Summary
هنا نقدم بروتوكول لحقن بيض الكريكيت، وهي تقنية التي تعمل كطريقة تأسيسية في العديد من التجارب في الكريكيت، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، تدخل الحمض النووي الريبي والتلاعب الجينومي.
Abstract
تغيير وظيفة الجينات في كائن حي النامية أمر أساسي لأنواع مختلفة من التجارب. في حين تم تطوير أدوات وراثية قوية للغاية في أنظمة النماذج التقليدية، فإنه من الصعب التعامل مع الجينات أو رسول RNA (mRNA) في معظم الكائنات الحية الأخرى. وفي الوقت نفسه، تعتمد النُهج التطورية والمقارنة على استكشاف وظيفة الجينات في العديد من الأنواع المختلفة، مما يستلزم تطوير وتكييف تقنيات التلاعب بالتعبير خارج نطاق الحشرات حالياً. الانواع. يصف هذا البروتوكول طريقة لحقن الكواشف في بيض الكريكيت لاختبار آثار التلاعب معين على التنمية الجنينية أو اليرقات. يتم وصف تعليمات حول كيفية جمع وحقن البيض مع الإبر البكرة. هذه التقنية واضحة نسبيا مرنة ويمكن أن تتكيف مع الحشرات الأخرى. يمكن للمرء جمع وحقن العشرات من البيض في تجربة واحدة، ومعدلات البقاء على قيد الحياة لحقن العازلة فقط تحسين مع الممارسة ويمكن أن تكون عالية كما 80٪. هذه التقنية سوف تدعم عدة أنواع من النهج التجريبية بما في ذلك حقن العوامل الدوائية، في المختبر توج mRNA للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام، RNA المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsRNA) لتحقيق تدخل الحمض النووي الريبي، واستخدام مجمعة بانتظام يُكرّر البَرَدّم القصير المُتداخل (CRISPR) بالتنسيق مع الكواشف المرتبطة بالبروتين 9 (Cas9) المرتبطة بـ CRISPR لتعديل الجينوم، والعناصر القابلة للتبديل لتوليد خطوط جينية عابرة أو مستقرة.
Introduction
القدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني في الكائنات الحية هو الأساس لتصميم أنواع كثيرة من التجارب اختبار السببية الوظيفية. ومن الأهمية بمكان أيضاً بالنسبة للعمل المقارن والتطوري ذي الصلة أن تكون تقنيات التعديل الجينومي وغير الجينومي متاحة في الكائنات الحية خارج النظم التقليدية النموذجية للمختبرات الوراثية الحيوانية (مثل موسوكولوس، ودانيو rerio, Drosophila melanogaster, وCaenorhabditis elegans). سواء كانت الرغبة في فهم التنوع الحي1 أو التزام المرء بمبدأ كروغ، أنه لكل سؤال بيولوجي هناك كائن أكثر ملاءمة لحلها 2،3،والقدرة على تعديل الجينوم أو التأثير على التعبير الجيني ضروري للتصاميم التجريبية الحديثة.
الكريكيت Gryllus bimaculatus هو نظام نموذج الناشئة. تستخدم في القرن الماضي في تجارب علم الأعصاب4، شهد العقدان الماضيان اهتماما تجريبيا متزايدا في الكريكيت ، وخاصة ركزت على تطور وتطور هذا الكائنالحي 5. الكريكيت هو حشرة هيمتابولوس التي تتفرع بشكل خاص إلى الحشرات الهولوميتابولوس مدروسة جيدا، مثل D. melanogaster وTribolium castaneum6. نظرا لموقعها المفيد على شجرة التطور ، والعلماء مهتمون في طرح الأسئلة التجريبية الحديثة والمتطورة في هذه الحشرة ، مما أدى إلى اهتمام متزايد في تكييف الأدوات الجزيئية للاستخدام في G. bimaculatus.
ويمكن استخدام حقن الكواشف الجزيئية في بيض الكريكيت لتجارب التعديل الجينومي وكذلك التلاعب اتلاف التعبير الجيني في الأجنة. على سبيل المثال، تم إنشاء المعدلة وراثيا G. bimaculatus تحمل الإدراج eGFP باستخدام piggyBactransposase7،8. وقد نجح المحققون في إنشاء ضربة قاضية G. bimaculatus باستخدام nucleases الزنك الإصبع (ZFNs) والنسخ المنشط مثل (TAL) تأثير nucleases (TALENs) لإدخال فواصل مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل في مناطق جينية محددة9. على الرغم من أن ZFNs وTALENs تسمح باستهداف مواقع محددة في الحيوانات خارج الأنظمة النموذجية الأربعة الكبيرة، إلا أن هذه الكواشف قد تم تجاوزها بسرعة من خلال نظام CRISPR/Cas9، الذي هو أبسط للاستخدام، وأكثر كفاءة، ومرنة للغاية10. وقد استخدم كريسبر في G. bimaculatus لإنتاج خروج المغلوب11 وكذلك ضرب في خطوط12،13 بالإضافة إلى تعديل الجينوم ، يمكن حقن dsRNA في البيض لهدم التعبير mRNA في تطوير الأجنة، مما يسمح للمحققين لفهم دور نسخ محددة في جميع أنحاء التنمية14،15. وقد نشرت بعض التفاصيل المحدودة حول كيفية حقن بيض الكريكيت سابقا12.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لحقن البيض في وقت مبكر G. bimaculatus. هذا البروتوكول فعال وقابل للتكيف بسهولة مع مختلف البيئات المختبرية، ومواد الحقن، وربما مع الحشرات الأخرى. في حين تم نشر تفاصيل إضافية لتصميم وتنفيذ التعديل الجيني والتجارب ضربة قاضية في مكان آخر12,13, هذه النهج سوف تعتمد في نهاية المطاف على بروتوكول الحقن مفصلة هنا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد الأجهزة وإعداد المواد
ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول 1 وجدول المواد لإعداد الحلول والكاشف وتفاصيل المعدات.
