Summary
적절한 처리 프로토콜과 함께 거대 분자 X 선 결정학을위한 새로운 샘플 홀더가 제공됩니다. 이 시스템은 결정 조작이나 장착없이 주변 및 극저온 온도모두에서 결정 성장, 크리스탈 흡수 및 비지석 회절 데이터 수집을 허용합니다.
Abstract
거대 분자 X 선 결정학 (MX)은 생물학적 거대 분자의 고해상도 3 차원 지식을 얻는 가장 눈에 띄는 방법입니다. 이 방법의 전제 조건은 고도로 정렬된 결정성 시편을 연구하기 위해 거대 분자로부터 성장해야 하며, 회절 실험을 위해 준비되어야 한다는 것입니다. 이러한 제제 절차는 전형적으로 재배된 용액으로부터 크리스탈을 제거하고, 리간드 용액 또는 저온 보호액에 크리스탈을 담근 다음 실험에 적합한 마운트상에서 결정을 고정시키는 것을 포함한다. 이 절차의 심각한 문제는 거대 분자 결정이 종종 기계적으로 불안정하고 오히려 깨지기 쉽다는 것입니다. 따라서 이러한 깨지기 쉬운 결정의 처리는 구조 결정 시도에서 병목 현상이 쉽게 될 수 있습니다. 이러한 섬세한 결정에 가해지는 모든 기계적 힘은 분자의 규칙적인 포장을 방해할 수 있으며 결정의 회절 력 의 손실로 이어질 수 있습니다. 여기에서는 결정의 처리 단계를 최소화하고 따라서 구조 결정 실험의 성공률을 극대화하기 위해 개발된 새로운 올인원 샘플 홀더를 제시합니다. 샘플 홀더는 일반적으로 사용되는 현미경 커버 슬립을 대체하여 크리스탈 방울의 설정을 지원합니다. 또한, 결정화 공동의 개방없이 결정화 캐비티의 개방없이 리간드 담그기, 저온 보호 및 복잡한 형성과 같은 장소 의 결정 조작을 허용합니다. 마지막으로, 시료 홀더는 주변 및 극저온 모두에서 현장에서 X선 회절 데이터를 수집할 수 있도록 설계되었습니다. 이 샘플 홀더를 사용하면 직접 결정 처리가 더 이상 필요하지 않으므로 결정화에서 회절 데이터 수집에 이르는 과정에서 결정이 손상될 가능성이 상당히 줄어듭니다.
Introduction
생물학적 거대 분자의 3차원 구조에 대한 지식은 모든 기본적인 생물학적, 생화학적 및 생의학 연구에서 중요한 초석을 구성합니다. 이것은 예를 들면 약 발견과 같은 그 같은 연구의 특정 번역 양상까지 확장합니다. 원자 해상도 X 선 결정학에서 이러한 3 차원 정보를 얻기위한 모든 방법 중 가장 강력하고 가장 눈에 띄는 하나는 사용 가능한 모든 구조 정보의 90 %가 X 선에 의해 기여된다는 사실에 의해 입증된다 결정학1. X선 결정학의 주요 전제 조건은 회절 품질의 결정이 회절 실험을 위해 생산되고 준비되어야 한다는 것입니다. 이 단계는 여전히 메서드의 주요 병목 현상 중 하나입니다.
역사적으로, 단백질 결정으로부터의 회절 데이터는 주변 온도에서 수집되었다. 개별 결정은 신중하게 데이터 수집 전에 유리 또는 석영 모세 혈관으로 전달, 모술을 건조하지 않도록 모세 혈관에 첨가하고 모세 혈관을 밀봉했다2,3, 4. 1980 년대 이후, X-방사선의 이온화 특성과 거대 분자 결정의 임박한 방사선 감도로 인해 주변 온도에서의 데이터 수집이 방법에 심각한 제한을 초래한다는 것이 점점 더 명백해졌습니다. 그 결과, 거대 분자 결정을 100K까지 냉각하여 방사선 손상 효과를 완화하고 저온5,6에서회절 데이터를 수집하기 위한 접근법이 개발되었습니다. 저온에서 작업할 때, 모세혈관에 시료를 장착하는 것은 열 전달속도가 낮기 때문에 실용적이지 해졌습니다. 그럼에도 불구하고, 특히 반확산 결정화 실험에서 모세혈관을 사용하기 위한 노력이 계속되고 있으며, 저온 회절작업 7,8,그러나 그에 관계없이 표준이 되었습니다. 거시 분자 결정학에 접근하여 얇은 유선 루프9,10내부에 어머니 주류의 박막에 의해 보유 된 거대 분자 결정을 장착합니다. 이 루프 기반 마운팅에 시간이 지남에 따라 많은 개선(예:리소그래피 루프 및 유사한 구조 11)이 도입되었음에도 불구하고 1990년대 초에 개발된 기본 원칙은 오늘날에도 여전히 사용되고 있습니다. 그것은 안전하게 요즘 거대 분자 결정에 대부분의 회절 데이터 수집이 접근 에 의존 한다는 것을 진술 할 수있다5.
