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Developmental Biology

इंजेक्शन Gryllus bimaculatus अंडे

Published: August 22, 2019 doi: 10.3791/59726
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 5
1Colby College, 2Division of Evolutionary Developmental Biology, National Institute for Basic Biology, 3Department of Biological Sciences, National University of Singapore, 4Department Biology and Department of Neuroscience, Bowdoin College, 5Department of Organismic and Evolutionary Biology and Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

Summary

यहाँ हम क्रिकेट अंडे इंजेक्ट करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, एक तकनीक जो क्रिकेट में कई प्रयोगों में एक मूलभूत विधि के रूप में कार्य करती है, जिसमें आरएनए हस्तक्षेप और जीनोमिक हेरफेर तक ही सीमित नहीं है।

Abstract

किसी विकासशील जीव में जीन फलन में परिवर्तन करना विभिन्न प्रकार के प्रयोगों का केन्द्र होता है। जबकि काफी शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण पारंपरिक मॉडल प्रणालियों में विकसित किया गया है, यह जीन या दूत आरएनए (mRNA) सबसे अन्य जीवों में हेरफेर करने के लिए मुश्किल है. एक ही समय में, विकासवादी और तुलनात्मक दृष्टिकोण कई अलग अलग प्रजातियों में जीन समारोह के एक अन्वेषण पर भरोसा करते हैं, विकास और वर्तमान में आनुवंशिक रूप से पथकेतर बाहर अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए तकनीक के अनुकूलन की आवश्यकता प्रजातियां. यह प्रोटोकॉल भ्रूण या लार्वा विकास पर दिए गए हेरफेर के प्रभाव पर परख करने के लिए क्रिकेट के अंडों में अभिकर्मकों को इंजेक्शन लगाने की एक विधि का वर्णन करता है। कैसे इकट्ठा करने के लिए और beveled सुइयों के साथ अंडे इंजेक्ट करने के लिए निर्देश वर्णित हैं. यह अपेक्षाकृत सरल तकनीक लचीला और संभावित अन्य कीड़ों के लिए अनुकूलनीय है. एक इकट्ठा और एक ही प्रयोग में अंडे के दर्जनों सुई कर सकते हैं, और बफर केवल इंजेक्शन के लिए अस्तित्व की दर अभ्यास के साथ सुधार और 80% के रूप में उच्च के रूप में किया जा सकता है. इस तकनीक औषधीय एजेंटों के इंजेक्शन सहित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के कई प्रकार का समर्थन करेगा, इन विट्रो छाया हुआ MRNA में ब्याज के जीन व्यक्त करने के लिए, डबल फैला आरएनए (dsRNA) आरएनए हस्तक्षेप को प्राप्त करने के लिए, नियमित रूप से संकुल का उपयोग अंतराक्रमित लघु palindromic दोहराता है (CRISPR) CRISPR संबद्ध प्रोटीन के साथ संगीत कार्यक्रम में 9 (Cas9) जीनोमिक संशोधन के लिए अभिकर्मकों, और क्षणिक तत्वों क्षणिक या स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करने के लिए.

Introduction

जीवों में जीनोम को संशोधित करने या जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने की क्षमता कार्यात्मक कारणता का परीक्षण प्रयोगों के कई प्रकार के डिजाइन के लिए आधार है। यह तुलनात्मक और विकासकेयोग्य कार्य के लिए भी महत्वपूर्ण है कि जीनोमिक और गैर-भूगर्भीय संशोधन तकनीक पारंपरिक आनुवंशिक प्रयोगशाला पशु मॉडल प्रणालियों के बाहर जीवों में उपलब्ध हो (उदाहरण के लिए, मस्क्यूलस, Danio रीरियो, ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर, और केनोरब्डाइटिस एलेगेन्स) चाहे वह जीव विविधता1 या एक Krogh के सिद्धांत के पालन को समझने की इच्छा है, कि हर जैविक सवाल के लिए वहाँ एक जीव सबसे अच्छा इसके समाधान के लिए अनुकूल है2,3,जीनोम को संशोधित करने की क्षमता या प्रभाव जीन अभिव्यक्ति आधुनिक प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए आवश्यक है.

क्रिकेट ग्रिलस बिमाकुलेटस एक उभरती हुई मॉडल प्रणाली है। न्यूरोएथोलॉजी प्रयोगों4में पिछली शताब्दी के लिए प्रयुक्त , पिछले दो दशकों में क्रिकेट में प्रयोगात्मक रुचि में वृद्धि हुई है , विशेष रूप से इस जीव के विकास और विकास पर ध्यान केंद्रित5. क्रिकेट एक अर्धधातुबोलिक कीट है जो अच्छी तरह से अध्ययन किए गए होलोमेटाबोलस कीटों की शाखाओं को आधारित करता है, जैसे डी मेलेनोगैस्टर और ट्राइबोलियम कैस्टेनम6। विकासवादी पेड़ पर अपनी उपयोगी स्थिति के कारण, वैज्ञानिकों को इस कीट में आधुनिक, परिष्कृत प्रयोगात्मक सवाल पूछने में रुचि रखते हैं, जिसके कारण जी बिमाकुलटसमें उपयोग के लिए आणविक उपकरणों को अनुकूलित करने में बढ़ती रुचि पैदा हुई है।

क्रिकेट के अंडों में आणविक अभिकर्मकों के इंजेक्शन का उपयोग जीनोमिक संशोधन प्रयोगों के साथ-साथ भ्रूणों में जीन अभिव्यक्ति के गैर-जीनोमिक जोड़-तोड़ के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्रांसपोसे पिग्गीबैक7,8का उपयोग करते हुए ईजीएफपी प्रविष्टि ले जाने वाले ट्रांसजेनिक जी बिमाकुलटस का सृजन किया गया है। जांचकर्ताओं ने जिंक-उंगली न्यूक्लेस (जेडएफएनएस) और ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर-जैसे (टीएएएए) प्रभावक न्यूक्लेस (TALENs) का उपयोग करके नॉकआउट जी bimaculatus को सफलतापूर्वक बनाया है ताकि विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों9में डबल-स्ट्रेंड ब्रेक लागू किया जा सके। हालांकि [FNs और TALENs बड़े चार मॉडल सिस्टम से परे जानवरों में साइट-विशिष्ट लक्ष्यीकरण की अनुमति है, इन अभिकर्मकों जल्दी CRISPR/Cas9 प्रणाली है, जो प्रयोग करने के लिए आसान है, और अधिक कुशल, और अत्यधिक लचीला10से पार कर गया है. CRISPR जी bimaculatus में इस्तेमाल किया गया है नॉक-आउट11 के रूप में अच्छी तरह से दस्तक लाइनों12,13 जीनोमिक संशोधन के अलावा, dsRNA अंडे में इंजेक्ट किया जा सकता है विकसित करने में MRNA अभिव्यक्ति नीचे दस्तक भ्रूण, जांचकर्ताओं विकास14,15में विशिष्ट प्रतिलिपि की भूमिका को समझने के लिए अनुमति देता है. क्रिकेट के अंडों को इंजेक्ट करने के बारे में कुछ सीमित विवरण पहलेप्रकाशितकिए जा चुके हैं .