- إعداد مجهر تشريح من أجل رؤية البيض وتوجيه إبرة الحقن. (الشكل1A يظهر مجهر تشريح مجهزة الفلورة.) القدرة على الفلورة مفيدة ولكنليس ضرورية.
- وضع 3 محور micromanipulator للمناورة إبرة الحقن في مكان (الشكل1A).
- إعداد محقن صغير مع الأنابيب وحامل إبرة لحقن كميات صغيرة من المواد (الشكل1A). اختياريا استخدام دواسة القدم التي لا تظهر في الشكل.
- تصميم وإنشاء ختم لإنشاء آبار للبيض (الشكل1C)عن طريق طباعة معكوس النمط المطلوب، إما مع طابعة 3D أو حفارة ليزر.
ملاحظة: الطابع المطبوع ثلاثي الأبعاد هو 4.5 سم × 5 سم مع 128، 3 سم × 1 سم × 1 مم نتوءات لإنشاء آبار فردية. وقد نشرت تفاصيل حول كيفية جعل مجموعة متنوعة من قوالب للتخصيص في مكان آخر16. - إعداد 10X حقن العازلة، HEPES المخزنة المالحة (HBS)، ومحلول مخزون من صبغ ة تيتراميثيلرودامين Dextran وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- إعداد الحلول التجريبية ليتم حقنها، مثل dsRNA، CRISPR / Cas912، عناصر قابلة للنقل، في المختبر توج mRNA7،8، وكلاء الدوائية17، ZFNs ، أو TALENS9.
- وضع الشريط المزدوج عصا على عدة طبقات من شريط المختبر القياسية على شريحة المجهر الزجاجي من أجل إنشاء منصة 1 ملم أو نحو ذلك فوق الشريحة الزجاجية، والتي سيتم استخدامها لعقد الإبر للتقييم.
- إعداد حاوية الكريكيت ما يقرب من 40 سم × 60 سم في الحجم مع غطاء تمتلك فتحة شبكة مغطاة لدوران الهواء.
- إضافة المواد الغذائية والمياه والمأوى.
- إضافة عدة عشرات من صحة الذكور والإناث الكريكيت الكبار. تحديد الكريكيت الكبار من خلال وجود أجنحة.
ملاحظة: قد تزيد مجموعة من الأعمار ما بعد التخيلي من غلة البيض. وينبغي أن تكون كثافة الصراصير عالية نسبيا من أجل أن تكون قادرة على جمع ما يكفي من البيض لتجربة، ولكن ليس مزدحمة بحيث يحدث أكل لحوم البشر. على سبيل المثال، حوالي عشرين لعبة الكريكيت صحية، مع نسبة متساوية تقريبا من الذكور إلى الإناث، في حاوية من الحجم المذكور أعلاه ينبغي أن تكون كافية لجمع حوالي 200 بيضة في فترة 1-2 ساعة. يمكن الاحتفاظ بالصراصير في درجة حرارة الغرفة، ولكن التطوير والسلوك سيكونان مثاليين إذا تم الحفاظ على الصراصير في حاضنة رطوبة دافئة (23.5-26 درجة مئوية)، رطبة (40-60٪ رطوبة نسبية).
2. صنع الإبر للحقن
- استخدام الشعيرات الدموية الزجاج البورسليكات مع خيوط (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل الحجم). إعداد إبر السحب في نفس اليوم، أو ما يصل إلى بضعة أيام قبل الانتهاء من الحقن.
- وضع الزجاج الشعرية في الساحبة، ومركز الزجاج على خيوط، وتشديد المقابض لتأمين الزجاج في المكان.
- تعيين درجة حرارة الساحبة بالقرب من درجة حرارة منحدر الزجاج (-5 درجة مئوية إلى +10 درجة مئوية).
- استخدام خطوة واحدة، بروتوكول عالية الحرارة لسحب تفتق طويلة مع فتحة صغيرة ولكن تجنب ذوبان نهايات مغلقة.
ملاحظة: على سبيل المثال، عند استخدام سحب micropipette مفصلة في جدول المواد المجهزة بخيوط مربع، استخدم المعلمات التالية للزجاج مع درجة حرارة منحدر من 478: الحرارة 478؛ سحب 45; Vel 75; ديل 120 وينبغي أن يحدد كل مستخدم الظروف المثلى لإنتاج إبرة مع الشكل المبين في الشكل 2B. - نصائح إبرة شطبة في التحضير للحقن.
- الرطب الطائرة طاحونة الغزل من beveler (الشكل2A)مع الماء نازف. استخدم إما التناضح العكسي (RO) أو ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) المعالجة بالماء المقطر.
- ضع الإبرة المسحوبة في البفيلر وأنتقل إلى زاوية 20 درجة.
- خفض الإبرة حتى انها مجرد اللمسات على طائرة طحن وشطبة لمدة 2-3 دقائق.
- تقييم شطبة عن طريق وضع إبرة مشطوف على الشريط المزدوج العصا التي تم الالتزام بها إلى شريحة المجهر الزجاجي.
- وضع الشريحة عقد الإبرة على خشبة المسرح من المجهر مركب مجهزة كاميرا وصورة الحصول على البرمجيات.
