (type 2) med en diameter på 22 mm med aftagelig udvendig støttering. C) prøveholder (type 3) med en diameter på 18 mm med aftagelig udvendig støttering. De sidste to er blevet udviklet til at bruge dem i en høj-gennemløb mode med automatiserede prøve montage robotter ved hjælp af SPINE standard. De angivne brudpunkter fremhæves af de røde pile i panel B. Den sorte pil i panel C angiver positionsmarkøren. De fremspringende stifter ved yder kanten af den gule folie er nødvendige for at justere polyimid folien under produktionsprocessen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Prøveholderen kan anvendes på en 24-brønd plade på samme måde som de almindeligt anvendte mikroskop dæksedler. Det forsegler hulrummet lufttæt. Positions hjælpemidler sikrer korrekt positionering af prøveholderen på hulrummet (røde pile i panel A). Der kan anbringes op til tre individuelle dråber på en type 1-prøveholder (panel B), mens det anbefalede maksimale antal dråber, der er anbragt på en type 2-eller 3-prøveholder, er to. Den maksimale anbefalede mængde for hver dråbe er 2 μL. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : 24 type 1 prøveholdere passer på en 24-brønd plade. Prøve holderne kan anbringes i to retninger på 24-brøndens plade som angivet (panel D). En kanyle anvendes til at gennembore den bageste COC folie for at fjerne overskydende spiritus fra en krystalliserings dråbe (paneler a og C) ved hjælp af en papir væge forsigtigt indsat i samme hul (panel B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Billede af hønseæg-hvide lysozym krystaller observeret gennem en transmission mikroskop udstyret med en polarisator. Individuelle krystaller er let diskrimineret fra udfældede protein opløsning. Krystallerne i dette billede er af en gennemsnitlig størrelse på 40 μm x 50 μm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Et typisk røntgen diffraktions billede af en lysozym krystal, der dyrkes på prøveholderen. Før eksponering for røntgenstråler blev al overskydende moder væske fjernet fra omkring Krystallen. Diffraktion data blev indsamlet ved omgivelsestemperatur på BL 14.3 ved elektron opbevarings ringen BESSY II32 ved hjælp af et fugtigheds kontrolleret prøvemiljø med 97,5% relativ fugtighed. Der kan ikke observeres nogen forhøjet baggrund på grund af prøve holderne. De stiplede linjer i billedet angiver opløsnings ringene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Prøveholderen er forberedt til diffraktion dataindsamling. For det første løftes COC-filmen forsigtigt ved at bruge en tang og derefter skrælles (panel a). Derefter fjernes prøveholderen fra hulrummet og indsættes i det centrale hul på en magnetisk base, indtil den er angivet af mærket (panel B). Ved at holde fast i den midterste del påføres den ydre ring et forsigtigt Tryk for at frigøre den midterste del ved hjælp af de symmetrisk arrangerede brudpunkter (panel C). Efter fjernelsen kan prøveholderen kastes ud i flydende kvælstof og overføres til standard ryg-hætteglas. Placeret, for eksempel, i puck de kan transporteres til Synchrotron steder, hvor automatiserede prøve-montering robotter genkende dem som regelmæssige prøver (panel D). Klik her for at se en større version af dette tal.
| Detaljer om krystallisering | |
| Metode | Hængende dråbe, damp diffusions metode |
| Plade type | SuperClear plader |
| Temperatur (K) | 293 af |
| Protein koncentration (mg mL-1) | 15 |
| Sammensætning af reservoir opløsning | 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25% (w/v) PIND-6000 |
| Mængde og forhold af dråbe | 2 μL i alt, 1:1 ratio (protein: moder væske |
| Reservoirets rumfang | 500 μL |
| Inkubationstid | 12 timer i døgnet |
Tabel 1: eksperimentelle oplysninger om det beskrevne krystalliserings eksperiment.