यहाँ, हम जल्दी जी bimaculatus अंडे इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल प्रभावी और आसानी से विभिन्न प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए अनुकूलनीय है, इंजेक्शन सामग्री, और संभवतः अन्य कीड़ों के लिए. जबकि डिजाइन और जीनोमिक संशोधन और knockdown प्रयोगों को लागू करने के लिए अतिरिक्त विवरण कहीं और प्रकाशित किया गया है12,13, इन दृष्टिकोण अंततः इंजेक्शन प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत पर निर्भर करेगा.

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Protocol

1. हार्डवेयर सेटअप और सामग्री की तैयारी

नोट: समाधान, अभिकर्मक, और उपकरण विवरण तैयार करने के लिए सामग्री की तालिका 1 और तालिका देखें।

  1. अंडे देखने और इंजेक्शन सुई मार्गदर्शन करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप सेट करें। (चित्र1क एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप को फ्लोरोसेंट से सुसज्जित दिखाता है। फ्लोरोसेंट क्षमता फायदेमंद है लेकिन आवश्यक नहीं है।
  2. इंजेक्शन सुई को स्थान में पैंतरेबाज़ी करने के लिए 3-अक्ष माइक्रोमैनिप्युलेटर को स्थान दें (चित्र 1क)।
  3. सामग्री की छोटी मात्रा में इंजेक्ट करने के लिए ट्यूबिंग और सुई धारक के साथ एक माइक्रोइंजेक्टर सेट करें (चित्र 1A)। वैकल्पिक रूप से आंकड़ा में नहीं दिखाया गया है जो एक पैर पेडल का उपयोग करें।
  4. डिजाइन और एक 3 डी प्रिंटर या एक लेजर उत्कीर्णक के साथ, वांछित पैटर्न के व्युत्क्रम मुद्रण द्वारा अंडे के लिए कुओं बनाने के लिए एक टिकट बनाने के लिए (चित्र 1C).
    नोट: दिखाया 3 डी मुद्रित नमूना टिकट 128 के साथ 4.5 सेमी x 5 सेमी है, 3 सेमी x 1 सेमी x 1 मिमी protrusions व्यक्तिगत कुओं बनाने के लिए. कैसे अनुकूलन मोल्ड की एक किस्म बनाने के लिए पर विवरण कहीं और प्रकाशित किया गया है16.
  5. 10x इंजेक्शन बफर, HEPES बफर नमकीन (HBS), और Tetramethylrhodamine Dextran डाई के एक शेयर समाधान तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  6. इंजेक्शन लगाने के लिए प्रयोगात्मक समाधान तैयार करें, जैसे dsRNA, CRISPR/Cas912, transposable तत्वों, इन विट्रो छाया हुआ MRNA7,8,औषधीय एजेंट17, $FNs , या TALENS9.
  7. कांच स्लाइड के ऊपर एक मंच 1 मिमी या तो बनाने के लिए एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मानक प्रयोगशाला टेप की कई परतों पर डबल-स्टिक टेप रखें, जिसका उपयोग मूल्यांकन के लिए सुइयों को पकड़ने के लिए किया जाएगा।
  8. एक क्रिकेट कंटेनर लगभग 40 सेमी x 60 सेमी आकार में एक ढक्कन हवा परिसंचरण के लिए एक जाल कवर खोलने रखने के साथ तैयार करें।
  9. भोजन, पानी, और आश्रय सामग्री जोड़ें.
  10. कई दर्जन स्वस्थ पुरुष और महिला वयस्क क्रिकेट जोड़ें. पंखों की उपस्थिति से वयस्क क्रिकेट की पहचान करें।
    नोट: बाद की उम्र की एक सीमा अंडे की पैदावार में वृद्धि हो सकती है. एक प्रयोग के लिए पर्याप्त अंडे इकट्ठा करने में सक्षम होने के लिए क्रिकेट का घनत्व अपेक्षाकृत अधिक होना चाहिए, लेकिन इतनी भीड़ नहीं है कि नरभक्षण होता है। उदाहरण के लिए, लगभग दो दर्जन स्वस्थ क्रिकेट, महिला अनुपात के लिए एक मोटे तौर पर बराबर पुरुष के साथ, ऊपर उल्लेख आकार के एक कंटेनर में एक से दो एच अवधि में लगभग 200 अंडे इकट्ठा करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. क्रिकेट को कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है, लेकिन विकास और व्यवहार इष्टतम होगा यदि क्रिकेट को गर्म (23.5-26 डिग्री सेल्सियस), आर्द्र (40 - 60% सापेक्ष आर्द्रता) इनक्यूबेटर में बनाए रखा जाता है।

2. इंजेक्शन के लिए सुई बनाना

  1. फिलामेंट के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास कैपिलरी का उपयोग करें (आकार विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। एक ही दिन पर पुल सुइयों तैयार, या कुछ दिनों तक इंजेक्शन पूरा कर रहे हैं.
  2. पुलर में एक केशिका ग्लास रखें, फिलामेंट पर कांच को केंद्र करें, और कांच को सुरक्षित करने के लिए knobs को कसें।
  3. कांच रैंप अस्थायी (-5 डिग्री सेल्सियस से 10 डिग्री सेल्सियस) के पास खींचने का तापमान सेट करें।
  4. एक एकल कदम, उच्च गर्मी प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए एक छोटे से खोलने के साथ एक लंबे टेपर खींचने के लिए, लेकिन समाप्त हो पिघलने से बचने के बंद कर दिया.
    नोट: उदाहरण के लिए, एक बॉक्स फिलामेंट से सुसज्जित सामग्री की तालिका में विस्तृत माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करते समय, 478 के रैंप तापमान के साथ कांच के लिए निम्नलिखित पैरामीटरों का उपयोग करें: हीट 478; 45 खींचो; वेल 75; डेल 120. चित्र 2ख में दर्शाए आकार के साथ सुई के उत्पादन के लिए इष्टतम स्थितियाँ प्रत्येक उपयोगकर्ता द्वारा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए।
  5. इंजेक्शन के लिए तैयारी में बेवल सुई युक्तियाँ.
  6. बेवेलर के कताई चक्की के तल को टपकते पानी से गीला करें (चित्र 2क)। रिवर्स असमस (आरओ) या डाइएथिलपिरोकार्बोनेट (डीईपीसी) का इलाज आसुत जल का उपयोग करें।
  7. बेवेलर में खींची गई सुई रखें और 20 डिग्री कोण पर मुड़ें।
  8. सुई को तब तक कम करें जब तक कि यह पीसने वाले विमान को स्पर्श न कर े हो और 2 से 3 मिनट के लिए बेवल हो जाए।
  9. डबल-स्टिक टेप पर बेवल्ड सुई रखकर बेवल का आकलन करें जो कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड का पालन किया गया है।
  10. एक कैमरा और छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर से लैस एक यौगिक माइक्रोस्कोप के मंच पर सुई पकड़े स्लाइड प्लेस.
  11. एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर सुई टिप की एक छवि प्राप्त करें.
  12. सुई के आंतरिक लुमेन व्यास को मापने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें , जो बेवेल्ड छिद्र के निकट है (चित्र 2ब्) । इष्टतम आकार 10 डिग्री मी + 2 डिग्री मी है।
  13. उन सुइयों को छोड़ें जिनका छिद्र 8 उ उ उ और 12 उ से ऊपर होता है।
  14. धूल से बचने के लिए सुइयों को एक कंटेनर में ढक्कन के साथ स्टोर करें। सुझावों को तोड़ने से रोकने के लिए सुई को कंटेनर के नीचे से ऊपर उठाने के लिए मोम या इसी तरह की सामग्री की पट्टी का उपयोग करें (चित्र 2D)।