- الحصول على صورة من طرف إبرة باستخدام هدف 20X.
- استخدام برنامج التصوير لقياس قطر التجويف الداخلية من الإبرة فقط قريب من فتح مجدول (الشكل2C). الحجم الأمثل هو 10 ميكرومتر + 2 ميكرومتر.
- تجاهل الإبر التي تحتوي على فتحة أقل من 8 ميكرومتر وأكثر من 12 ميكرومتر.
- تخزين الإبر في حاوية مع غطاء لتجنب الحصول على مغبرة. استخدام شريط من الشمع أو مواد مماثلة لرفع الإبر من الجزء السفلي من الحاوية لمنع كسر النصائح (الشكل2D).
3. جمع البيض وإعداده
- تعظيم عدد البيض وضعت عن طريق حرمان الصراصير من أي مواد زرع رطبة (قارورة المياه، أطباق البيض) بين عشية وضحاها أو لمدة 8-10 ساعة على الأقل قبل محاولة جمع البيض.
ملاحظة: وبما أن الإناث لديهن القدرة على تخزين الحيوانات المنوية داخلياً، فقد يكون من الضروري إجراء ً او توقيتمختلف إذا كان الإخصاب في الوقت المناسب ضروريًا تجريبيًا18. - جعل 40 مل من 1٪ أغاروز في الماء وتصب في طبق بيتري 10 سم.
- وضع ختم البيض جيدا على سطح أجاروز قبل أن يترسخ.
- إزالة الطابع، بمجرد أن يتم تقوية أغاروز، للكشف عن الآبار (الشكل1C).
- ملء لوحة الأوجاروز جيدا مع HBS التي تحتوي على 1٪ البنسلين / العقديات.
- ضع الغطاء على الطبق، ولف في بارافيلم وتخزينه او تخزينه عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق لبضعة أيام عند درجة حرارة 4 درجة مئوية ولكن يجب تسخينها حتى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها لتجنب التكثيف. - جعل طبق جمع البيض للصراصير لوضع البيض في عن طريق ملء طبق بيتري 35 ملم مع الرمال ملعب أبيض (الشكل1B).
ملاحظة: والمساحة المحددة في جدول المواد هي من حجم الحبوب المناسب. إذا كانت الحبوب والحبوب والحبوب كبيرة جدا، فإن الجبن يضر البيض. - يُغطّى طبق البيض بمربع من المنشفة الورقية المقطّع إلى حوالي 18 سم × 18 سم، ويُوضع على الجزء العلوي من الطبق مع الأنفيل. من خلال هذه المنشفة الورقية تغطية طبق مليئة مع مياه الصنبور.
- إمالة طبق بيتري وضغط بلطف الجزء العلوي لإزالة المياه الزائدة.
- الثنية زوايا مربع منشفة ورقية تحت الطبق ووضع طبق البيض في غطاء مقلوب، والتي سوف تساعد على الحفاظ على غطاء منشفة ورقية في مكانها.
- وضع طبق البيض في سلة الكريكيت والسماح للإناث البالغات بيض oviposit لمدة 1-2 ح.
ملاحظة: الوقت القصير نسبيا هنا يضمن أن جميع البيض سوف تكون مماثلة في مرحلة التنمية في وقت الحقن. إذا كان الحقن قبل الخلوية مهم، يجب أن تحدث الحقن في غضون 14 ساعة من وضع البيض19. - وفي الوقت نفسه، اسمح واجاروز طبق (من الخطوة 3.6) لتدفئة إلى درجة حرارة الغرفة استعدادا لعقد البيض للحقن.
- إزالة طبق جمع البيض، التي تحتوي الآن على البيض وضعت حديثا، من سلة الكريكيت، وإزالة غطاء منشفة ورقية. وضع مصفاة بحجم مسام من 0.5-1 مم على كوب لا يقل عن 500 مل (الشكل1B).
- شطف محتويات طبق وضع البيض (والأخضر والبيض) في مصفاة تحت مياه الصنبور تشغيل بلطف السماح للحبوب والمياه من خلال قشرة تقع من خلال شبكة مصفاة في الماء في الكأس أدناه ولكن ترك بيض الكريكيت في سلة مصفاة.
- ملء وعاء مع ماء ريال عماني ووضعها في صينية. عكس مصفاة فوق الحاوية والاستفادة من ذلك ضد الطبق لطرد البيض في الماء. سوف تغرق البيض إلى الجزء السفلي من الحاوية.
- قطع غيض قبالة طرف ماصة P1000 مع مقص لجعل فتح ما يقرب من 3 ملم في القطر. ضع هذا الطرف على أنبوب P1000 واستخدمه لنقل البيض من الحاوية إلى طبق قالب بيض ة أغاروز، ونقل أقل قدر ممكن من الماء.
- استخدام ملاقط بلاستيكية لاصطفا البيض في آبار أجاروز مليئة HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات. كل بيضة سوف تغرق في الجزء السفلي من بئر الفردية. يُغطّى المزيج بغطاء طبق بيتري حتى يصبح جاهزاً للحقن.
4. إعداد الحاقن الصغير
- إرفاق الحاقن الصغير بالهواء المضغوط أو مصدر الغاز (تم تحسين هذا البروتوكولباستخدام الهواء المضغوط أو N 2).
