Summary
En ny prøve holder for makro molekylære X-ray crystallography sammen med en passende håndtering protokollen er presentert. Systemet tillater krystallvekst, krystall soaking og in situ Diffraksjon datainnsamling på begge, ambient og kryogene temperatur uten behov for noen krystall manipulasjon eller montering.
Abstract
Makro molekylære X-ray crystallography (MX) er den mest fremtredende metoden for å oppnå høyoppløselig tredimensjonal kunnskap om biologiske makromolekyler. En forutsetning for metoden er at svært bestilte krystallinsk prøven må dyrkes fra Makromolekyl å bli studert, som deretter må være forberedt på Diffraksjon eksperimentet. Denne forberedelsen prosedyren innebærer vanligvis fjerning av krystall fra løsningen, der den ble dyrket, soaking av krystall i ligand løsning eller protectant løsning og deretter immobilizing krystallen på en montering som passer for eksperimentet. Et alvorlig problem for denne prosedyren er at makro molekylære krystaller er ofte mekanisk ustabil og ganske skjør. Følgelig kan håndteringen av slike skjøre krystaller lett bli en flaskehals i en struktur besluttsomhet forsøk. Enhver mekanisk kraft påføres slike delikate krystaller kan forstyrre den vanlige pakking av molekylene og kan føre til tap av Diffraksjon kraft av krystaller. Her presenterer vi en roman alt-i-ett prøve holderen, som er utviklet for å minimere håndteringen av krystaller og dermed å maksimere suksessen rate av strukturen besluttsomhet eksperimentet. Eksempel holde ren støtter oppsettet av krystall dråper ved å bytte ut de brukte deksel sedlene. Videre tillater det på stedet krystall manipulasjon som ligand soaking, fryse-beskyttelse og kompleks dannelse uten åpning av krystallisering hulrom og uten krystall håndtering. Til slutt er prøve holderen utformet for å muliggjøre innsamling av Diffraksjon-data i både Omgivelses-og kryogene temperatur. Ved å bruke denne prøve holderen, er sjansene for å skade krystallen på vei fra krystallisering til Diffraksjon datainnsamling betraktelig redusert siden direkte krystall håndtering ikke lenger er nødvendig.
Introduction
Kunnskapen om den tredimensjonale strukturen av biologiske makromolekyler utgjør en viktig hjørnestein i alle grunnleggende biologiske, biokjemiske og biomedisinsk forskning. Dette strekker seg til og med visse translational aspekter ved slik forskning, som for eksempel legemiddel funn. Blant alle metoder for å skaffe slike tredimensjonale opplysninger på Atomic oppløsning X-ray crystallography er den mektigste og mest fremtredende en som er dokumentert av det faktum at 90% av all tilgjengelig strukturell informasjon er bidratt med X-ray crystallography1. Den viktigste forutsetningen for røntgen crystallography, som samtidig er dens store begrensning, er at Diffraksjon-krystaller må produseres og forberedes for Diffraksjon eksperimentet. Dette trinnet utgjør fortsatt en av de store flaskehalser i metoden.