시간이 지남에 따라 루프 기반 장착 방법의 몇 가지 흥미로운 새로운 개발 및 수정이 있었지만 이러한 접근 방식은 지금까지 커뮤니티에서 널리 채택되지 않았습니다. 하나는 낮은 배경 산란12,13,14를달성하기 위해 개발 된 결정의 소위 루프리스 장착이다. 또 다른 하나는 결정성 견본을 감싸고 건조에서 그(것)들을 보호하기 위하여 그래핀 칼집의 사용입니다. 그래 핀은 매우 낮은 X 선 산란 배경(15)때문에 그 점에서 잘 적합한 재료이다.
최근에는 시료 처리량16을 늘리거나 하나 이상의 샘플17을보유할 수 있는 마운트 를 설계하는 것을 목표로 주로 시료 마운트 분야의 개발이 집중되었습니다. 실리콘 프레임에 패턴 멤브레인, 이는 주로 직렬 결정학 의 분야에서 작은 결정의 수백을 보유 할 수있다18,19,20,21,22.
지금까지 논의된 모든 시료 장착 방법은 여전히 어느 정도의 수동 개입이 필요하며, 이는 시료에 기계적 손상을 일으킬 위험이 내재되어 있음을 의미합니다. 따라서, 결정의 회절 데이터가 그들의 성장 환경 내에서 수집 될 수 있도록 샘플 환경을 엔지니어링하여 새로운 접근 방식을 모색하고있다. 이러한 방법 중 하나는 23,24 에서 지칭되며, 이미 전 세계 다양한 싱크로트론 소스에서 다수의 거대 분자 결정학 빔라인에서 구현되고있다25. 그러나, 이 방법의 사용은 결정 판의 기하학적 파라미터및 계측기의 샘플 포인트 주위에 이용 가능한 공간에 의해 제한된다.
그러나 또 다른 방법은 소위 CrystalDirect 시스템26에서실현된다. 여기서, 전체 결정화 방울은 자동으로 수확된다. 결정이 성장된 포일은 레이저를 사용하여 맞춤 절단되고 샘플홀더(27)로직접 사용됩니다.
여기에 설명된 작업에서, 목적은 사용자가 그것을 건드리지 않고 데이터 수집 장치로 성장 챔버에서 결정성 샘플을 이동하고 사용자가 쉽게 샘플을 조작 할 수 있도록 하는 샘플 홀더를 개발하는 것이었습니다. 거대 분자 결정학 분야의 많은 연구원들이 여전히 대규모 선별 캠페인에서 확인된 조건을 수정하여 결정 성장을 최적화하기 위해 24웰 결정화 형식을 사용하고 있기 때문에 새로운 샘플 홀더는 이 형식과 호환됩니다. 이하에서, 새로운 샘플 홀더의 설계에 대해 설명하고, 시립 데이터 수집 및 리간드 담그기시 샘플 홀더의 취급 및 성능을 입증할 것이다. 마지막으로, 이 새로운 샘플 홀더의 적합성과 다양한 작업 단계에 대한 제한 사항에 대해 논의할 것입니다.
Protocol
주의: 이후의 모든 작업의 경우, 샘플 홀더에 오염될 수 있으므로 노란색 폴리이미드 호일을 보호되지 않은 손가락으로 만져서는 안 됩니다. 또한 보호된 집게를 사용하는 것이 좋습니다.
1. 샘플 홀더
- 세 가지 유형의 샘플 홀더 중 하나를 사용합니다.