3. अंडा संग्रह और तैयारी

  1. किसी भी नम बिछाने सामग्री (पानी शीशियों, अंडे व्यंजन) रात भर या अंडे इकट्ठा करने का प्रयास करने से पहले कम से कम 8-10 एच के लिए क्रिकेट वंचित द्वारा रखी अंडे की संख्या को अधिकतम।
    नोट: चूंकि महिलाओं में शुक्राणु को आंतरिक रूप से भंडारित करने की क्षमता होती है, इसलिए यदि सावधानीपूर्वक निषेचन प्रायोगिक रूप सेआवश्यकहै तो एक अलग समय पर प्रक्रिया आवश्यक हो सकती है।
  2. पानी में 1% agarose के 40 एमएल बनाओ और एक 10 सेमी पेट्री डिश में डालना.
  3. अगारोस की सतह पर एक अंडा-वेल स्टाम्प रखें इससे पहले कि यह ठोस हो जाए।
  4. टिकट निकालें, एक बार agarose ठोस है, कुओं प्रकट करने के लिए (चित्र 1C).
  5. HBS के साथ agarose अच्छी तरह से प्लेट भरें 1% पेनिसिलिन /
  6. पकवान पर ढक्कन रखें, पैराफिल्म में लपेट कर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: व्यंजन 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन संघनन से बचने के लिए उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान तक गर्म किया जाना चाहिए।
  7. क्रिकेट के लिए एक अंडा संग्रह पकवान बनाने के लिए सफेद खेल का मैदान रेत के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश भरने से अंडे देने के लिए (चित्र 1B).
    नोट: सामग्री तालिका में निर्दिष्ट रेत उचित अनाज के आकार का है। यदि रेत के दाने बहुत बड़े हैं, तो रेत अंडे को नुकसान पहुंचाएगा।
  8. लगभग 18 सेमी x 18 सेमी होने के लिए कागज तौलिया कटौती के एक वर्ग के साथ अंडे पकवान कवर, और रेत के साथ पकवान के शीर्ष पर जगह है। इस कागज तौलिया के माध्यम से नल के पानी के साथ भरा पकवान कवर.
  9. पेट्री डिश को झुकाएं और अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए धीरे से शीर्ष को निचोड़ें।
  10. पकवान के नीचे कागज तौलिया वर्ग के कोनों टक और उल्टे ढक्कन में अंडे पकवान जगह है, जो जगह में कागज तौलिया कवर रखने में मदद मिलेगी.
  11. क्रिकेट बिन में अंडे पकवान प्लेस और वयस्क महिलाओं को एक से दो एच के लिए oviposit अंडे के लिए अनुमति देते हैं.
    नोट: अपेक्षाकृत कम समय यहाँ सुनिश्चित करता है कि सभी अंडे इंजेक्शन के समय विकास के चरण में समान हो जाएगा. यदि सेल्यूलराइजेशन से पहले इंजेक्शन महत्वपूर्ण है, तो इंजेक्शन अंडे बिछाने के 14 एच के भीतर होना चाहिए19.
  12. इस बीच, आगारोस डिश (चरण 3.6) से इंजेक्शन के लिए अंडे धारण करने की तैयारी में कमरे के तापमान को गर्म करने की अनुमति दें।
  13. अंडे संग्रह पकवान निकालें, अब ताजा रखी अंडे युक्त, क्रिकेट बिन से, और कागज तौलिया कवर हटा दें. कम से कम 500 एमएल क्षमता के बीकर पर 0ण्5-1 मिमी के छिद्र आकार के साथ एक छलनी रखें (चित्र 1ख)।
  14. अंडे देने वाले पकवान (सैंड और अंडे) की सामग्री को धीरे से चलने वाले नल के पानी के नीचे छलनी में कुल्ला करें जिससे रेत के दाने नीचे बीकर में पानी में छलनी जाल के माध्यम से गिर जाते हैं लेकिन क्रिकेट के अंडे को छलनी टोकरी में छोड़ देते हैं।
  15. आरओ पानी के साथ एक कंटेनर भरें और यह एक ट्रे में जगह है. कंटेनर पर छलनी उलटें और पानी में अंडे को हटाने के लिए पकवान के खिलाफ नल। अंडे कंटेनर के नीचे करने के लिए सिंक जाएगा।
  16. व्यास में लगभग 3 मिमी खोलने बनाने के लिए कैंची के साथ एक P1000 पिपेट टिप बंद टिप कट. एक P1000 pipettor पर इस टिप प्लेस और यह संभव के रूप में कम पानी के रूप में स्थानांतरित, agarose अंडे मोल्ड पकवान के लिए कंटेनर से अंडे हस्तांतरण करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं।
  17. HBS प्लस 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन से भरे अगारोस कुओं में अंडे को लाइन अप करने के लिए प्लास्टिक चने का उपयोग करें। प्रत्येक अंडा एक व्यक्ति के नीचे अच्छी तरह से सिंक जाएगा. पेट्री डिश ढक्कन के साथ कवर जब तक इंजेक्ट करने के लिए तैयार है.

4. माइक्रोइंजेक्टर तैयार करें

  1. एक संपीड़ित हवा या गैस स्रोत के लिए microinector संलग्न (इस प्रोटोकॉल या तो संपीड़ित हवा या N2का उपयोग कर अनुकूलित किया गया था).
    नोट: यदि एक पोर्टेबल हवा टैंक का उपयोग कर, कम से कम 75 साई को भरने. टैंक इंजेक्शन भर में हवा के दबाव खो देंगे और फिर से भरना पड़ सकता है; इंजेक्शन 40psi के नीचे मुश्किल हो जाते हैं.
  2. माइक्रोइंजेक्टर चालू करें। इंजेक्शन समय सेट करने के लिए 0.17 s और दबाव करने के लिए 10-15 साई.
    नोट: आवश्यक सटीक दबाव सुई के उद्घाटन पर निर्भर करेगा और इंजेक्शन के हर दौर के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए और /
  3. सुनिश्चित करें कि microinector का संतुलन घुंडी करने के लिए बदल गया है 0 (आमतौर पर पूरी तरह से काउंटर-घड़ी) और microinsector दबाव और इंजेक्शन मोड में है कि.