Historisk ble Diffraksjon data fra protein krystaller samlet inn ved omgivelsestemperatur. Individuelle krystaller ble omhyggelig overført til glass eller kvarts blodkar før datainnsamlingen, mor brennevin ble tilsatt til blodkar slik at krystallene ikke ville tørke ut og blodkar ble beseglet2,3, firetil. Siden 1980-tallet, ble det mer og mer tydelig at på grunn av ioniserende egenskaper av X-stråling og den forestående stråling følsomheten av makro molekylære krystaller, datainnsamling ved omgivelsestemperatur utgjør alvorlige begrensninger på metoden. Følgelig ble det utviklet tilnærminger for å dempe strålings skadevirkninger ved å kjøle makro molekylære krystaller ned til 100 K og samle Diffraksjon data ved slike lav temperatur5,6. For arbeid ved lave temperaturer, ble monteringen av prøvene i blodkar upraktisk på grunn av den lave hastigheten på varmeoverføringen. Til tross for dette, er det pågående arbeidet med å også bruke blodkar, spesielt fra mot diffusjon krystallisering eksperimenter, for lav temperatur Diffraksjon arbeid7,8, men, uavhengig av det, ble det standard tilnærming i makro molekylære crystallography å montere makro molekylære krystaller holdt av en tynn film av mors brennevin inne i en tynn kablet loop9,10. Selv om en rekke forbedringer (f. eks innføringen av litografiske løkker og lignende strukturer11) har blitt gjort over tid til denne loop-baserte montering, de grunnleggende prinsippene som ble utviklet i begynnelsen av 1990-tallet er fortsatt i bruk i dag. Det kan være trygt uttalt at de fleste Diffraksjon data samlinger på makro molekylære krystaller i dag fortsatt stole på denne tilnærmingen5.
Over tid var det noen interessante nye utbygginger og modifikasjoner av loop-baserte montering metoden, men disse tilnærmingene har så langt ikke vært allment vedtatt i samfunnet. En er den såkalte loop-mindre montering av krystaller, som ble utviklet for å oppnå lavere bakgrunn spredning12,13,14. En annen en er bruken av grafen hylser å vikle krystallinsk prøvene og for å beskytte dem fra å tørke ut. Grafen er et godt egnet materiale i den forbindelse på grunn av sin svært lave røntgen spredning bakgrunn15.
I nyere tid var utviklingen innen prøve monteringer hovedsakelig fokusert på å standardisering festene med sikte på å øke prøve gjennomstrømningen16 eller på å designe mounts, som kan inneholde mer enn ett utvalg17, som for eksempel mønstrede membraner på en silisium ramme, som er i stand til å holde hundrevis av små krystaller hovedsakelig innen seriell crystallography18, 19,20,21,22.
Alle prøven monteringsmetoder diskutert så langt fortsatt krever en viss grad av manuell intervensjon, noe som betyr at det er en iboende fare for å forårsake mekaniske skader på prøven. Derfor er romanen tilnærminger søkes av engineering prøven miljøet slik at Diffraksjon data av krystaller kan samles inn i deres vekst miljø. En slik metode er betegnet in situ eller plate-screening23,24 og det er allerede implementert på en rekke makro molekylære crystallography beamlines på ulike Synchrotron kilder over hele verden25. Imidlertid er bruken av denne metoden begrenset av de geometriske parametrene av krystall platen og plassen som er tilgjengelig rundt prøvepunktet på instrumentet.
Enda en tilnærming er realisert i den såkalte CrystalDirect system26. Her høstes hele krystallisering dråper automatisk. Folier som krystallene er dyrket på, er spesiallaget ved hjelp av en laser og brukes direkte som prøve holderen27.
I arbeidet som er beskrevet her, var målet å utvikle en prøve holderen, som ville tillate en bruker å flytte krystallinsk prøven fra vekst kammeret til datainnsamlingen enheten uten å berøre den og som ville gjøre det mulig for brukeren å manipulere prøven lett. Siden mange forskere innen makro molekylære crystallography er fortsatt bruker 24-brønn krystallisering format for å optimalisere krystallvekst ved å endre forholdene identifisert i store screening kampanjer, ble den nye prøven holderen designet for å være kompatibelt med dette formatet. I det følgende beskrives utformingen av den nye prøve holderen, og håndteringen og ytelsen til prøve holderen for in situ-datainnsamling og ligand soaking vil bli demonstrert. Til slutt vil egnetheten til denne nye prøve holderen samt dens begrensninger for de ulike arbeidstrinnene bli diskutert.
Protocol
Advarsel: for alle etterfølgende arbeid, er det svært viktig at den gule-fargede Polyimide folie ikke må berøres med ubeskyttede fingre, på grunn av mulig forurensninger til prøve holderen. Dessuten er bruken av beskyttede tang sterkt anbefalt.