참고: 새로 개발된 샘플 홀더의 세 가지 버전은 그림1에 나와 있습니다. 그들 모두는 검은 색 플라스틱 지지구조, 외부의 밀폐된 COC 호일, 내부에 미세다공성 구조의 폴리이미드 호일을 포함하고 있습니다. 유형 1 (그림1A)에는고정 된 외부 플라스틱 링이 포함되어 있지만 유형 2 및 3 (그림1B,1C)의경우 외부 링은 자동 샘플 전달 시스템에서 사용하기 위해 지정된 각 중단점에서 기계적으로 끊어질 수 있습니다 (빨간색 참조) 그림 1B의화살표)를 클릭합니다. 샘플 홀더의 설계는 노란색 폴리이미드 호일에 여러 결정화 방울의 설정을 할 수 있습니다. 가시광선에 대한 재료가 매우 투명하기 때문에 결정화 실험의 모니터링을 손상시키지 않습니다. 21 μm 두께의 폴리이미드 호일은 또한 5 μm 기공을 특징으로하며 나중에 담그면 간단한 크리스탈 조작이 가능합니다. X선의 투과는 대분자 결정학에서 일반적으로 사용되는 회절 데이터 수집 에너지에서 1.0에 가깝기 때문에, 회절 실험에서 배경 산란에 대한 호일의 기여도는 무시할 수있는 28이다.
2. 결정화 방울 설정
- 젖은 보풀이 없는 천으로 깨끗하고 먼지가 없는 표면을 만듭니다. 상자에서 샘플 홀더 1개를 꺼내 노란색 호일을 위로 향하게 하여 뒷면 COC 호일의 손상이나 원치 않는 펑크를 피하십시오.
- 일반적으로 사용되는 커버 슬라이드에서 수행되는 것처럼 노란색 호일에 최대 권장 부피 2 μL로 결정화 방울을 설정합니다. 파이펫을 사용하여 호일의 파열이나 피어싱을 피하기 위해 방울을 부드럽게 놓습니다. 타입 1(그림2A)의샘플 홀더에서는 최대 3방울을 배치할 수 있는 반면, 타입 2와 3의 샘플 홀더에서는 2및 3 개의 두 방울이 권장되는 최대값입니다(그림2C).
- 샘플 홀더를 뒤집어 24웰 Linbro 스타일 플레이트의 미리 기름을 바른 캐비티에 놓습니다. 샘플 홀더의 위치 확인 보조장치(그림 1A의빨간색 화살표 참조)를 사용하여 최적의 위치로 안내합니다.
- 원치 않는 증발을 방지하기 위해 샘플 홀더의 올바른위치를 확인하십시오(그림 2A).
3. 결정 성장 관찰
- 편광체 유무에 관계없이 투과광 현미경 아래에 결정화 판을 배치함으로써, 실험의 어떠한 방해 없이 결정 성장을 모니터링한다(도 4).
- SBS 풋프린트 플레이트에 사용하도록 설계된 타입3(그림 1C)의 더 작은 18mm 샘플 홀더를 사용할 때는 SBS 풋프린트 플레이트를 처리할 수 있는 이미징 로봇을 사용하여 보다 자동화된 방식으로 결정 성장을 모니터링합니다.
4. 크리스탈 조작
참고 : 투과 광 현미경으로 모든 후속 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
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저온 보호
- 미세 캐뉼라를 사용하여 외부 COC 호일을 부드럽게 관통합니다. 내부 노란색 호일은 그대로 유지되어 있는지 확인합니다. 펑크는 조작할 드롭 바로 옆에 있어야 합니다(그림3A,3C).
- 좋은 종이 심지를 사용하여 찌른 구멍에 삽입합니다. 조심스럽게 노란색 폴리이미드 호일에 닿을 때까지 심지를 앞으로 밀어 넣습니다. 심지를 천포된 호일과 접촉하십시오. 심지는 모든 여분의 용액을 빨아 것입니다. 완전한 액체 제거에 필요한 시간은 용액의 점도 및 모성주류 조성물에 따라 달라집니다(도 3B).
- 모든 액체가 빨려 나면 종이 심지를 부드럽게 철회하십시오. 그것은 어머니 주류의 제거 후 표시되지 않을 수 있기 때문에, 드롭의 위치를 기억하십시오.