| Indsamling og behandling af data | |
| Bølgelængde (Å) | 0,89429 af |
| Temperatur (K) | 293 af |
| Detektor | Rayonix MX225 CCD |
| Krystal detektor afstand (mm) | 120 af |
| Rotations område pr. billede (°) | 0,5 af |
| Totalt rotations område (°) | 120 af |
| Eksponeringstid pr. billede (er) | 5 |
| Rumgruppe | P43212 |
| Enheds celle parametre (Å) | a = 79,01, b = 79,01, c = 37,95 |
| Mosacity (°) | 0,07 af |
| Opløsnings område (Å) | 39,50-1,35 (1,37-1,35) |
| Samlet antal refleksioner | 191940 (8932) |
| Antal unikke refleksioner | 27020 (1292) |
| Fuldstændighed (%) | 99,88 (99,20) |
| Mangfoldighed | 7,1 (6,9) |
| Gennemsnit I/σ (I) | 15,0 (1,9) |
| Rmeas35 (%) | 6,3 (107,0) |
| Rpim36 (%) | 2,4 (40,4) |
| CC1/237 | 99,9 (68,5) |
| ISa38 | 16,1 af |
| Wilson B-Factor (Å2) | 17,0 af |
Tabel 2: diffraktion dataindsamling og behandling statistikker.
Discussion
Egnethed til forsøg med krystallisering. De nye prøveholdere kan anvendes til standard forsøg med hængende drop krystallisering ved hjælp af enten 24-Well Linbro type plader (type 1 og 2) eller 24-brønd SBS footprint plader, hvor hver brønd har en diameter på 18 mm (3). De kan bruges i stedet for standard mikroskop dæksedlerne. Den amorfe COC folie sikrer lufttæthed af systemet. Overvågningen af krystalliserings forsøget er mulig ved hjælp af et transmissions-lys mikroskop, på grund af brugen af høj klarhed Foils. Efter vores bedste overbevisning findes der ingen andre prøveholdere til 24-brønd krystalliserings plader, hvilket ville tillade krystal manipulation eller diffraktion eksperimenter uden mekanisk at fjerne Krystallen fra faldet, hvor det dyrkes. Dette er af særlig betydning, da mange forskere på området stadig er afhængige af sådanne plader til krystal optimering, på grund af det faktum, at større drop mængder kan bruges sammenlignet med 96-godt siddende-drop plader. Med disse større drop mængder, kan større krystaller opnås.
Egnethed til krystal manipulation. På grund af de selvhelbredende egenskaber af den ydre COC folie og den mikroporøse struktur af den indre gule polyimid folie, er krystal miljøet tilgængeligt, og krystallerne kan manipuleres uden mekanisk at overføre dem til andre beholdere. Dette gør prøve holderne meget bekvemt. Det eneste andet system, vi kender til, som tillader denne indirekte og blid adgang til Krystallen, er CrystalDirect-systemet26. CrystalDirect er dog mindre fleksibel, da der skal anvendes særlige 96-brønd krystalliserings plader. Folien, hvor krystallerne vokser, er den samme, der forsegler krystalliserings eksperimentet, og det er ikke selv heling. Det betyder, at en blænde, der er blevet gennemboret i folien ved laser ablation for ligand eller Cryo-protectant levering til krystallerne vil forblive åben, hvilket øger chancen for flydende fordampning. Dette er i modsætning til vores design, hvor krystaller ikke vil være direkte udsat for miljøet, selv om COC folie bliver gennemboret et antal gange.
Egnethed til in situ diffraktion eksperimenter ved omgivelsestemperatur. Prøveholderen kan fjernes fra krystalliserings pladen på en lineær måde, fastgjort på en magnetisk base og sat på et beamline goniometer. For en diffraktion eksperiment ved stuetemperatur, er det tilrådeligt at sætte prøven i en luftstrøm af defineret luftfugtighed33. Moder væsken omkring Krystallen kan fjernes, inden prøveholderen sættes på goniometeret for at reducere baggrunds spredningen. En sådan set-up er stabil i timevis.