ملاحظة: إذا كنت تستخدم خزان هواء محمول، قم بتعبئة ما لا يقل عن 75 رطل لكل بوصة مربعة. سوف تفقد الدبابة ضغط الهواء في جميع أنحاء الحقن، وقد تحتاج إلى إعادة تعبئتها. حقن تصبح صعبة أقل من 40psi. - قم بتشغيل الحاقن الدقيق. تعيين وقت الحقن إلى 0.17 s والضغط إلى 10-15 رطل لكل بوصة مربعة.
ملاحظة: الضغط الدقيق المطلوب سوف يعتمد على فتح الإبرة ويجب تحديدتجريبيا لكل جولة من الحقن و / أو إبرة جديدة تستخدم. - تأكد من أن مقبض التوازن من الحاقن الصغير يتم تحويلها إلى 0 (عادة عكس اتجاه عقارب الساعة تماما) وأن يتم الضغط على الحاقن الصغير وفي وضع الحقن.
5. الحقن
- تصفية حوالي 500 درجة مئوية من 10X حقن العازلة باستخدام حقنة 1 مل وفلتر حقنة 0.45 م.
- الكواشف حقن مزيج (التفاصيل التالية هي لحقن dsRNA أعدت كما هو موضح في12).
ملاحظة: قد يكون من المستحسن تصميم وتنفيذ العديد من الضوابط، وخاصة عندما يكون المرء هو أول تعلم هذه التقنية. بدس البيض دون حقن، حقن العازلة + صبغ وحدها، أو حقن العازلة + صبغ + كاشف التحكم (مثل eGFP dsRNA) كلها اختبارات جيدة لكيفية العناصر المختلفة التخريبية من بروتوكول الحقن قد يكون. انظر الشكل 3 للاطلاع على إمكانية بقاء عدد من عناصر التحكم المختلفة. - تبدأ مع 4 مل dsRNA aliquot.
- إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت حقن 10x تمت تصفيتها إلى aliquot dsRNA.
- إضافة 0.5 مل من 50 ملغ / مل تيتراميثيل رودامين Dextran صبغ الأوراق المالية الحل. إذا كان العمل على نطاق تشريح دون الفلورة، واستخدام الفينول الأحمر بدلا من ذلك.
- الحفاظ على جميع المواد على الجليد لمدة فترة الحقن.
- تحميل حل الحقن في إبرة حقن باستخدام نصائح التحميل 20 مل وpipet p10.
- وضع حل حقن 1.5 مل وإدراج طرف التحميل في نهاية واسعة من إبرة الحقن.
- إخراج الحل بقدر ما أسفل في الإبرة ممكن والقضاء على فقاعات الهواء عن طريق النقر بلطف. يجب الحرص على عدم كسر الإبرة.
- ضع طبق البيض تحت المجهر تشريح وحدد التكبير منخفضة من حوالي 10X (1X التكبير ينظر إليها من خلال أهداف العين 10X).
- إدراج الإبرة في السكن حقن وتشديد.
ملاحظة: الحرص على أن يتم إدراج الإبرة بشكل صحيح وبحزم في السكن. للقيام بذلك، وسحب نهاية واسعة من الإبرة مرة أخرى من السكن المعدني، وجلب أنابيب السيليكون في السكن معها. ضبط أنابيب السيليكون بحيث نهاية الزجاج من الإبرة تبرز فقط خارج السيليكون. إذا لم يتم ذلك، قد تحصل على انسداد أنابيب السيليكون بين الزجاج والمساكن المعدنية، وعرقلة نهاية الإبرة. - إدراج بعناية السكن حقن مع إبرة تعلق في micromanipulator. كن على بينة من نهاية حادة من الإبرة وكن حذرا من أنه لا صدم في الأسطح وكسر.
- أثناء النظر إلى كل من البيض والإبرة من خلال المجهر، حرك الإبرة بالقرب من البيض في الزاوية اليسرى العليا من شبكة الطبق.
- خفض الإبرة حتى يدخل طرف HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقدية المخزنة في الطبق.
- مركز الإبرة في مجال الرؤية ونقل طبق البيض بحيث الإبرة هي بضعة ملم أقرب إلى حافة الطبق من البيض.
- لا تعيق عرض شبكة البيض مع الإبرة.
- تعيين المجهر إلى مرشح مناسب لRhodamine لذلك فمن الممكن لمراقبة الفلورة في الإبرة والتركيز على غيض من الإبرة.
- على الحاقن الدقيق، تتحول ببطء مقبض التوازن في اتجاه عقارب الساعة حتى يبدأ حل الحقن لتسرب من الإبرة في حل التعليق. وسيبدأ عدد الرصيد على شاشة الحاقن الصغير في الزيادة، على الرغم من أن القيمة العددية ليست مهمة. بعد ذلك، بدوره مقبض الباب مرة أخرى عكس اتجاه عقارب الساعة قليلا فقط حتى تتوقف صبغ تسرب من الإبرة.
ملاحظة: من المهم تعيين هذا التوازن في كل مرة يتم فيها استخدام إبرة جديدة. دون تعيين التوازن بشكل مناسب، وسوف يستمر الحقن الدقيق لحقن لبعض الوقت بعد تشغيل الحقن. فمن الممكن حتى أن دفعة واحدة من زر الحقن مع إبرة غير متوازنة سيؤدي إلى طرد محتويات كامل من إبرة محملة. - مع الإبرة المتمركزة في مجال الرؤية ، حرك طبق البيض بحيث تهدف الإبرة إلى حقن البويضة أولاً. من المستحسن أن تبدأ الحقن في زاوية واحدة من شبكة من البيض مرتبة، على سبيل المثال، الزاوية اليسرى العليا.
- ضبط التكبير إلى حوالي 50x; في هذا التكبير، بيضة واحدة سوف تملأ معظم مجال الرؤية.