5. इंजेक्शन

  1. 1 एमएल सिरिंज और 0.45 डिग्री सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके 10x इंजेक्शन बफर के लगभग 500 डिग्री सेल्सियस को फ़िल्टर करें।
  2. मिक्स इंजेक्शन अभिकर्मकों (विवरण है कि पालन dsRNAके इंजेक्शन के लिए कर रहे हैं के रूप में 12 में वर्णित तैयार).
    नोट: यह डिजाइन और कई नियंत्रण प्रदर्शन करने के लिए सलाह दी जा सकती है, खासकर जब एक पहली बार इस तकनीक सीख रहा है. इंजेक्शन के बिना अंडे प्रहार, बफर इंजेक्शन + अकेले डाई, या इंजेक्शन बफर + डाई + एक नियंत्रण अभिकर्मक (जैसे eGFP dsRNA के रूप में) इंजेक्शन प्रोटोकॉल के विघटनकारी विभिन्न तत्वों कैसे हो सकता है के सभी अच्छे परीक्षण कर रहे हैं. विभिन्न नियंत्रणों की संख्या की survivability के लिए चित्र 3 देखें.
  3. एक 4 एमएल dsRNA alicot के साथ शुरू करो.
  4. dsRNA alicot करने के लिए फ़िल्टर किए गए 10x इंजेक्शन बफर के 0.5 एमएल जोड़ें।
  5. 50 मिलीग्राम/एमएल Tetramethyl rhodamine Dextran डाई स्टॉक समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें। यदि फ्लोरोसेंट के बिना एक विच्छेदन गुंजाइश पर काम कर रहे हैं, Phenol लाल बजाय का उपयोग करें.
  6. इंजेक्शन अवधि की अवधि के लिए बर्फ पर सभी सामग्री रखें।
  7. 20 एमएल लोडिंग युक्तियाँ और एक p10 पाइप्ट का उपयोग कर एक इंजेक्शन सुई में इंजेक्शन समाधान लोड।
  8. एक 1.5 एमएल इंजेक्शन समाधान ड्रा और इंजेक्शन सुई के व्यापक अंत में लोडिंग टिप डालें।
  9. समाधान के रूप में दूर संभव के रूप में सुई में नीचे निकालें और धीरे flicking द्वारा हवा के बुलबुले को खत्म; सुई को तोड़ने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  10. विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के नीचे अंडे के पकवान प्लेस और लगभग 10x (1x आवर्धन 10x आंख उद्देश्यों के माध्यम से देखा) के एक कम आवर्धन का चयन करें।
  11. इंजेक्शन आवास में सुई डालें और कस.
    नोट: ध्यान रखें कि सुई ठीक से और मजबूती से आवास में डाला जाता है। ऐसा करने के लिए, सुई के व्यापक अंत को धातु आवास से बाहर वापस खींच, इसके साथ आवास में सिलिकॉन ट्यूबिंग लाने. सिलिकॉन ट्यूबिंग समायोजित करें ताकि सुई के कांच के अंत सिर्फ सिलिकॉन से परे protrudes. यदि ऐसा नहीं किया जाता है, तो सिलिकॉन ट्यूबिंग कांच और धातु आवास के बीच pinched हो सकता है, सुई के अंत को अवरुद्ध.
  12. ध्यान से micromanipulator में एक संलग्न सुई के साथ इंजेक्शन आवास डालें. सुई के तेज अंत के बारे में पता है और सावधान रहना है कि यह सतहों में टक्कर नहीं है और टूट गया है।
  13. दोनों अंडे और सुई को माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते समय, डिश ग्रिड के ऊपरी बाएँ कोने में अंडे के पास सुई को हिलाएं।
  14. सुई को तब तक कम करें जब तक कि टिप डिश में एचबीएस प्लस 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन बफर समाधान में प्रवेश नहीं करती है।
  15. दृष्टि के क्षेत्र में सुई केंद्र और अंडे पकवान ले जाएँ ताकि सुई अंडे की तुलना में पकवान के किनारे के करीब कुछ मिमी है.
  16. सुई के साथ अंडे के ग्रिड के दृश्य में बाधा न डालें।
  17. यह सुई में फ्लोरोसेंट का निरीक्षण और सुई की नोक पर ध्यान केंद्रित करने के लिए संभव है तो Rhodamine के लिए उपयुक्त फिल्टर करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें।
  18. माइक्रोइंजेक्टर पर, इंजेक्शन समाधान निलंबन समाधान में सुई से बाहर रिसाव करने के लिए शुरू होता है जब तक कि माइक्रोइंजेक्टर, धीरे धीरे संतुलन घुंडी दक्षिणावर्त बारी। माइक्रोइंजेक्टर की स्क्रीन पर शेष संख्या को बढ़ाने के लिए शुरू हो जाएगा, हालांकि संख्यात्मक मूल्य महत्वपूर्ण नहीं है. अगले, डाई सुई से बाहर लीक बंद हो जाता है जब तक थोड़ा counterclockwise वापस बारी.
    नोट: यह इस संतुलन हर बार एक नई सुई का उपयोग किया जाता है सेट करने के लिए महत्वपूर्ण है. उचित रूप से सेट संतुलन के बिना, microinector इंजेक्शन शुरू हो रहा है के बाद कुछ समय के लिए इंजेक्ट करने के लिए जारी रहेगा. यह भी संभव है कि एक असंतुलित सुई के साथ इंजेक्शन बटन का एक भी धक्का भरी हुई सुई की पूरी सामग्री के निष्कासन में परिणाम होगा.
  19. देखने के क्षेत्र में केंद्रित सुई के साथ, अंडे पकवान इतना है कि सुई अंडे के उद्देश्य से पहले इंजेक्शन के लिए है ले जाएँ. यह अनुशंसा की जाती है कि इंजेक्शन व्यवस्थित अंडे के ग्रिड के एक कोने में शुरू, उदाहरण के लिए, ऊपरी बाएँ कोने.
  20. के बारे में 50x करने के लिए आवर्धन समायोजित करें; इस आवर्धन पर, एक अंडा देखने के क्षेत्र के अधिकांश भर जाएगा.
  21. इंजेक्शन के लिए स्थिति में सुई ले जाने के लिए अंडे के पकवान पर माइक्रोमैनिटेटर और एक के हाथ दोनों का उपयोग करें।
  22. माइक्रोमैनिप्युलेटर का उपयोग करके सुई को उन्नत करें और सुई की नोक को इंजेक्शन लगाने के लिए पहले अंडे में डालें।
  23. अंडे के पीछे के (ब्लंटर) छोर से 20-30% अंडे की लंबाई पर सुई डालें (चित्र 1E),अंडे की लंबी धुरी के लंबवत।
  24. या तो इंजेक्शन पैर पेडल या माइक्रोइंजेक्टर पर इंजेक्शन बटन के साथ समाधान इंजेक्शन इंजेक्शन। अंडे के अंदर फ्लोरोसेंट सामग्री का एक छोटा सा बोलएका एक सफल इंजेक्शन का संकेत देगा (चित्र 1D) .
    नोट: इंजेक्शन के दौरान अंडे से कुछ जर्दी निकालना असामान्य नहीं है (चित्र 1 एफ), और यह जरूरी नहीं है कि इंजेक्शन अंडे अव्यवहार्य हो जाएगा।
  25. अंडे से सुई को वापस लें। यदि सुई को वापस लेने पर अंडे को अनजाने में अपनी अच्छी तरह से बाहर निकाला जाता है, तो सुई को वापस लेने के दौरान अंडे को वापस अपने कुएं में धकेलने के लिए छोटे संदंश का उपयोग करें।
  26. यदि इंजेक्शन के दौरान सुई रोकता है, तो अंडे से सुई को हटा दें और, अंडे को कवर करने वाले एचबीएस प्लस 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान में सुई को जलमग्न रखते हुए, या तो स्पष्ट फ़ंक्शन का उपयोग करके या इंजेक्ट को धक्का देकर भरी हुई सुई को साफ़ करें बटन.
  27. एक ही सुई का उपयोग करने के लिए जारी, संभव के रूप में कई अंडे के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया को दोहराएँ. सबसे पहले, यह केवल के बारे में 20 या 30 अंडे हो सकता है, लेकिन अभ्यास के साथ 100 से अधिक करने के लिए वृद्धि होगी.
  28. यदि सुई भरा हुआ हो जाता है और उसे साफ़ नहीं किया जा सकता है, तो सुई को छोड़ दें, एक नई सुई भरें और फिर से शुरू करें (यानी, चरण 5.7 पर वापस जाएँ).।
  29. एक गर्म इनक्यूबेटर (23.5-26 डिग्री सेल्सियस) है कि थोड़ा आर्द्र है में इंजेक्शन अंडे के पकवान स्टोर (वाष्पीकरण को कम करने के लिए) जब तक भ्रूण विश्लेषण के लिए विकास के वांछित चरण तक पहुँच गया है.
  30. कम से कम हर 24 ज, अंडे को हटा दें जो अब व्यवहार्य नहीं हैं (चित्र 3ए, बी) और निलंबन समाधान को ताजा एचबीएस प्लस 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ बदलें।
  31. इंजेक्शन के दो से तीन दिन बाद, गर्म, आर्द्र इनक्यूबेटर में विकास जारी रखने के लिए एक ढक्कन वाले पेट्री डिश में एचबीएस प्लस 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ नम किए गए पेपर तौलिए के लिए कोमल पाइपिंग या प्लास्टिक संदंश के साथ अंडे को स्थानांतरित करें।
  32. अंडे की निगरानी, और अंडे है कि अब हर दिन व्यवहार्य हैं हटा दें (चित्र 3ए, बी).