1. prøve holderen
- Bruk en av de tre typene prøveholderen.
Merk: tre forskjellige versjoner av den nye utviklede prøveholderen er vist i figur 1. Alle av dem inneholder en svart plast støtte struktur, en lufttett COC folie på utsiden og en mikroporøse strukturert Polyimide folie på innsiden. Type 1 (figur 1a) inneholder en fast ytre plast ring, mens for typer 2 og 3 (figur 1B,1C) den ytre ringen kan brytes av mekanisk ved de utpekte respektive Break Points for bruk i automatiserte prøve Overføringssystemer (se rød piler i figur 1B). Utformingen av utvalget holdere gjør at oppsettet av flere krystallisering dråper på den gule Polyimide folie. Det er ikke kompromiss overvåking av krystallisering eksperimentet, som materialet er svært gjennomsiktig for synlig lys. De 21 μm tykke Polyimide folie har også 5 μm porer, som gir enkel krystall manipulasjon ved soaking senere. Siden overføring av røntgenstråler er nær 1,0 ved alle vanlig brukte Diffraksjon datainnsamling energier i makro molekylære crystallography, er bidraget fra folien til bakgrunnen spredning i et Diffraksjon eksperiment ubetydelig28.
2. sette opp krystallisering dråper
- Lag en ren og støvfri overflate med en fuktig, lofri klut. Ta en prøve holderen fra boksen og forsiktig plassere den, gul folie vendt opp, på den rene overflaten for å unngå skade eller uønsket punktering av baksiden COC folie.
- Sett opp krystallisering dråper med et maksimalt anbefalt volum på 2 μL på den gule folien som det ville bli gjort på vanlig brukte dekke lysbilder. Plasser dråpene forsiktig for å unngå brudd eller piercing av folien ved hjelp av en pipette. På en prøve holder av type 1 (figur 2a) opptil tre dråper kan plasseres, mens på prøven holdere av type 2 og 3 2 dråper er anbefalt maksimum (figur 2C).
- Vend prøveholderen over og plasser den på en pre-smurt hulrom i en 24-brønn Linbro stil plate. Bruk posisjonerings hjelpemidlene (se røde piler i figur 1a) på prøveholderen for å veilede den til optimal posisjon.
- Sørg for riktig plassering av prøve holderen for å unngå uønsket fordampning (figur 2a).
3. observere krystallvekst
- Ved å plassere krystallisering plate under en overføring lys mikroskop, med eller uten polarisatorer, overvåke krystallvekst uten forstyrrelse av eksperimentet (Figur 4).
- Når du bruker de mindre 18 mm sample holdere av type 3 (figur 1C), som ble utformet for bruk på SBS fotavtrykk plater, bruke en tenkelig robot som kan håndtere SBS-footprint plater å overvåke krystallveksten i en mer automatisert måte.
4. krystall manipulasjon
Merk: det anbefales å utføre alle etterfølgende trinn under et overførings lys mikroskop.
-
Fryse-beskyttelse
- Forsiktig Pierce den ytre COC folie ved hjelp av en fin kanyle. Sørg for at den indre gule folien forblir urørt. Punktering skal være rett ved siden av dråpe som skal manipuleres (figur 3a,3c).
- Bruk en fin papir Wick og sett den inn i stakk hullet. Trykk forsiktig på Wick forover til den berører den gule Polyimide folien. Hold den Wick i kontakt med den perforerte folien. Den Wick vil suge bort alle overflødig løsning. Den tiden som kreves for fullstendig væske fjerning avhenger av viskositet av løsninger og mors brennevin sammensetning (figur 3b).
- Etter at all væske er sugd bort, trekker du forsiktig ut papiret. Husk plasseringen av drop, siden det ikke kan være synlig etter fjerning av mors brennevin.