- 표준 파이펫을 사용하여 소량의 저온 보호 용액을 최대로 적용하십시오. 3 μL, 동일한 구멍을 통해 압출 팁(예를 들어, 겔 로딩 팁)을 사용한다. 액체가 분배되면 팁을 철회하십시오. 노란색 호일의 다공성은 호일을 가로 질러 확산을 허용합니다. 결정의 극저온 보호를 달성하는 시간은 고용 된 용액과 그 구성 요소에 따라 크게 다릅니다.
- 자가 치유 COC 호일을 다시 밀봉하려면 보호 된 손가락을 구멍에 약 1 s로 가볍게 놓고 구멍을 가로 질러 밀어 놓습니다. 온도상승과 함께 약간의 압력은 너무 크지 않은 펑크의 재밀봉을 촉진합니다.
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리간드 담그기
참고: 여분의 모성 주류는 리간드를 담그기 전에 제거할 수 있습니다. 이렇게 하려면 4.1.1에서 4.1.3에 설명된 단계를 따르십시오.- 리간드를 반응 튜브에 원하는 농도로 모액에 용해시다.
- 불용성 입자를 제거하기 위해 12,000 x g에서 10 분 동안 용액을 돌이킨다. 필요한 경우 온도 제어 원심분리기를 사용하십시오.
- 최대 볼륨을 부드럽게 배치합니다. 3 μL의 리간드는 긴 압출 피펫 팁을 사용하여 COC 호일과 폴리이미드 필름 사이의 갭에 용액을 함유한다. 팁을 철회합니다.
- 자가 치유 COC 호일을 다시 밀봉하려면 보호 된 손가락을 구멍에 약 1 s로 가볍게 놓고 구멍을 가로 질러 밀어 놓습니다 (4.1.5 참조).
- 멤브레인전반에 걸쳐 확산을 허용하기 위해 얼마 동안 실험을 배양한다. 담가두는 시간은 확산 용액및 그 성분(29)의 점도에 크게 의존한다.
- 4.2.1 ~ 4.2.5 단계를 여러 번 반복하여 다른 리간드를 담그십시오.
5. 주변 온도에서 의 회절 데이터 수집
참고: 용매 산란을 최소화하려면 데이터 수집 전에 과도한 용액을 제거하십시오.
- 사전 설정 된 조건30안정적인 습도 제어 빔 라인 환경을 보장합니다.
- 포셉을 사용하여 지정된 지점에서 투명 COC 호일을 부드럽게 들어 올리고 요구르트 컵에서 뚜껑을 제거하는 것처럼 벗깁니다 (그림 6B).
- 캐비티 홀더를 캐비티에서 부드럽게 들어 올려 미리 준비된 자기 샘플 홀더 베이스에 즉시 삽입합니다. 이 단계에는 접착제가 필요하지않습니다(그림 6B).
- 염기 내의 시료 홀더의 올바른 위치를 보장하기 위해 부드러운 압력을 가합니다.
- 샘플 홀더를 빔라인 고니오미터에 장착하고 홀더의 올바른 위치를 확인합니다. goniometer 지오메트리에 따라 회절 실험 중에 섀도우를 일으키지 않고 샘플 홀더를 최대 160°까지 회전할 수 있습니다.
- 종이 심지를 사용하고 뒷면에서 노란색 폴리이미드 호일을 부드럽게 터치하여 여분의 어머니 주류를 제거합니다. 그 단계에서 리간드 담그기 또는 저온 보호도 수행 될 수 있습니다. 이제 샘플을 중앙 조정 및 회절 데이터 수집을 위한 준비가 되었습니다.
- 탈착식 외부 링이 있는 샘플 홀더를 사용하는 경우, 바깥쪽 링을 잡고 지정된 브레이크포인트에서 분리하여 부드러운 압력을 가합니다(그림 6C). 이제 샘플을 중앙 조정 및 회절 데이터 수집을 위한 준비가 되었습니다.
6. 극저온에서의 회절 데이터 수집
참고 : 4.1.1 단계를 수행하여 샘플에서 잔류 모성 주류를 제거하는 것이 좋습니다. 4.1.3으로 이동합니다. 용매 산란을 최소화하기 위해 다음 단계를 계속하기 전에. 대부분의 시료는 이전의 저온보호(31)없이 액체 질소로 이송될 수 있다. 저온 보호가 필요한 경우 4.1.1 단계를 참조하십시오. 4.1.5로 이동합니다.