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Representative Results

क्रिकेट आसानी से नम सामग्री में अंडे देना, और नम रेत या गंदगी के रूप में पर्याप्त सामग्री प्रदान, उन्हें अंडे की एक बड़ी संख्या में बिछाने के लिए प्रेरित करता है. यह विशेष रूप से तब प्रभावी होता है जब क्रिकेट को पहले 8-10 ज के लिए अंडे देने वाली सामग्री से वंचित किया जाता है, साफ रेत में रखे अंडे को आसानी से अलग किया जा सकता है, एकत्र किया जा सकता है (चित्र 1 ख) और इंजेक्शन के लिए कस्टम-डिजाइन किए गए अंडे के कुओं में रखा जा सकता है ( चित्र1C) एक विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी, एक माइक्रोइंजेक्टर, और एक माइक्रोमैनिप्युलेटर (चित्र 1क) का उपयोग विभिन्न सामग्रियों के साथ अलग-अलग अंडों को इंजेक्ट करने के लिए किया जा सकता है (चित्र 1D)। अंडे पश् चअंत के निकट इंजेक्ट किए जाते हैं, जो पूर्वकाल-पश् च अक्ष के साथ लगभग 20-30% बिंदु पर लगाया जाता है (चित्र 1ै)। अधिक कुंद पीछे के छोर से अधिक नुकीले पूर्वकाल अंत भेद मुश्किल हो सकता है, के रूप में इन मतभेदों को अक्सर सूक्ष्म हैं (चित्र 1E). एक अंडा पक्ष की ओर से रोलिंग अक्सर पता चलता है जो अंत है जो करने के लिए मदद करता है। इंजेक्शन सुई को हटाने के बाद, अंडे की जर्दी को कभी-कभी बाहर निकाला जाता है (चित्र 1एफ), हालांकि यह विकासशील भ्रूण के स्वास्थ्य के अंदर समझौता करने के लिए प्रकट नहीं होता है।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक beveled सुइयों की तैयारी है. लंबे, पतला सुइयों खींच के बाद वे एक 20 डिग्री कोण के लिए beveled किया जाना चाहिए और 10 डिग्री मीटर के एक उद्घाटन व्यास है ($ 2 $m). यदि व्यास बहुत बड़ा है, इंजेक्शन समाधान सुई से बाहर रिसाव होगा, और इन सुइयों अंडे में बड़े छेद पैदा करेगा, जीवित रहने की दर को कम. संकीर्ण सुइयों survivability में वृद्धि, लेकिन अगर वे भी संकीर्ण कर रहे हैं, वे आसानी से रोकना करते हैं, जो इंजेक्शन धीमी और निराशा होती है. 10 उ उ 2 उ की सुई व्यास के साथ, सुई रोकना बिना एक सुई के साथ 100 अंडों के ऊपर इंजेक्ट करना संभव है।

नीडल को माइक्रो ग्राइंडर या बेवेलर (चित्र 2क) से किया जा सकता है। उपकरणों के इन टुकड़ों को एक माइक्रोस्कोप संलग्न के साथ प्राप्त किया जा सकता है, या एक मॉडल है कि माइक्रोस्कोप शामिल नहीं है के लिए एक स्वतंत्र स्टैंड पर एक विच्छेदन गुंजाइश जोड़ सकते हैं. एक छोटा micromanipulator सुई रखती है, जो वांछित कोण को झुकाया जा सकता है और एक घूर्णन पीसने वाले विमान की सतह को कम, जो टपकते पानी के साथ गीला है. खींचे गए का एक उदाहरण, परंतु अबीव्ड सुई चित्र 2ठमें देखी जा सकती है और 20 डिग्री बेवल वाली सुई चित्र 2ब्में दिखाई जाती है। सुई तो नुकसान से बचने के लिए सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जाना चाहिए और साफ रखा जा करने के लिए (चित्र 2 डी) .