- Ta en standard pipette for å påføre et lite volum av protectant løsning, maks. 3 μL, ved hjelp av en ekstrudert spiss (f. eks, et gel lasting spissen) gjennom det samme hullet. Når væsken er utlevert, trekke spissen. Den porøsitet av den gule folien gjør det mulig for diffusjon over folien. Tiden for å oppnå fryse-beskyttelse av krystaller avhenger sterkt av den sysselsatte løsningen og dens komponenter.
- Å forsegle den selvhelbredende COC folie, forsiktig plassere en beskyttet finger på hullet i ca 1 s og skyv den over punktering. Lett trykket i kombinasjon med forhøyet temperatur vil fremme resealing av punktering, som ikke er for store.
-
Ligand soaking
Merk: overflødig mor brennevin kan fjernes før ligand soaking. Hvis du vil gjøre dette, følger du fremgangsmåten som er beskrevet i 4.1.1 til 4.1.3.- Løs opp ligand i mors sprit i ønsket konsentrasjon i et reaksjons rør.
- Spin løsningen i 10 minutter ved 12 000 x g for å fjerne uløselig partikler. Bruk en temperaturstyrt sentrifuge ved behov.
- Plasser forsiktig et volum på maks. 3 μL av ligand som inneholder løsning i gapet mellom COC-folien og den Polyimide filmen ved hjelp av en lang, ekstrudert Pipet spiss. Trekk spissen tilbake.
- Å forsegle den selvhelbredende COC folie, forsiktig plassere en beskyttet finger på hullet i ca 1 s og skyv den over punktering (se også 4.1.5).
- Ruge eksperimentet i noen tid for å muliggjøre diffusjon på tvers av membranen. Den soaking tid avhenger sterkt av viskositet av spre løsning og dets komponenter29.
- Gjenta trinn 4.2.1 for å 4.2.5 flere ganger for å senere suge forskjellige ligander.
5. in situ Diffraksjon datainnsamling ved omgivelsestemperatur
Merk: for å minimere spredning av løsemiddel, Fjern overflødig oppløsning før datainnsamlingen.
- Sikre en stabil fuktighet kontrollert beamline miljø med pre-etablerte forhold30.
- Løft forsiktig den gjennomsiktige COC folien på det angitte punktet ved hjelp av tang og skrelle den av som en ville fjerne lokket fra en yoghurt Cup ( figur 6b).
- Løft prøve holderen forsiktig fra hulrommet og sett den umiddelbart inn i en pre-forberedt magnetisk prøve holderen base. Ingen lim er nødvendig for dette trinnet (figur 6b).
- Påfør forsiktig Trykk for å sikre riktig plassering av prøve holderen i sokkelen.
- Monter prøveholderen på en beamline goniometer og sikre riktig plassering av holderen. Avhengig av goniometer geometri kan prøve holderen roteres med opptil 160 ° uten at det medfører skygge under Diffraksjon eksperimentet.
- Bruk et papir som er Wick og Berør forsiktig den gule Polyimide folien fra baksiden for å fjerne overflødig mors brennevin. Vær oppmerksom på at på dette stadiet ligand soaking eller fryse-beskyttelse kan utføres like bra. Prøven er nå klar for sentrering og Diffraksjon datainnsamling.
- Når du bruker en prøve holderen med avtagbar ytre ring, Påfør forsiktig trykk ved å holde på den ytre ringen og bryte den av på de angitte Break Points (figur 6C). Prøven er nå klar for sentrering og Diffraksjon datainnsamling.
6. in situ Diffraksjon datainnsamling ved kryogene temperatur
Merk: det anbefales å fjerne rester av mor brennevin fra prøven ved å utføre trinnene 4.1.1. til 4.1.3. før du fortsetter med de neste trinnene for å minimere spredning av løsemiddel. De fleste prøvene kan overføres til flytende nitrogen uten tidligere fryse beskyttelse31. Hvis du trenger fryse beskyttelse, se trinn 4.1.1. til 4.1.5.
- Løft COC-folien forsiktig på det angitte punktet ved hjelp av en tang, og Skrell den av (se trinn 5.1.2) (figur 6a).