Det anvendte materiales egnethed til drift og opbevaring ved 100 K. Hverken det materiale, der anvendes til fremstilling af prøveholderen eller polyimid-filmen, påvirkes negativt ved at nedkøle dem til lave temperaturer34. Derfor udgør arbejdet med prøveholderen ved lav temperatur (f. eks. 100 K) ikke et alvorligt problem.
Egnethed til in situ diffraktion eksperimenter ved 100 K. For dataindsamling ved 100 K i en nitrogenstrøm skal prøveholderen fjernes fra krystalliserings pladen som i det foregående afsnit, fastgjort på en magnetisk base og sat i en gasformigt nitrogenstrøm ved 100 K på et beamline goniometer. Hvis det ønskes, kan prøven også være Cryo-beskyttet, selv om det er sandsynligt, at for nøgne prøver dette ikke kan være nødvendigt i de fleste tilfælde31. Til forsøg ved 100 K er prøve holderne type 2 og 3 bedre egnet, fordi den udvendige plastik ring kan fjernes. Derfor, de er af mindre størrelse og bør således være mindre tilbøjelige til at glasur. Dog kan selv en prøve indehaver af type 1 anvendes. Givet en ikke for høj luftfugtighed i den eksperimentelle Hutch og en korrekt justeret kryo-system glasur op af holderen er ikke rigtig et problem.
Begrænsninger. Prøveholderens geometri muliggør uhindret diffraktion dataindsamling ved rotations metoden over et samlet rotations område på 160 °. Dette er tilstrækkeligt, således at komplette diffraktion datasæt kan opnås for de fleste krystal systemer. I tilfælde, hvor dette ikke er muligt, skal data fra mere end krystal samles. Når krystaller dyrkes sammen, kan det være muligt at justere størrelsen af hændelsen røntgenstråle, således at kun dele af de enkelte krystaller er eksponeret. I ekstreme tilfælde kan det være nødvendigt at ty til en dataindsamlings strategi svarende til MeshAndCollect-tilgangen35. Sammenfattende, mens der er visse begrænsninger forbundet med stikprøven indehavere, disse kan overvindes i de fleste tilfælde. Selvfølgelig er det altid muligt, at der opstår situationer, hvor intet af dette er muligt. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at ty til andre krystal monteringsmetoder.
Vi har beskrevet en ny type prøveholder for makromolekylær krystallografi, og vi har påvist egnetheden af prøveholdere til forskellige anvendelser. Under hensyntagen til den enkle og reproducerbare håndtering af protein krystaller, samt de unikke egenskaber af prøveholdere, mener vi, at disse prøve indehavere vil vise sig at være en værdifuld tilføjelse til arsenal af prøveholdere til makromolekylær krystallografi.
Disclosures
Patentansøgninger vedrørende den rapporterede prøve indehaver er blevet indgivet af Helmholtz-Zentrum Berlin med følgende registreringsnumre og registrerings datoer med det tyske patent-og varemærkekontor: DE 10 2018 129 125,6, registreringsdato november 20 th, 2018; DE 10 2018 125 129,7, registreringsdato oktober 11th, 2018; DE 10 2017 129 761,8, registreringsdato December 13th, 2017. En efterfølgende international patentansøgning via PCT rute, ved hjælp af prioriteten af DE 10 2017 129 761,8 er blevet indgivet, PCT/DE2018/101007. En registrering af en brugsmodel med nummeret DE 20 2018 106 955,1 blev indgivet den December 6th, 2018. Prøveholderen er blevet gjort kommercielt tilgængelig under handelsnavne XtalTool og XtalTool/HT af Jena Bioscience, Jena, Tyskland.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke BESSY II, der drives af Helmholtz-Zentrum Berlin for stråle tid adgang og støtte, og afdelingerne af Prøvemiljø og teknisk design for deres hjælp med design og konstruktion og adgang til 3D-printer faciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 - 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 - 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
References
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
- Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
- Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
- Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
- Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
- Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
- Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
- Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
- Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
- Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
- Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
- Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
- Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
- Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
- Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
- Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
- Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
- Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
- McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
- Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).