- استخدام كل من micromanipulator واليد واحد على طبق البيض لنقل الإبرة في موقف للحقن.
- تقدم الإبرة باستخدام micromanipulator وإدراج غيض من الإبرة في البويضة الأولى ليتم حقنها.
- أدخل الإبرة على طول بيضة 20-30٪ من الطرف الخلفي (البلحدة) من البويضة (الشكل1E)،عمودي على المحور الطويل للبيضة.
- حقن الحل إما مع دواسة القدم حقن أو زر الحقن على الحاقن الصغير. وسوف يشير بولوس صغير من المواد الفلورية داخل البيضة إلى حقن ناجحة (الشكل1D).
ملاحظة: ليس من غير المألوف أن يتم إخراج بعض صفار البيض من البويضة أثناء الحقن (الشكل1F)،وهذا لا يشير بالضرورة إلى أن البويضة المحقونة ستكون غير قابلة للحياة. - سحب الإبرة من البيض. إذا تم رفع البويضة عن غير قصد من بئرها عند سحب الإبرة، استخدم ملقط صغيرة لدفع البويضة مرة أخرى إلى بئرها مع سحب الإبرة.
- إذا كانت الإبرة تسد أثناء الحقن، وإزالة الإبرة من البيض، والحفاظ على الإبرة المغمورة في HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات الحل الذي يغطي البيض، مسح الإبرة المسدودة باستخدام إما وظيفة واضحة أو عن طريق دفع الحقن زر.
- الاستمرار في استخدام نفس الإبرة، كرر إجراء الحقن لأكبر عدد ممكن من البيض. في البداية، قد يكون هذا فقط حوالي 20 أو 30 بيضة ولكن سوف تزيد إلى أكثر من 100 مع الممارسة.
- إذا انسدادت الإبرة ولا يمكن إزالتها، تخلص من الإبرة، وملأ إبرة جديدة والبدء من جديد (أي العودة إلى الخطوة 5.7).
- تخزين طبق من البيض عن طريق الحقن في حاضنة دافئة (23.5-26 درجة مئوية) التي هي رطبة قليلا (للحد من التبخر) حتى تصل الأجنة إلى المرحلة المرجوة من التنمية للتحليل.
- على الأقل كل 24 ساعة، وإزالة البيض التي لم تعد قابلة للحياة (الشكل3A،B)، واستبدال الحل تعليق مع HBS الطازجة بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات.
- بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحقن، نقل البيض عن طريق الأنابيب لطيف أو مع ملقط البلاستيك إلى المناشف الورقية مبللة مع HBS بالإضافة إلى 1٪ البنسلين / العقديات في طبق بيتري مغطى لمواصلة التنمية في الحاضنة الدافئة والرطبة.
- مراقبة البيض، وإزالة البيض التي لم تعد قابلة للحياة كل يوم (الشكل3A،B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الصراصير بسهولة وضع البيض في المواد الرطبة، وتوفير المواد الكافية، مثل الرمال الرطبة أو الأوساخ، يدفعهم إلى وضع عدد كبير من البيض. وهذا فعال بشكل خاص إذا تم حرمان الكريكيت أولا من المواد زرع البيض لمدة 8-10 ح. البيض وضعت في وسادة نظيفة يمكن فصلها بسهولة، وجمعها (الشكل1B)ووضعها في آبار البيض مصممة خصيصا للحقن (الشكل1C). يمكن استخدام مجهر تشريح، وحقن دقيق، وmicromanipulator (الشكل1A)لحقن البيض الفردية مع مجموعة متنوعة من المواد (الشكل1D). يتم حقن البيض بالقرب من الطرف الخلفي، عند نقطة حوالي 20-30٪ على طول المحور الأمامي الخلفي (الشكل1E). التمييز بين نهاية أمامية أكثر وضوحا من نهاية الخلفية أكثر حادة يمكن أن يكون صعبا، وهذه الاختلافات غالبا ما تكون خفية (الشكل1E). المتداول بيضة من جانب إلى آخر غالبا ما يساعد على الكشف عن أي نهاية هو الذي. بعد إزالة إبرة الحقن ، يتم طرد صفار البيض في بعض الأحيان (الشكل 1F) ، على الرغم من أن هذا لا يبدو أنه يعرض صحة الجنين النامي في الداخل للخطر.
واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو إعداد الإبر المنفسيد. بعد سحب الإبر الطويلة النحيلة يجب أن تكون مُحببة إلى زاوية 20 درجة وأن يكون قطرها 10 درجة مئوية (± 2 ميكرومتر). إذا كان القطر كبير جدا، فإن حل الحقن تسرب من الإبرة، وهذه الإبر سوف تخلق ثقوب كبيرة في البيض، وانخفاض معدلات البقاء على قيد الحياة. الإبر أضيق زيادة البقاء على قيد الحياة، ولكن إذا كانت ضيقة جدا، فإنها تميل إلى تسد بسهولة، مما يجعل الحقن بطيئة ومحبطة. مع قطر إبرة من 10 ميكرومتر ± 2 ميكرومتر، فمن الممكن لحقن ما يصل إلى 100 بيضة مع إبرة واحدة دون وجود انسداد إبرة.