- Ta prøven holderen av hulrommet og Monter den på en magnetisk prøve holderen base. Lett trykk kan anvendes for å sikre riktig og tettsittende (se trinn 5.1.5, figur 6b).
Merk: symmetrisk arrangert utpekt Break Points tillate enkel fjerning av den ytre ringen av prøven holderen ved å bruke lett trykk (se trinn 5.1.8., figur 6C). Nå er prøve holderen klar og kan bli kastet i flytende nitrogen. Geometrien av prøveholderen typer 2 og 3 (figur 1B,1C) gjør at de kan overføres til standard prøve rad hetteglass, som brukes til robot assistert prøve montering (figur 6D).
Representative Results
Eksempel holde ren type 1 er designet slik at den passer på en brønn av en 24-brønn Linbro stil plate. Hver enkelt prøve holder inneholder posisjonerings hjelpemidler på hver side av ytterkanten for å sikre optimal posisjonering på kanten av brønnen (figur 1a, figur 2a). Opptil tre individuelle krystallisering dråper med maksimalt volum 2 μL hver kan plasseres på den gule Polyimide folie (figur 2b). For eksempel innehavere av type 2 og 3 anbefales det å sette maksimalt to dråper med maksimalt volum 2 μL hver. 24 prøve holdere kan monteres på 1 24-brønn Linbro plate (figur 3D).
En krystallisering eksperiment på en 24-brønn Linbro plate med prøve holderen type 1 ble satt opp. 1 μL av høne egg-hvit lysozyme oppløsning (15 mg/mL) ble blandet med 1 μL av mor-brennevin bestående av 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl og 25% (w/v) PEG-6000 på den gule Polyimide folien på prøve holderen (tabell 1). Drop var equilibrated på 293 K mot 500 μL av mor-sprit og krystaller av størrelsen 40-50 μm ble observert etter 5 timer (Figur 4). Krystallvekst kan observeres ved hjelp av et overførings lys mikroskop (Figur 4) med eller uten en polarisator. Høy åpenhet filmer sikre beste observasjon og overvåking av krystallvekst forhold ved hjelp av begge, en konvensjonell lys mikroskop eller en automatisert krystall Imaging system. Krystallvekst observasjon ved hjelp av UV-lys ble ikke testet.
Etter å ha fjernet moren brennevin fra rundt krystaller, en prøve holderen med høne egg-hvite lysozyme krystaller ble tatt fra krystallisering plate og plassert i en fuktighet-kontrollerte Airstream på HZB-MX beamline 14,332. Diffraksjon data ble samlet inn ved omgivelsestemperatur i 1 °-trinn ved hjelp av en 150 μm stråle på 13,8 keV energi med 4 x 1010 fotoner/s og en eksponeringstid på 5 s per bilde. Et typisk Diffraksjon bilde vises i figur 5. Ingen forhøyet bakgrunns spredning på det Diffraksjon bildet kan oppdages. Videre eksperimentelle detaljer samt tilhørende databehandling statistikk er oppført i tabell 2.