- 포셉을 사용하여 지정된 지점에서 COC 호일을 부드럽게 들어 올려 벗겨냅니다(단계 5.1.2 참조)(그림6A).
- 샘플 홀더를 캐비티에서 꺼내 자기 샘플 홀더 베이스에 장착합니다. 정확하고 단단한 피팅을 보장하기 위해 부드러운 압력을 가할 수 있습니다(단계 5.1.5, 도 6B참조).
참고: 대칭으로 배열된 지정된 중단점은 완만한 압력을 가하여 샘플 홀더의 외부 링을 간단하게 제거할 수 있습니다(단계 5.1.8, 그림 6C참조). 이제 샘플 홀더가 준비되었으며 액체 질소로 급락 할 수 있습니다. 샘플 홀더 유형 2 및 3의 형상(그림1B,1C)은로봇 보조 샘플 장착에 사용할 수 있는 표준 SPINE 샘플 바이알로 의 이송을 허용합니다(그림6D).
Representative Results
샘플 홀더 타입 1은 24웰 린브로 스타일 플레이트의 웰에 맞도록 설계되었습니다. 각 개별 샘플 홀더에는 웰의 림에 최적의 위치를 보장하기 위해 외부 림의 양쪽에 위치 보조장치가 포함되어 있습니다(그림1A, 그림 2A). 최대 부피 2 μL의 최대 3개의 개별 결정화 방울을 각각 황색폴리이미드 호일에 놓을 수 있다(도 2B). 유형 2와 3의 샘플 홀더의 경우 각각 최대 부피 2 μL의 최대 2방울을 설정하는 것이 좋습니다. 24개의 샘플 홀더를 하나의 24웰 린브로플레이트(그림 3D)에 장착할 수 있습니다.
샘플 홀더 타입 1을 사용하여 24웰 린브로 플레이트상에서 결정화 실험을 설치하였다. 1 μL의 암탉-흰리소자임 용액(15 mg/mL)을 샘플 홀더 상에서 황색 폴리이미드 호일에 50 mM NaAc pH 4.7, 500 mM NaCl 및 25%(w/v) PEG-6000으로 구성된 모성 주류의 1 μL과 혼합하였다(표 1). 낙하물500 μL에 대하여 293 K에서 평형화되었고, 40-50 μm 크기의 결정체는5시간 후에 관찰되었다(도 4). 편광판유무에 관계없이 투과광현미경(도 4)을 이용하여 결정성장을 관찰할 수 있다. 높은 투명필름은 기존의 광현미경 또는 자동 결정 이미징 시스템을 모두 사용하여 결정 성장 조건을 가장 잘 관찰하고 모니터링합니다. UV-빛을 이용한 결정 성장 관찰은 시험되지 않았다.
결정 주위에서 모성 주류를 제거한 후, 암탉 달걀-흰 리소자임 결정을 가진 샘플 홀더를 결정판으로부터 채취하여 HZB-MX 빔라인14.3 32상에 습도 제어 기류에 두었다. 회절 데이터는 13.8 keV 에너지에서 150 μm 빔과 4 x 1010 광자/s및 이미지당 5초의 노출 시간을 사용하여 1°단위로 주변 온도에서 수집되었습니다. 일반적인 회절 이미지는 그림 5에나와 있습니다. 회절 이미지의 높은 배경 산란을 감지할 수 없습니다. 추가 실험 세부 사항 및 관련 데이터 처리 통계는 표2에 나열되어 있습니다.