يمكن أن تكون ملحمّسة الإبر مع طاحونة صغيرة أو beveller (الشكل2A). ويمكن الحصول على هذه القطع من المعدات مع المجهر المرفقة، أو يمكن للمرء أن يضيف نطاق تشريح على موقف مستقل للنماذج التي لا تشمل المجهر. يحمل المتلاعب الصغير الإبرة، والتي يمكن إمالةإلى الزاوية المطلوبة وتخفض إلى سطح طائرة طحن دوارة، والتي يتم ترطيبها بالماء نازف. ويمكن رؤية مثال على إبرة سحبت، ولكن غير مفلع في الشكل 2B، وتظهر إبرة مع شطبة 20 درجة في الشكل 2C. ثم يجب تخزين الإبر بأمان لتجنب الضرر والحفاظ على نظافة (الشكل2D).
وضع التوازن وضغط الحقن بشكل مناسب على الحاقن الصغير ينبغي أن يسمح للمرء لحقن كمية مماثلة من المواد في كل بيضة حقن مع نفس الإبرة. سيكون من الضروري تحسين ضغط الحقن والتوازن عند تغيير إلى إبرة ذات قطر مختلف. هذا التحسين سوف تعظيم اتساق نبضات الحقن.
ومعدل البقاء على قيد الحياة هو أحد البارامترات الهامة لتقييم نجاح هذه التجارب. يمكن بسهولة التعرف على معظم البيض الميت عن طريق البصر على النحو التالي: صفار البيض والأنسجة الجنينية داخل البويضة تبدأ في تكتل متفاوتة (الشكل3A)وفي نهاية المطاف معظم صفار سوف تهاجر إلى جانب واحد من البويضة (الشكل3B). عند التقييم بعد 4-6 أيام (ما يعادل المراحل 8-15)19، نجا أكثر من 85٪ من البيض غير المحقون في حين أن البيض الذي يتم حقنه بالكواشف التجريبية كان معدل البقاء على قيد الحياة بشكل عام أقل (الشكل3C). السيطرة على جميع جوانب الحقن نفسها، بما في ذلك ثقب إبرة، وإدخال صبغ والعازلة، أو وجود السيارة أو dsRNA، مطلوب من أجل فهم الآثار الحقيقية للتلاعب التجريبي ة محاولة(الشكل 3C.اعتمادا على التلاعب التجريبي، قد يكون من المتوقع مستوى أعلى من الفتك، وقد يحتاج المرء إلى تغيير توقيت الاختبار أو توقيت الحقن من أجل تقييم أي آثار غير مميتة للتلاعب.
الطريقة التي يقيم بها المرء نتائج الحقن الفينوتيبيك تعتمد على ما تم حقنه. على سبيل المثال، قد تكون التغيرات الفينوتية نتيجة لضربات نهاية القرن ية محددة واضحة على مستوى التشريح الإجمالي. على سبيل المثال، يقوم محسن الجين للقشرة (E(z))عادة ً بقمع جينات الهوك بما في ذلك Ultrabithorax (Ubx). حقن dsRNA لE(z) يطرق أسفل وظيفة E(z) والنشرات قمع Ubx، مما أدى إلى التعبير Ubx خارج الرحم. وهذا يؤدي إلى تحويل خمسة أزواج من الزوائد البطنية (الهوائي، والفكين، وlabium، T1 و T2 الساق) إلى الزوائد T3 الساق مثل، وذلك بسبب derepression من Ubx في تلك الأجزاء20. وفي مثال ثان، من الممكن استخدام تعبير GFP لـ "اختبار الإدراج الناجح للجين. على سبيل المثال، عندما تم إدراج cDNA ترميز eGFP الموسومة الهيستون 2B الجينات تحت سيطرة G. bimaculatus Actin المروج في جينوم الكريكيت باستخدام piggyBac transposase، أصبح من الممكن لتصور كل نواة في البيض باستخدام الفلورة لإثارة البروتين His2B الموسومة eGFP (الشكل4C،D). في هذه الحالة ، كان من الممكن رصد حركة النوى مع مرور الوقت7.
| اسم الحل | مكونات | التعليقات/الوصف |
| 10X حقن العازلة الحل | في 1 L H2O إضافة: 0.8 غرام NaCl، 0.09 غرام Na2HPO4،0.04 غرام KH2PO4،2.98 غرام كيلو كل | تخزين المخزون عند درجة حرارة 4 درجة مئوية. تصفية كمية صغيرة مباشرة قبل الاستخدام مع حقنة 1 مل مجهزة بفلتر حقنة 0.45 م. كرر حسب الحاجة لتصفية ما يقرب من 500 درجة مئوية من محلول الحقن. الحفاظ على تصفية حقن الحل على الجليد لمدة التجربة. |
| HEPES المخزنة مؤقتا المالحة | في 1 L H2O، إضافة: 8.77 غرام من حمض الكلى، 5.2 غرام HEPES، | درجة الحموضة إلى 7.0 وتخزينها في 4 درجة مئوية. |
| تتراميثيل رودامين دإكستران (10,000 ميغاواط) صبغ الأوراق المالية الحل | صبغ رودامين من ثيرموفيشر | غالباً ما تباع هذه الصبغة كمسحوق مُلَلَّف. في هذه الحالة، تشكل حلا للمخزون من 50 ملغ / مل مع الماء. الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 5 دقائق لإزالة أي جزيئات غير قابلة للذوبان. جمع supernatant بعد الطرد المركزي، وتجنب أي مادة الجسيمات في الجزء السفلي من الأنبوب، aliquot وتجميد في -20 درجة مئوية. يمكن الاحتفاظ aliquots الأسهم في الاستخدام في 4 درجة مئوية لمدة أسبوع إلى أسبوعين. تجنب يذوبان تجميد aliquots عدة مرات. إذا كانت الإبر انسداد بسبب صبغ، يمكن أيضا أن يتم تصفية الصبغة من خلال Whatman #2 ورقة التصفية. |
الجدول 1: وصفات الحل والملاحظات.