Figur 1 : Skjematisk visning av de nye prøve innehaverne. Utvalgets holdere består av en svart plast støtte, som er dekket på yttersiden med en amorfe syklisk olefin kopolymer (COC) folie. Denne folien (farget i blått) er svært transparent og selvhelbredende. Det sikrer også gasstetthet av eksperimentet. Den indre folie (farget i gult) er laget av bio-inert Polyimide, som er svært transparent for røntgenstråler. På denne folien, kan krystallisering dråper plasseres. Den ytre kanten av prøve holderen inneholder to posisjonerings hjelpemidler indikert av den røde pilen (panel A), som tillater nøyaktig plassering av prøve holderen på den enkelte pre-smurt hulrom av krystallisering plate. (A) prøve holder (type 1) med 22 mm diameter med en fast ekstern støttering. (B) prøve holder (type 2) med 22 mm diameter med flyttbar ekstern støttering. (C) prøveholderen (type 3) med 18 mm diameter med flyttbar ekstern støttering. De to sistnevnte er utviklet for å bruke dem i en høy-gjennomstrømming mote med automatiserte prøve montering roboter bruker RYGGRADEN standard. De angitte pause punktene utheves av de røde pilene i panel B. Den svarte pilen i panel C angir plasserings merket. De utstikkende pinnene på ytterkanten av den gule folien er nødvendige for å justere den Polyimide folien under produksjonsprosessen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempel holde ren kan brukes på en 24-brønn Linbro plate på samme måte som den vanlige mikroskop dekselet slips. Det forsegler hulrommet. Posisjonerings hjelpemidler sikrer riktig plassering av prøveholderen på hulrommet (røde piler i panel A). Opp til tre individuelle dråper kan plasseres på en type 1 prøve holderen (panel B), mens det anbefalte maksimalt antall dråper plassert på en type 2 eller 3 prøve holderen er to. Maksimalt anbefalt volum for hver dråpe er 2 μL. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : 24 type 1 prøve holdere passer på en 24-brønn plate. Eksempel holdere kan plasseres i to retninger på 24-brønn plate som indikert (panel D). En kanyle brukes til å Pierce ryggen COC folie for å fjerne overflødig brennevin fra en krystallisering drop (paneler a og C) ved hjelp av et papir Wick forsiktig inn i samme hull (panel B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bilde av høne egg-hvite lysozyme krystaller observert gjennom en overføring mikroskop utstyrt med en polarisator. Individuelle krystaller er lett diskriminert fra igangsatte protein løsning. Krystallene i dette bildet er av en gjennomsnittlig størrelse på 40 μm x 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Et typisk X-ray-Diffraksjon bilde av en lysozyme krystall som dyrkes på prøve holderen. Før eksponering for røntgenstråler all overflødig mors brennevin ble fjernet fra rundt krystallen. Diffraksjon data ble samlet inn ved omgivelsestemperatur på BL 14.3 ved elektron lagrings ringen BESSY II32 ved bruk av et luft fuktighets styrt prøvemiljø med 97,5% relativ fuktighet. Ingen forhøyet bakgrunn på grunn av prøve holdere kan observeres. De stiplede linjene i bildet angir oppløsnings ringene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Prøve holderen er klargjort for Diffraksjon datainnsamling. Først er COC filmen løftet forsiktig ved hjelp av en tang og deretter skrelles av (panel a). Deretter fjernes prøve holderen fra hulrommet og settes inn i det sentrale hullet av en magnetisk base inntil indikert av markøren (panel B). Ved å holde på den sentrale delen, forsiktig trykk påføres den ytre ringen for å frigjøre den sentrale delen ved hjelp av symmetrisk arrangert utpekt Break Points (panel C). Etter fjerning kan prøve holderen legges i flytende nitrogen og overføres til standard hetteglass med RYGGRAD. Plassert, for eksempel i pucker de kan transporteres til Synchrotron områder der automatiserte prøve-montering roboter gjenkjenne dem som vanlige prøver (panel D). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Krystallisering detaljer | |
| Metoden | Hengende dråpe, damp diffusjon metode |
| Plate type | SuperClear plater |
| Temperatur (K) | 293 for alle |
| Protein konsentrasjon (mg mL-1) | 15 |
| Sammensetning av reservoar løsning | 50 mM NaAc pH 4,7, 500 mM NaCl, 25% (w/v) PEG-6000 |
| Volum og ratio av drop | 2 μL totalt, 1:1 ratio (protein: mors brennevin |
| Volum av reservoaret | 500 μL |
| Inkubasjonstid | 12 timer |
Tabell 1: eksperimentelle detaljer om det beskrevne krystallisering eksperimentet.