그림 1 : 새로운 샘플 홀더의 개략적보기. 샘플 홀더는 비정질 순환 올레핀 공중합체 (COC) 호일로 바깥쪽에 덮여있는 검은 색 플라스틱 지지체로 구성됩니다. 이 호일 (파란색으로 색)은 매우 투명하고 자가 치유됩니다. 또한 실험의 가스 기밀성을 보장합니다. 내부 호일 (노란색으로 색)은 X 선에 대해 매우 투명한 바이오 불활성 폴리 이미드로 만들어집니다. 이 호일에, 결정화 방울을 배치 할 수 있습니다. 샘플 홀더의 외부 림에는 빨간색 화살표(패널 A)로 표시된 두 개의 위치 보조장치가 포함되어 있어 결정화 플레이트의 개별 사전 그리스 캐비티에 샘플 홀더를 정확하게 배치할 수 있습니다. (A) 직경 22mm의 샘플 홀더(유형 1)에 외부 지지 링이 고정되어 있습니다. (B) 시료 홀더 (유형 2) 직경 22mm의 외부 지지 링. (C) 시료 홀더 (유형 3) 직경 18mm의 탈착식 외부 지지 링. 후자의 두 SPINE 표준을 사용 하 여 자동화 된 샘플 장착 로봇높은 처리량 방식으로 그들을 사용 하기 위해 개발 되었습니다. 지정된 중단점은 패널 B의빨간색 화살표로 강조 표시됩니다. 패널 C의 검은색 화살표는 위치 표시를 나타냅니다. 노란색 호일의 외부 둘레에 돌출 핀은 생산 공정 중에 폴리이미드 호일을 정렬하는 데 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 샘플 홀더는 일반적으로 사용되는 현미경 커버 슬립과 동일한 방식으로 24웰 Linbro 플레이트에 사용될 수 있습니다. 캐비티를 밀폐밀봉합니다. 포지셔닝 보조장치는 캐비티(패널 A의 빨간색 화살표)에서 샘플 홀더의 올바른 위치를 보장합니다. 최대 3개의 개별 방울을 타입 1 샘플 홀더(패널 B)에 놓을 수 있는 반면, 2형 또는 3개 시료 홀더에 놓이는 권장 최대 방울 수는 2개입니다. 각 드롭의 최대 권장 볼륨은 2 μL입니다.
그림 3 : 24 타입 1 샘플 홀더는 24 웰 플레이트에 맞습니다. 샘플 홀더는 표시된 대로 24웰 플레이트에 두 방향으로 배치할 수 있습니다(패널 D). 캐뉼라는 결정화 낙하(패널 A 및 C)로부터 과잉 주류를 제거하기 위해 후면 COC 호일을 관통하는 데 사용되며, 동일한 구멍에 부드럽게 삽입된 종이 심지를 사용하여(패널 B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 편광판이 장착된 투과 현미경을 통해 관찰된 암탉 달걀 흰리소자임 결정의 이미지. 개별 결정은 침전된 단백질 용액에서 쉽게 구별됩니다. 이 이미지의 결정은 평균 크기가 40 μm x 50 μm입니다.
그림 5 : 샘플 홀더에서 자란 리소자임 결정의 전형적인 X선 회절 이미지입니다. 엑스레이에 노출되기 전에 모든 과잉 어머니 주류는 결정 주위에서 제거되었다. 회절 데이터는 97.5% 상대 습도의 습도 제어 샘플 환경을 사용하여 전자 저장 링 BESSY II32에서 BL14.3의 주변 온도에서 수집하였다. 샘플 홀더로 인해 상승된 배경을 관찰할 수 없습니다. 이미지의 파선은 해상도 링을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 샘플 홀더는 회절 데이터 수집을 위해 준비됩니다. 먼저, COC 필름은 집게를 사용하여 부드럽게 들어 올린 다음 벗겨냅니다(패널 A). 이어서, 샘플 홀더는 캐비티에서 제거되고 마커(패널 B)에 의해 지시될 때까지 자기 베이스의 중앙 구멍에 삽입된다. 중앙 부분을 유지함으로써, 부드러운 압력은 대칭으로 배열 된 지정된 중단점 (패널 C)를사용하여 중앙 부분을 해제하기 위해 외부 링에 가해된다. 제거 후 샘플 홀더를 액체 질소로 급락시키고 표준 SPINE 바이알로 옮길 수 있습니다. 예를 들어 퍽에 배치하면 자동 샘플 장착 로봇이 일반 샘플(패널 D)으로 인식하는 싱크로트론 사이트로 운반할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 결정화 세부 사항 | |
| 메서드 | 매달려 드롭, 증기 확산 방법 |
| 플레이트 타입 | 슈퍼클리어 플레이트 |
| 온도 (K) | 293 |
| 단백질 농도 (mgmL-1) | 15세 |
| 저수지 용액의 조성 | 50 mM NaAc pH 4.7, 500 mM NaCl, 25 % (v) PEG-6000 |
| 적량 및 낙하율 | 총 2 μL, 1:1 비율 (단백질 : 어머니 주류 |
| 저수지의 부피 | 500 μL |
| 인큐베이션 시간 | 12시간 |
표 1: 기재된 결정화 실험의 실험 세부사항.