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول حقن البيض. (أ) إعداد نموذجي التي يمكن استخدامها لحقن البيض. (ب) يتم فصل البيض عن الركام عن طريق غربال. (C) يتم عقد البيض للحقن في الآبار الصغيرة التي أدلى بها وضع قالب في دافئ، أجاروز السائل. (D) يمكن رؤية الفلورة في الإبرة وفي خمسة بيضات حقن من خلال المجهر تشريح الفلورسنت. (E) بيضة غير منحقنة. ويمكن تمييز الطرف الأمامي (المدبب قليلاً؛ اليسار) والنهاية الخلفية (أكثر حدة؛ يميناً) عن بعضهما البعض. المنطقة الأكثر ملاءمة للحقن، بالقرب من النهاية الخلفية، يظهر مع قوس. (F) بيضة بعد يومين من الحقن. موقع الحقن مرئي كتغير طفيف في اللون، وكمية صغيرة من صفار المطرود واضح (السهم). قضبان مقياس = 1 مم (D)؛ 0.5 ملم (E و F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يتم التملّق الإبر باستخدام طاحونة صغيرة أو beveller. (أ) مثال على طاحونة صغيرة مع سطح دائري، الغزل طحن مبللة عن طريق نازف ماء ريال عماني (قطرات الماء من الحقنة هو مبين في الجزء العلوي من الصورة). (B) قبل شطبة، والإبر سحبت طويلة وضيقة. (C) بعد شطبة إلى 20 درجة، يتم إنشاء إبرة حقن حادة. لاحظ قطر 10 ميكرومتر من التجويف الداخلي. (قضبان المقياس الأحمر = 10 درجة مئوية). (D) يمكن تخزين الإبر المنكبة المسحوبة في طبق بيتري مع غطاء وعقد في مكان باستخدام شمع الأسنان. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يمكن أن تقلل الحقن من معدل البقاء على قيد الحياة. (أ) البيض الميت والموت واضح عند التفتيش البصري. (ب) مع مرور الوقت، سوف تهاجر المواد إلى جانب واحد من البيضة. (ج) مقارنة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد أربعة إلى ستة أيام من زرع البيض لمجموعة متنوعة من الظروف، بما في ذلك: البيض غير المحقون (ن = 6 تجارب)؛ البيض المثقوب بإبرة 9 ميكرومتر ولكن غير حقن (ن = 2 تجارب)؛ البيض حقن مع العازلة وصبغ (ن = 13 التجارب)؛ البيض حقن مع العازلة، صبغ، وناقلات بلازميد (ن = 2 التجارب)؛ البيض حقن مع العازلة، صبغ، وDMSO (ن = 11 التجارب)؛ والبيض حقن مع العازلة، وصبغ، والسيطرة dsRNA (ن = 22 التجارب). وشملت نوع عنصر التحكم dsRNA المستخدمة dsRNA ضد eGFP أو dsRed. الأرقام في قاعدة كل شريط لاحظ العدد الإجمالي للبيض الباقين على قيد الحياة / مجموع البيض المستخدمة لكل حالة. تمثل أشرطة الخطأ خطأ قياسي للمتوسط. شريط مقياس = 1 مم (A و B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تقييم نتائج الحقن. (A-B) حقن محسن Zeste (E(z)dsRNA يغير التعبير الطبيعي من Ubx mRNA (نوع البرية هو مبين في (أ)ويؤدي إلى تحويل الهوائيات (AN) وأجزاء الفم (Mx، Lb) إلى الزوائد الساق مثل (B). (C-D) حقن البيض في وقت مبكر مع عنصر transposable piggyBac وhistone2B-eGFP تنتج الأجنة المعدلة وراثيا التعبير عن GFP في جميع النوى. يمكن ملاحظة موقع النوى 8 ح بعد وضع البيض (C) و 20 ساعة بعد وضع البيض (D). المختصرات: A = Antenna; Mx = ماكسيلا; رطل = لابيوم; T1-3 = الساقين الصدر 1-3؛ RNAi = تداخل الحمض النووي الريبي؛ غيغابايت = جي بيماكولاتوس; القانون = الفعل؛ H2B = هيستون H2B; GFP = بروتين الفلورسنت الأخضر. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر (ألف وباء)؛ 500 ميكرومتر (E و F). وقد وصفت هذه النتائج التجريبية في الأصل في مكان آخر7،20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
التحديات الرئيسية اثنين مع هذه التقنية هي القضايا ذات الصلة من حجم إبرة الأمثل والقدرة على البقاء. على الرغم من أن الإبر الصغيرة تحسن القدرة على البقاء على قيد الحياة، فإن الإبر ذات اللومن الأضيق لديها درجة أكبر من القوى الشعرية في العمل، مما يجعل من المرجح أن ينتقل صفار البيض إلى الإبرة مما تسبب في انسداده. في أفضل الأحوال، يمكن إزالة انسداد ببساطة عن طريق حقن بيضة أخرى أو عن طريق تطهير الإبرة كما هو موضح أعلاه. يمكن للمرء أيضا محاولة زيادة ضغط التوازن على الحاقن الدقيق حتى يتم دفع صفار من الإبرة. والتحدي الرئيسي الآخر مع هذه التقنية هو البقاء على قيد الحياة. في أيدينا، معدلات البقاء على قيد الحياة للبيض حقن مع الحلول التجريبية عادة ما بين 40 و 80٪. يمكن أن تكون معدلات البقاء على قيد الحياة منخفضة مثل 10٪ لأولئك الذين بدأوا في تعلم هذه التقنية ولكن سوف تتحسن مع الممارسة. الضوابط السلبية، كما هو موضح أعلاه، مهمة للباحثين لتقييم دقيق للتغيرات في معدل البقاء على قيد الحياة مع الممارسة، نظرا لأن إدخال مواد مختلفة يمكن أن تقلل من معدلات البقاء على قيد الحياة (الشكل3C).