| Innsamling og behandling av data | |
| Bølgelengde (å) | 0,89429 for alle |
| Temperatur (K) | 293 for alle |
| Detektor | Rayonix MX225 CCD |
| Avstand for krystall detektor (mm) | 120 for alle |
| Rotasjons område per bilde (°) | 0,5 for alle |
| Totalt rotasjons område (°) | 120 for alle |
| Eksponeringstid per bilde (r) | 5 |
| Områdegruppe | P43212 |
| Enhets celle parametere (å) | a = 79,01, b = 79,01, c = 37,95 |
| Mosacity (°) | 0,07 for alle |
| Oppløsningsområde (å) | 39,50-1,35 (1,37-1,35) |
| Totalt antall refleksjoner | 191940 (8932) |
| Antall unike refleksjoner | 27020 (1292) |
| Fullstendighet (%) | 99,88 (99,20) |
| Mangfold | 7,1 (6,9) |
| Mener jeg/σ (I) | 15,0 (1,9) |
| Rtiltak35 (%) | 6,3 (107,0) |
| Rpim36 (%) | 2,4 (40,4) |
| CC1/2-37 | 99,9 (68,5) |
| ISa38 -er | 16,1 for alle |
| Wilson B-faktor (å2) | 17,0 for alle |
Tabell 2: Diffraksjon datainnsamling og behandlings statistikk.
Discussion
Egnethet for krystallisering eksperimenter. Den nye prøven holdere kan brukes til standard hengende drop krystallisering eksperimenter ved hjelp av enten 24-brønn Linbro type plater (typer 1 og 2), eller 24-godt SBS fotavtrykk plater der hver brønn har en diameter på 18 mm (type 3). De kan brukes i stedet for standard mikroskop cover slips. Amorfe COC-folie sørger for luft tetthets av systemet. Overvåkingen av krystallisering eksperimentet er mulig ved hjelp av en overføring lys mikroskop, på grunn av bruk av høy klarhet folier. Til det beste av vår kunnskap, ingen andre utvalg holdere finnes for 24-brønn krystallisering plater, som ville tillate krystall manipulasjon eller Diffraksjon eksperimenter, uten mekanisk fjerne krystallen fra drop, der det er dyrket. Dette er av særlig betydning, siden mange forskere i feltet fortsatt stole på slike plater for krystall optimalisering, på grunn av det faktum at større drop volumer kan brukes i forhold til 96-velsittende-drop plater. Med disse større drop volumer, kan større krystaller fås.
Egnet for krystall manipulasjon. På grunn av de selvhelbredende egenskapene til den ytre COC-folien og den mikroporøse strukturen til den indre gule Polyimide folien, er krystall miljøet tilgjengelig og krystallene kan manipuleres uten mekanisk overføring til andre beholdere. Dette gjør prøven holdere veldig praktisk. Det eneste andre systemet vi vet om, som gjør dette indirekte og skånsom tilgang til krystallen, er CrystalDirect systemet26. Men CrystalDirect er mindre fleksibel siden spesielle 96-brønn krystallisering plater må brukes. Folien, som krystallene vokser, er det samme som forsegler krystallisering eksperimentet, og det er ikke selvhelbredende. Dette betyr at en blenderåpning som har blitt boret inn i folien med laser ablasjon for ligand eller protectant levering til krystallene, vil forbli åpen, og øke sjansen for flytende fordampning. Dette er i kontrast til vår design, hvor krystaller ikke vil bli direkte eksponert for miljøet selv om COC folie blir gjennomboret en rekke ganger.
Egnethet for in situ Diffraksjon eksperimenter ved omgivelsestemperatur. Prøven holderen kan fjernes fra krystallisering plate i en rett fram måte, fast på en magnetisk base og satt på en beamline goniometer. For en Diffraksjon eksperiment ved romtemperatur, er det tilrådelig å sette prøven inn i en luftstrøm av definert fuktighet33. Moren brennevin rundt krystallen kan fjernes før du setter prøven holderen på goniometer for å redusere bakgrunnen spredning. Et slikt oppsett er stabilt i timevis.