| 데이터 수집 및 처리 | |
| 파장 (Å) | 0.89429 |
| 온도 (K) | 293 |
| 탐지기 | 레이오닉스 MX225 CCD |
| 크리스탈 검출기 거리(mm) | 120개 |
| 이미지당 회전 범위(°) | 0.5 |
| 총 회전 범위(°) | 120개 |
| 이미지당 노출 시간(들) | 5개 |
| 공간 그룹 | P43212 |
| 단위 셀 매개 변수 (Å) | a = 79.01, b = 79.01, c = 37.95 |
| 모자이크 (°) | 0.07 |
| 해상도 범위(Å) | 39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35) |
| 총 반사 수 | 191940 (8932) |
| 고유 반사 수 | 27020 (1292) |
| 완전성(%) | 99.88 (99.20) |
| 다양성 | 7.1 (6.9) |
| 평균 I/σ(I) | 15.0 (1.9) |
| R메아스35 (%) | 6.3 (107.0) |
| Rpim36 (%) | 2.4 (40.4) |
| CC1/237 | 99.9 (68.5) |
| 이자38 | 16.1 |
| 윌슨 B-팩터(Å 2) | 17.0 |
표 2: 회절 데이터 수집 및 처리 통계.
Discussion
결정화 실험에 대한 적합성. 새로운 샘플 홀더는 24웰 Linbro 형 플레이트(유형 1 및 2) 또는 각 웰의 직경이 18mm(유형 3)인 24웰 SBS 풋프린트 플레이트를 사용하는 표준 매달려 있는 낙하 결정화 실험에 사용할 수 있습니다. 표준 현미경 커버 슬립 대신 사용할 수 있습니다. 비정질 COC 호일은 시스템의 기밀성을 보장합니다. 결정화 실험의 모니터링은 높은 선명도 의 호일을 사용하기 때문에 투과 광 현미경을 사용하여 가능하다. 우리가 아는 한, 24웰 결정화 플레이트에는 다른 시료 홀더가 존재하지 않으며, 이는 결정 조작 또는 회절 실험을 기계적으로 제거하지 않고, 재배되는 낙하물에서 결정을 제거하지 않고도 허용됩니다. 이것은 특히 중요 한, 현장에서 많은 연구자 여전히 크리스탈 최적화에 대 한 이러한 플레이트에 의존 하기 때문에, 때문에 더 큰 드롭 볼륨 96 잘 앉아 드롭 플레이트에 비해 사용할 수 있습니다. 이러한 더 큰 낙하 부피를 사용하면 더 큰 결정이 얻어질 수 있습니다.
크리스탈 조작에 대한 적합성. 외부 COC 호일의 자가 치유 특성과 내부 노란색 폴리이미드 호일의 미세 다공성 구조로 인해 결정 환경에 접근 할 수 있으며 결정은 기계적으로 다른 용기로 옮기지 않고 조작 할 수 있습니다. 따라서 샘플 홀더가 매우 편리합니다. 우리가 알고있는 유일한 다른 시스템은 크리스탈에 대한 간접적이고 부드러운 액세스를 허용하는CrystalDirect 시스템 26입니다. 그러나 CrystalDirect는 특수 96웰 결정화 플레이트를 사용해야 하기 때문에 유연성이 낮습니다. 결정이 자라는 호일은 결정화 실험을 밀봉하는 것과 동일하며 자가 치유가 아닙니다. 즉, 리간드 또는 극저온 보호제 전달을 위해 레이저 절제에 의해 호일로 관통된 조리개가 열려 있어 액체 증발 가능성이 높아집니다. 이는 COC 호일이 여러 번 관통되더라도 결정이 환경에 직접 노출되지 않는 우리의 디자인과는 대조적입니다.
주변 온도에서의 회절 실험에 대한 적합성. 샘플 홀더는 직선 으로 결정화 플레이트에서 제거 할 수 있습니다, 자기 베이스에 붙어 빔 라인 고니 오미터에 넣어. 실온에서회절 실험의 경우, 샘플을 정의된습도(33)의공기 흐름에 넣는 것이 바람직하다. 결정 주위의 모주류는 배경 산란을 감소시키기 위해 샘플 홀더를 고니오미터상에 놓기 전에 제거될 수 있다. 이러한 설정은 몇 시간 동안 안정적입니다.