माइक्रोइंजेक्टर पर उचित रूप से संतुलन और इंजेक्शन दबाव सेट करने से एक को एक ही सुई के साथ इंजेक्शन वाले प्रत्येक अंडे में सामग्री की तुलनीय मात्रा इंजेक्ट करने की अनुमति देनी चाहिए। इंजेक्शन और संतुलन के दबाव का अनुकूलन आवश्यक हो जाएगा जब एक अलग व्यास के साथ एक सुई को बदल रहा है. इस अनुकूलन इंजेक्शन दालों की स्थिरता को अधिकतम करेगा.

जीवित रहने की दर इन प्रयोगों की सफलता का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। अधिकांश मृत अंडों को आसानी से दृष्टि से इस प्रकार पहचाना जा सकता है: अंडे के भीतर जर्दी और भ्रूणीय ऊतक असमान रूप से झुंठते हुए शुरू हो जाते हैं (चित्र 3क) और अंततः अधिकांश जर्दी अंडे के एक तरफ स्थानांतरित हो जाएंगी (चित्र 3 बी) । जब 4-6 दिनों के बाद मूल्यांकन किया जाता है (चरणों 8-15 के बराबर)19, 85% से अधिक इंजेक्शन अंडे बच गए जबकि प्रयोगात्मक अभिकर्मकों के साथ इंजेक्शन अंडे आम तौर पर कम जीवित रहने की दर थी (चित्र 3 C)। इंजेक्शन के सभी पहलुओं के लिए नियंत्रण ही, सुई पंचर सहित, डाई और बफर की शुरूआत, या वाहन या dsRNA की उपस्थिति, प्रयोगात्मक हेरफेर का प्रयास किया के सही प्रभाव को समझने के लिए आवश्यक है(चित्र 3C) प्रयोगात्मक हेरफेर पर निर्भर करता है, घातकता के एक उच्च स्तर की उम्मीद की जा सकती है, और एक परख या हेरफेर के किसी भी गैर घातक प्रभाव का आकलन करने के क्रम में इंजेक्शन के समय को बदलने की आवश्यकता हो सकती है।

जिस तरह से एक इंजेक्शन के phenotypic परिणाम का आकलन क्या इंजेक्शन था पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, विशिष्ट MRNA knockdowns का एक परिणाम के रूप में phenotypic परिवर्तन सकल शरीर रचना विज्ञान के स्तर पर स्पष्ट हो सकता है. उदाहरण के लिए, जेस्टी (ई(ज) का जीन वर्तक सामान्य रूप से अल्ट्राबिटोरैक्स (यूबस) सहित होक्स जीनों को दबा देता है। ई (z) के लिए dsRNA इंजेक्शन नीचे दस्तक देता है ई (z) समारोह और विज्ञप्ति Ubx दमन, अस्थानिक Ubx अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप. यह उनखंडोंमें Ubx के derepression के कारण, टी 3 पैर की तरह उपांगों में अधर उपांग (एंटीना, मैक्सिला, लेबियम, टी 2 2 पैर) के पांच जोड़े के परिवर्तन की ओर जाता है। एक दूसरे उदाहरण में, यह एक transgene के सफल प्रविष्टि परख करने के लिए GFP अभिव्यक्ति का उपयोग करने के लिए संभव है. उदाहरण के लिए, जब एक cDNA एक eGFP-टैग Histoen 2B जीन एक जी bimaculatus Actin प्रमोटर के नियंत्रण में क्रिकेट जीनोम में पिग्गीबैक ट्रांसपोसेस का उपयोग कर डाला गया था, यह प्रत्येक नाभिक कल्पना करने के लिए संभव हो गया अंडे में फ्लोरोसेंट का उपयोग करने के लिए eGFP टैग His2B प्रोटीन उत्तेजित (चित्र 4C, डी). इस मामले में,यह7 समय के साथ नाभिक की आवाजाही पर नजर रखने के लिए संभव था.

समाधान का नाम घटक टिप्पणियाँ/विवरण
10x इंजेक्शन बफर समाधान 1 L H2O Add: 0.8 g NaCl, 0.09 g Na2HPO4, 0.04 g KH2PO4, 2.98 g KCl 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक। एक 0.45 डिग्री सिरिंज फिल्टर के साथ सुसज्जित एक 1 एमएल सिरिंज के साथ उपयोग करने से तुरंत पहले एक छोटी राशि फ़िल्टर करें। इंजेक्शन समाधान के लगभग 500 डिग्री सेल्सियस को फ़िल्टर करने के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएँ। प्रयोग की अवधि के लिए बर्फ पर फ़िल्टर्ड इंजेक्शन समाधान रखें।
HEPES बफर ्ड लवण 1 L H2O में, जोड़ें: 8.77 ग्राम NaCl, 5.2 ग्राम HEPES, पीएच से 7.0 और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
Tetramethyl Rhodamine Dextran (10,000 मेगावाट) डाई स्टॉक समाधान थर्मोफिशर से रोडामाइन डाई यह डाई अक्सर एक lyophilized पाउडर के रूप में बेचा जाता है. इस मामले में, पानी के साथ 50 मिलीग्राम/एमएल का स्टॉक समाधान करें। किसी भी अघुलनशील कणों को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। अपकेंद्रण के बाद supernatant लीजिए, ट्यूब के तल पर किसी भी कण पदार्थ से बचने, alicot और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज. उपयोग में स्टॉक एलिकोट्स को एक से दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। फ्रीज-थॉइंग एलिकोट्स को कई बार से बचें। यदि सुइयों डाई के कारण clogging रहे हैं, डाई भी Whatman #2 फिल्टर कागज के माध्यम से फ़िल्टर किया जा सकता है.

तालिका 1: समाधान व्यंजनों और नोट्स.