Egnethet av brukt materiale for drift og lagring på 100 K. Verken materialet som brukes til fremstilling av prøve holderen eller den Polyimide filmen påvirkes negativt ved å kjøle dem ned til lave temperaturer34. Derfor er det ikke et alvorlig problem å arbeide med prøve holderen ved lav temperatur (f.eks. 100 K).
Egnethet for in situ Diffraksjon eksperimenter på 100 K. For datainnsamling på 100 K i en nitrogen stream, må prøve holderen fjernes fra krystallisering plate som i forrige avsnitt, stakk på en magnetisk base og satt i en gass nitrogen strøm ved 100 K på en beamline goniometer. Hvis ønskelig, kan prøven også være fryse-beskyttet, selv om det er sannsynlig at for nakne prøver kan dette ikke være nødvendig i de fleste tilfeller31. For eksperimenter på 100 K, er prøve innehaverne type 2 og 3 bedre egnet fordi den ytre plastringen kan fjernes. Derfor er de av mindre størrelse og bør derfor være mindre utsatt for glasur. Men selv en prøve innehaver av type 1 kan brukes. Gitt en ikke altfor høy luftfuktighet i den eksperimentelle bur og en riktig justert fryse systemet glasur opp av holderen er egentlig ikke et problem.
Begrensningene. Eksempel holde ren geometri tillater uhindret Diffraksjon datainnsamling ved rotasjonsmetoden over et totalt rotasjons område på 160 °. Dette er tilstrekkelig slik at komplett Diffraksjon datasett kan fås for de fleste krystall systemer. I tilfeller der dette ikke er mulig, må data fra mer enn krystall flettes sammen. Når krystaller dyrkes sammen, kan det være mulig å justere størrelsen på hendelsen X-ray strålen slik at bare deler av individuelle krystaller er eksponert. I ekstreme tilfeller kan man trenge å ty til en datainnsamlings strategi som ligner på MeshAndCollect tilnærming35. Oppsummert, mens det er visse begrensninger knyttet til utvalget holdere, disse kan overvinnes i de fleste tilfeller. Selvfølgelig er det alltid mulig at situasjoner er oppstått, der ingenting av dette er mulig. I slike tilfeller kan man trenge å ty til andre krystall monteringsmetoder.
Vi har beskrevet en roman type sample holder for makro molekylære crystallography og vi har vist egnetheten av prøven holdere for ulike bruksområder. Tatt i betraktning den enkle og reproduserbar håndtering av protein krystaller, samt de unike egenskapene til prøven holdere, tror vi at disse utvalgene holdere vil vise seg å være et verdifullt tillegg til arsenal av prøven holdere for makro molekylære crystallography.
Disclosures
Patent søknader om den rapporterte prøve holderen er blitt innlevert av Helmholtz-Zentrum Berlin med følgende registreringsnummer og registrerings datoer med det tyske patent-og varemerke kontoret: DE 10 2018 129 125,6, registreringsdato 20 november th, 2018; DE 10 2018 125 129,7, registreringsdato 11 oktoberth, 2018; DE 10 2017 129 761,8, registreringsdato 13 desemberth, 2017. En påfølgende internasjonal patentsøknad via PCT ruten, ved hjelp av prioriteten til DE 10 2017 129 761,8 har blitt arkivert, PCT/DE2018/101007. En registrering av en nytte modell med nummer DE 20 2018 106 955,1 ble arkivert på desember 6th, 2018. Prøve holderen er gjort kommersielt tilgjengelig under handelsnavnene XtalTool og XtalTool/HT av Jena Bioscience, Jena, Tyskland.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke BESSY II, drevet av Helmholtz-Zentrum Berlin for stråle tid tilgang og støtte, og avdelingene for eksempel miljø og teknisk design for deres hjelp med design og konstruksjon og tilgang til 3D-Printer fasiliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 - 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 - 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
References
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
- Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
- Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
- Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
- Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
- Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
- Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
- Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
- Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
- Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
- Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
- Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
- Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
- Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
- Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
- Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
- Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
- Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
- McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
- Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).