100K에서 작동 및 보관에 사용되는 재료의적합성. 시료 홀더의 생산에 사용되는 재료나 폴리이미드 필름은 저온34로냉각하여 부정적인 영향을 받지 않습니다. 따라서 저온(예: 100K)에서 샘플 홀더로 작업하는 것은 심각한 문제를 제기하지 않습니다.
100 K에서 의 회절 실험에 대한 적합성. 질소 스트림에서 100K에서 데이터 수집을 위해 샘플 홀더는 이전 단락에서와 같이 결정화 플레이트에서 제거되어야 하며, 자기 베이스에 붙어 빔라인 고니오미터에서 100K의 기체 질소 스트림에 넣어야 합니다. 원하는 경우, 샘플은 또한 저온 보호 될 수있다, 그것은 벌거 벗은 샘플이 대부분의 경우31필요하지 않을 수 있지만. 100K에서의 실험의 경우 외부 플라스틱 링을 제거할 수 있기 때문에 샘플 홀더 유형 2와 3이 더 적합합니다. 따라서, 그들은 더 작은 크기이며, 따라서 착빙에 덜 수있어야합니다. 그러나, 타입 1의 샘플 홀더도 사용될 수 있다. 실험 오두막에서 너무 높은 습도를 감안할 때 홀더의 제대로 정렬 된 저온 시스템 결빙은 실제로 문제가되지 않습니다.
제한 사항. 샘플 홀더의 형상은 총 회전 범위 160°에 걸쳐 회전 방법으로 방해받지 않는 회절 데이터 수집을 허용합니다. 이는 대부분의 결정 시스템에서 완전한 회절 데이터 세트를 얻을 수 있도록 충분합니다. 이것이 불가능한 경우, 크리스탈 이상의 데이터를 함께 병합해야 합니다. 결정이 함께 성장하면 개별 결정의 일부만 노출되도록 입사형 X선 빔의 크기를 조정할 수 있습니다. 극단적인 경우에는 MeshAndCollect 접근 방식35와유사한 데이터 수집 전략에 의존해야 할 수 있습니다. 요약하면, 샘플 홀더와 관련된 특정 제한 사항이 있지만 대부분의 경우 이러한 제한사항을 극복할 수 있습니다. 물론, 상황이 발생할 수 있습니다, 이 중 어느 것도 가능하지 않습니다. 이러한 경우 다른 크리스탈 장착 방법에 의존해야 할 수도 있습니다.
우리는 거대 분자 결정학을 위한 견본 홀더의 새로운 모형을 기술하고 우리는 각종 응용을 위한 견본 홀더의 적합성을 설명했습니다. 단백질 결정의 간단하고 재현 가능한 취급과 샘플 홀더의 고유한 특성을 고려하여, 우리는 이 샘플 홀더가 거대 분자용 샘플 홀더의 무기고에 귀중한 추가될 것이라고 믿습니다. 결정학.
Disclosures
신고된 샘플 보유자에 관한 특허 출원은 헬름홀츠-젠트럼 베를린에 의해 독일 특허상표청에 다음과 같은 등록 번호와 등록일: DE 10 2018 129 125.6, 등록일 11월 20일 th,2018; DE 10 2018 125 129.7,등록일 10월 11일, 2018; DE 10 2017 129 761.8,등록일 2017년 12월 13일. PCT 경로를 통한 후속 국제 특허 출원은, DE 10 2017 129 761.8의 우선순위를 사용하여 PCT/DE2018/101007출원되었다. 2018년 12월 6일에 DE 20 20 2018 106955.1번호가 있는 실용신실 모델 등록이 접수되었습니다. 샘플 홀더는 예나 바이오 사이언스, 예나, 독일에 의해 무역 이름 XtalTool 및 XtalTool / HT에서 상업적으로 사용할 수 있게되었습니다.
Acknowledgments
저자는 헬름홀츠-젠트럼 베를린이 운영하는 BESSY II와 3D 프린터 시설에 대한 설계 및 시공 에 대한 도움을 준 샘플 환경 및 기술 설계 부서에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 - 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 - 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
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