Figure 1
चित्रा 1: अंडा इंजेक्शन प्रोटोकॉल सिंहावलोकन। (ए) एक विशिष्ट सेट जो अंडे के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। (बी) अंडे को छलनी के माध्यम से रेत से अलग किया जाता है। (ग) अंडे को मोल्ड को गर्म, तरल अगारोस में रखकर बनाए गए छोटे कुओं में इंजेक्शन के लिए रखा जाता है। (घ) सुई में फ्लोरोसेंट तथा पांच इंजेक्ट किए गए अंडों में फ्लोरोसेंट विच्छेदन सूक्ष्मदर्शी के माध्यम से देखा जा सकता है। (ई) एक इंजेक्शन अंडे. पूर्ववर्ती अंत (थोड़ा इंगित किया गया; बायां) और पश् च अंत (अधिक कुंद; दायाँ) एक-दूसरे से अलग होते हैं। इंजेक्शन के लिए सबसे उपयुक्त क्षेत्र, पीछे के छोर के पास, ब्रैकेट के साथ दिखाया गया है। (च) इंजेक्शन के दो दिन बाद एक अंडा। इंजेक्शन साइट एक मामूली मलिनकिरण के रूप में दिखाई देता है, और निष्कासित जर्दी की एक छोटी राशि स्पष्ट है (तीर). स्केल बार्स - 1 मिमी (डी); 0.5 मिमी (ई और एफ). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सुई एक माइक्रो चक्की या beveller का उपयोग कर beveled रहे हैं. (ए) एक गोल के साथ एक माइक्रो चक्की का एक उदाहरण, कताई पीस सतह टपकाव द्वारा गीला (छवि के शीर्ष में दिखाया सिरिंज से पानी drips). (बी) बीवलिंग से पहले, खींची गई सुइयों की लंबी और संकीर्ण होती है। (ग) 20 डिग्री तक जाने के बाद, एक तेज इंजेक्शन सुई बनाई जाती है। आंतरिक लुमेन के 10 डिग्री मीटर व्यास को नोट की। (लाल पैमाने पर सलाखों $ 10 डिग्री मी). (डी) खींची गई, बीव्ड सुइयों को एक पेट्री डिश में ढक्कन के साथ संग्रहित किया जा सकता है और दंत मोम का उपयोग करके जगह में रखा जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: इंजेक्शन जीवित रहने की दर को कम कर सकते हैं। (ए) मृत और मर अंडे दृश्य निरीक्षण पर स्पष्ट कर रहे हैं. (बी) समय के साथ, सामग्री अंडे के एक तरफ स्थानांतरित हो जाएगी। (ग) विभिन्न स्थितियों के लिए अंडे देने के चार से छह दिनों के बाद जीवित रहने की दरों की तुलना, जिनमें शामिल हैं: अनइंजेक्ट किए गए अंडे (द र् 6 प्रयोग); अंडे एक 9 डिग्री मीटर सुई लेकिन uninsindddके साथ पंचर (एन $ 2 प्रयोगों); बफर और डाई के साथ इंजेक्शन अंडे (एन $ 13 प्रयोगों); बफर, डाई, और प्लाज्मिड वेक्टर (द ] 2 प्रयोगों के साथ इंजेक्शन अंडे; बफर, डाई, और DMSO के साथ इंजेक्शन अंडे (एन $ 11 प्रयोगों); और अंडे बफर के साथ इंजेक्शन, डाई, और नियंत्रण dsRNA (एन $ 22 प्रयोगों). नियंत्रण dsRNA के प्रकार का इस्तेमाल किया eGFP या dsRed के खिलाफ dsRNA शामिल थे. प्रत्येक बार के आधार पर संख्या प्रत्येक स्थिति के लिए इस्तेमाल जीवित अंडे की कुल संख्या / त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. स्केल बार - 1 मिमी (ए और बी)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: इंजेक्शन परिणामों का आकलन। (ए-बी) जस्तै के बढ़ाने का इंजेक्शन (ई (z)) dsRNA Ubx MRNA की सामान्य अभिव्यक्ति को बदल देता है (जंगली प्रकार में दिखाया गया है (( ए) और एंटीना के परिवर्तन की ओर जाता है (An) और mouthparts (Mx, Lb) पैर की तरह उपांग में (बी)। (सी-डी) transposable तत्व piggyBac और histone2B-eGFP के साथ जल्दी अंडे का इंजेक्शन ट्रांसजेनिक भ्रूण सभी नाभिक में GFP व्यक्त पैदा करता है. नाभिक का स्थान अंडे देने के बाद 8 ज (सी) और अंडे देने के बाद 20 ज ( डी ) देखा जा सकताहै. संक्षिप्त नाम: एक $ एंटीना; Mx ] मैक्सिला; एल बी जेड लेबियम; T1-3 - वक्ष पैर 1 से 3; RNAi - आरएनए हस्तक्षेप; जीबी ] जी bimaculatus; अधिनियम [ actin; H2B ] हिस्टोन H2B; GFP - हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन. स्केल बार्स ] 200 डिग्री मी (ए और बी); 500 डिग्री (ई और एफ)। इन प्रयोगात्मक परिणामों का मूल रूप से कहीं और7,20वर्णन किया गया था . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस तकनीक के साथ दो मुख्य चुनौतियों इष्टतम सुई आकार और survivability से संबंधित मुद्दे हैं. हालांकि छोटी सुइयों survivability में सुधार, संकरे lumens के साथ सुइयों काम पर केशिका बलों का एक बड़ा डिग्री है, जो यह अधिक संभावना है कि जर्दी सुई में ले जाने के कारण यह रोकना करने के लिए होगा बनाता है. सबसे अच्छा मामले में, रुकावटों बस एक और अंडा इंजेक्शन द्वारा या ऊपर वर्णित के रूप में सुई समाशोधन द्वारा मंजूरी दी जा सकती है. एक भी microinector पर संतुलन दबाव बढ़ाने के लिए जब तक जर्दी सुई से बाहर धकेल दिया है प्रयास कर सकते हैं. इस तकनीक के साथ अन्य बड़ी चुनौती survivability है. हमारे हाथों में, प्रयोगात्मक समाधान के साथ इंजेक्शन अंडे के लिए जीवित रहने की दर आम तौर पर 40 और 80% के बीच होती है। जीवन रक्षा दरों के रूप में कम के रूप में हो सकता है 10% इस तकनीक को जानने के लिए शुरुआत के लिए, लेकिन अभ्यास के साथ सुधार होगा. नकारात्मक नियंत्रण, जैसा कि ऊपर बताया गया है, शोधकर्ताओं के लिए अभ्यास के साथ जीवित रहने की दर में परिवर्तनों का सही आकलन करना महत्वपूर्ण है, यह देखते हुए कि विभिन्न सामग्रियों की शुरूआत से उत्तरजीविता दर कम हो सकती है (चित्र 3ं)।