توقيت الحقن هو اعتبار مهم لكل نهج تجريبي كذلك. البيض الأكبر سنا أكثر صعوبة في الحقن من الأصغر سنا، وبشكل عام، معدلات البقاء على قيد الحياة أعلى عند حقن البيض الأصغر سنا بدلا من كبار السن. إدخال الإبرة والمواد المحقونة في مراحل لاحقة يمكن أن يؤدي إلى ضرر تشريحي غير مقصود. مع الخبرة، ومع ذلك، حقن البيض من يومين إلى ثلاثة أيام من العمر ممكن. استهداف الجانب الظهري من البويضة في هذه المراحل يساعد على تجنب الإضرار بالجنين، الذي يشكل أولا على الجانب البطني. استهداف النهاية الخلفية قد يزيد من وصول الكاشف إلى الانقسامات النووية الأولى وتشكيل الفرقة الجرثومية، والتي تحدث بالقرب من هذه النهاية من البيضة19،21. إذا كان المرء يحاول التلاعب بالجينوم، بهدف تحقيق إما انتقال جسدي واسع النطاق أو جرثومي لتعديل الجينوم، ينبغي إجراء الحقن قبل الخلوية، التي تبدأ حوالي 14 ساعة بعد وضع البيض19 . إذا حقن dsRNA لهدم مستويات mRNA، ينبغي تحديد الإطار الزمني للحقن على أساس كيف في وقت مبكر من التنمية يرغب المرء في هدم جين من الفائدة. في حين أن آثار RNAi من المرجح أن تستمر لبعض الوقت، DsRNA يحتاج إلى إدخال قبل الوقت الذي يخطط المرء لتقييم أي تغييرات في النمط الظاهري. قد يكون من المهم تتبع الوقت المنقضي أثناء الحقن وتطور النمو الجنيني لضمان حقن بيض المرحلة المناسبة. بغض النظر عن المواد التي يتم حقنها، فإن تأخر النمو بعد الحقن شائع، على الرغم من أن درجة التأخير قد تختلف حسب الحقن.
ويعتمد البروتوكول المعروض هنا على عدد من قطع المعدات الباهظة الثمن نسبيا. ومع ذلك، ينبغي أن يكون من الممكن حقن البيض بنجاح دون استخدام بعض أو حتى كل هذه البنود. على سبيل المثال، هناك مجموعة متنوعة من الحقن المجهري في السوق، وبعضها قد يكون أقل تكلفة من تلك المقترحة في جدول المواد. ومن الممكن أيضا ببساطة استخدام حقنة لحقن كمية مناسبة من المواد، على الرغم من أن هذا من شأنه أن يأخذ بعض الممارسة. بدلا من micromanipulator مكلفة، يمكن للمرء استخدام مجموعة متنوعة من المواد لعقد إبرة ثابتة والسماح تقدم بطيء، والسيطرة عليها، وقد تم استخدام تصميم البلاستنس بسيطة من قبل الآخرين22. قد يكون من الممكن أيضا لتجنب استخدام beveller، على الرغم من أن في تجربتنا شطبة السليم يمكن أن تحدث فرقا هائلا لنجاح الحقن. قد يكون من الممكن شحذ إبرة سحبت عن طريق سحب غيض من الإبرة باليد عبر أفضل ورقة من السخير، وتقييم هذه العملية تحت المجهر. بغض النظر عن, الإبر شحذ سيجعل الحقن أسهل وتحسين البقاء على قيد الحياة.
هذه التقنية حقن مرنة ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التلاعبات المختلفة. هنا، لقد أظهرنا نتائج لdsRNA وpiggyBac تعتمد على تجارب التعديل الجينومي، ولكن من الممكن أيضا استخدام كريسبر / كاس أو غيرها من النهج مع هذه التقنية. في التجارب المدرجة هنا، كانت الأنماط الظاهرية الناتجة واضحة وسهلة التقييم. قد تتطلب بعض التجارب استخدام الكيمياء المناعية أو غيرها من أدوات التصور من أجل رؤية آثار التلاعب التجريبي. أحد بدائل الحقن هو استخدام الكهرباء، والتي يمكن استخدامها لإدخال الحمض النووي أو الجزيئات الكبيرة الأخرى في الخلايا والأنسجة في الجسم الحي. يمكن استخدام الكهربة في بيض الكريكيت القديم حيث تكونالأجنة قد تشكلت بالفعل من أجل استهداف مناطق محددة8، ولكن الحقن هو أكثر فائدة عندما تتطلب التجربة أن يتم استهداف الجنين النامي بأكمله. وينبغي أيضا أن تكون هذه التقنية حقن قابلة للتكيف بسهولة للاستخدام في البيض من مجموعة متنوعة من الحشرات الهيمتابولوس والهولوميتابولوس المختلفة، وتحسين مثالي القدرة على إجراء دراسات مقارنة ذات مغزى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم البحوث الواردة في هذا المشروع من قبل جائزة التنمية المؤسسية (IDeA) من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم المنحة P20GM10342 إلى HH3، ورقم جائزة NSF IOS-1257217 إلى الفريق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