इंजेक्शन के समय के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है. पुराने अंडे छोटे लोगों की तुलना में इंजेक्ट करने के लिए और अधिक कठिन हैं, और सामान्य रूप में, जीवित रहने की दर अधिक है जब पुराने अंडे के बजाय छोटे इंजेक्शन. बाद के चरणों में सुई और इंजेक्शन सामग्री की शुरूआत अवांछित शारीरिक क्षति का कारण बन सकती है। अनुभव के साथ, तथापि, दो से तीन दिन पुराने अंडे का इंजेक्शन संभव है. इन चरणों में अंडे के पृष्ठीय पक्ष को लक्षित करने से भ्रूण को नुकसान से बचने में मदद मिलती है, जो पहले अधर पक्ष पर बनाता है। पीछे के छोर को निशाना बनाने से पहले परमाणु विभाजनों और रोगाणु बैंड के गठन के अभिकर्मक की पहुंच में वृद्धि हो सकती है , जो अंडे के इस छोर के निकटहोती है. यदि कोई जीनोम में हेरफेर करने का प्रयास कर रहा है, तो जीनोम संशोधन के व्यापक दैहिक या जर्मलाइन संचरण को प्राप्त करने के उद्देश्य से, इंजेक्शन सेलुलराइजेशन से पहले किया जाना चाहिए, जो अंडे बिछाने के बाद लगभग 14 एच शुरू होता है19 . यदि dsRNA को नीचे दस्तक MRNA स्तर इंजेक्शन, इंजेक्शन के लिए समय खिड़की के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए कैसे विकास में जल्दी एक ब्याज की एक जीन नीचे दस्तक करना चाहता है. जबकि RNAi के प्रभाव की संभावना कुछ समय के लिए पिछले, dsRNA समय जिस पर एक phenotype में किसी भी परिवर्तन का आकलन करने की योजना के अग्रिम में पेश किया जाना चाहिए. इंजेक्शन के दौरान गुजरे समय का ट्रैक रखते हुए और भ्रूण विकास की प्रगति यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है कि उचित चरण अंडे इंजेक्ट किए जा रहे हैं। क्या सामग्री इंजेक्शन है की परवाह किए बिना, इंजेक्शन के बाद विकास देरी आम हैं, हालांकि देरी की डिग्री इंजेक्शन के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल उपकरणों की अपेक्षाकृत महंगी टुकड़े के एक नंबर पर निर्भर करता है. यह संभव होना चाहिए, तथापि, कुछ या यहां तक कि इन मदों के सभी के उपयोग के बिना सफलतापूर्वक अंडे इंजेक्ट करने के लिए. उदाहरण के लिए, बाजार में विभिन्न प्रकार के माइक्रोइंजेक्टर होते हैं, और कुछ सामग्री तालिका में सुझाए गए सूक्ष्म-अभिशप्तों कीतुलना में कम महंगे हो सकते हैं। यह भी संभव है बस एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए सामग्री की एक उचित राशि सुई, हालांकि यह कुछ अभ्यास ले जाएगा. एक महंगी micromanipulator के बजाय, एक सामग्री की एक किस्म का उपयोग करने के लिए सुई स्थिर पकड़ और एक धीमी गति से, नियंत्रित अग्रिम की अनुमति सकता है, और एक सरल plasticine डिजाइन दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है22. यह भी एक beveller के उपयोग से बचने के लिए संभव हो सकता है, हालांकि हमारे अनुभव में उचित beveling इंजेक्शन की सफलता के लिए एक भारी फर्क कर सकते हैं. यह बेहतरीन रेत कागज भर में हाथ से सुई की नोक खींचकर एक खींच सुई पैनापन करने के लिए संभव हो सकता है, एक माइक्रोस्कोप के तहत इस प्रक्रिया का आकलन. भले ही, तेज सुइयों इंजेक्शन आसान बनाने के लिए और survivability में सुधार होगा.

इस इंजेक्शन तकनीक लचीला है और विभिन्न जोड़तोड़ की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम dsRNA और piggyBac पर निर्भर जीनोमिक संशोधन प्रयोगों के लिए परिणाम दिखाया है, लेकिन यह भी CRISPR / यहाँ शामिल प्रयोगों में, जिसके परिणामस्वरूप phenotypes स्पष्ट और आसानी से आकलन कर रहे थे. कुछ प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक हेरफेर के प्रभाव को देखने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या अन्य दृश्य उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। इंजेक्शन के लिए एक विकल्प इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग है, जो डीएनए या अन्य मैक्रो अणुओं कोशिकाओं और विवो में ऊतकों में परिचय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग पुराने क्रिकेट अंडों में किया जा सकता है जहां विशिष्ट क्षेत्रोंकोलक्षित करने के लिए भ्रूण पहले से ही बन चुके हैं , लेकिन जब प्रयोग के लिए पूरे विकासशील भ्रूण को लक्षित करने की आवश्यकता होती है तो इंजेक्शन अधिक उपयोगी होता है। इस इंजेक्शन तकनीक भी आसानी से विभिन्न hemimetabolous और holometabolous कीड़ों की एक किस्म से अंडे में उपयोग के लिए अनुकूल होना चाहिए, आदर्श सार्थक तुलनात्मक अध्ययन करने की क्षमता में सुधार.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस परियोजना में रिपोर्ट किए गए अनुसंधान को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान से एचएच 3 को अनुदान संख्या पी20जीएम10342 के तहत और एनएसएफ पुरस्कार संख्या आईओएस-1257217 द्वारा एक संस्थागत विकास पुरस्कार (आईडीईए) द्वारा समर्थित किया गया था। CGE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescent dissecting microscope Leica M165 FC Stereomicroscope with fluorescence
External light source for fluorescence Leica EL 6000
Microinjector Narishige IM-300 -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket-
mCherry filter cube Leica M205FA/M165FC Filter cube for mCherry or similar red dye will work
Micromanipulator World Precision Instruments, Inc. M3301R Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8)
Magnetic stand Narishige MMO-202ND
Pipette Holder (Needle holder) Narishige HD-21
Tubing to connect air source to microinjector
Egg well stamp 3D printed custom 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic
Microwave various
Incubator or temperature controlled room various Temperatures of 23.5-26 °C are needed.
Cricket food various cat food or fish flakes are appropriate food. 
Cricket water vairous Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls
Cricket shelter arious Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons
Glass capillary tubes World Precision Instruments, Inc. Item no. 1B100F-4 Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament
Micropipette puller Flaming/Brown Model P-97 Distributed by Sutter Instrument Co.
Beveller/Micro grinder Narishige Model EG-45/EG-400 EG-400 includes a microscope head
Petri dishes CellTreat Product code 229693 90 mm diameter
Play Sand Sandtastik Products Ltd. B003U6QLVS White play sand
Agarose American Bioanalytical AB000972 Agarose GPG/LE ultrapure
Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers US Kitchen Supply Model SS-C123 Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm
Penicillin Streptomycin Gibco by Life Technologies Ref 15070-063 Pen Strep
Plastic tweezers Sipel Electronic SA P3C-STD Black Static Dissipative, 118 mm
Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm Nalgene 725-2545 Use with 1 mL syringe
1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip Becton Dickinson 309602 Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work
Air tank (optional) Midwest Products Air Works® Portable air tank
Rhodamine dye Thermofisher D-1817 dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW,
20 mL loading tips Eppendorf Order no. 5242 956.003 epT.I.P.S. 20 μL Microloader
Compound microscope Zeiss Axioskope 2 plus
20x objective Ziess Plan-Apochromat 20x/0.75 M27
Camera Leica DMC 5400
Leica Application Suite  software Leica LAS Version 4.6.2 used here

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References

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