Summary
Здесь мы представляем протокол для введения крикет яйца, метод, который служит в качестве основополагающего метода во многих экспериментах в крикет, в том числе, но не ограничиваемся, РНК вмешательства и геномных манипуляций.
Abstract
Изменение функции генов в развивающемся организме занимает центральное место в различных видах экспериментов. В то время как чрезвычайно мощные генетические инструменты были разработаны в традиционных модельных системах, трудно манипулировать генами или РНК-мессенджером (мРНК) в большинстве других организмов. В то же время эволюционные и сравнительные подходы опираются на изучение функции генов у многих различных видов, что требует разработки и адаптации методов манипулирования экспрессией за пределами в настоящее время генетически высоченных Видов. Этот протокол описывает метод инъекций реагентов в яйца крикета, чтобы оценить влияние данной манипуляции на эмбриональное или личиночное развитие. Описаны инструкции по сбору и инъекциям яиц с помощью саженотых игл. Этот относительно простой метод является гибким и потенциально адаптируется к другим насекомым. Можно собрать и впрыснуть десятки яиц в одном эксперименте, а показатели выживаемости для инъекций только буфера улучшить с практикой и может быть выше, чем 80%. Этот метод будет поддерживать несколько типов экспериментальных подходов, включая инъекции фармакологических агентов, in vitro capped mRNA для выражения генов, представляющих интерес, двухцепочечной РНК (dsRNA) для достижения РНК-интерференции, использование кластерных регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR) в сотрудничестве с реагентами, связанными с CRISPR, белка 9 (Cas9) для геномной модификации, и транспозируемыми элементами для генерации переходных или стабильных трансгенных линий.
Introduction
Способность изменять геном или влиять на экспрессию генов в организмах является основой для разработки многих типов экспериментов, тестируя функциональную причинность. Также крайне важно для сравнительной и эволюционно-соответствующей работы, чтобы методы геномной и негеномической модификации были доступны в организмах за пределами традиционных генетических лабораторных систем моделей животных (например, Mus musculus, Danio Рерио, Drosophila melanogaster, и Caenorhabditis elegans). Будь то желание понять разнообразие организма1 или свое соответствие принципу Крога, что для каждого биологического вопроса есть организм, наиболее подходящий для его решения 2,3, способность изменять геномы или влияние экспрессии генов имеет важное значение для современных экспериментальных конструкций.
Крикет Gryllus bimaculatus является новой модельной системой. Используется в течение последнего века в нейроэтиологии экспериментов4, за последние два десятилетия стали свидетелями повышенного экспериментального интереса к крикету, особенно сосредоточены на эволюции и развитии этого организма5. Сверчок является геммиметаболовым насекомым, которое ветвит базально хорошо изученных голометаболовых насекомых, таких как D. melanogaster и Tribolium castaneum6. Из-за его полезное положение на эволюционном дереве, ученые заинтересованы в задавать современные, сложные экспериментальные вопросы в этом насекомом, что привело к растущему интересу к адаптации молекулярных инструментов для использования в G. bimaculatus.
Инъекции молекулярных реагентов в яйца крикета могут быть использованы для экспериментов по геномной модификации, а также для негеномических манипуляций с экспрессией генов в эмбрионах. Например, трансгенные G. bimaculatus, несущие вставки eGFP, были созданы с использованием транспозасии piggyBac7,8. Следователи успешно создали нокаут G. bimaculatus с использованием цинк-пальца нуклеазы (ЗФН) и транскрипции активатор-как (TAL) эффектор nucleases (TALENs) ввести двухцепочечные перерывы в конкретных геномных регионах9. Несмотря на то, что ЗФН и TALENs позволяют ориентироваться на животных за пределами систем «большой четверки», эти реагенты быстро превзошли систему CRISPR/Cas9, которая проще в использовании, эффективнее и очень гибкая10. CRISPR был использован в G. bimaculatus для производства нокаут11, а также стук в линии12,13 В дополнение к геномной модификации, dsRNA может быть введен в яйца, чтобы сбить выражение мРНК в развивающихся эмбрионов, что позволяет следователям понять роль конкретных стенограмм на протяжении всего развития14,15. Некоторые ограниченные подробности о том, как вводить яйца крикет были опубликованы ранее12.
Здесь мы описываем подробный протокол для введения ранних яиц G. bimaculatus. Этот протокол эффективен и легко адаптируется к различным лабораторным настройкам, инъекционным материалам и, возможно, к другим насекомым. В то время как дополнительные детали для проектирования и реализации геномных модификаций и нокдаун экспериментов были опубликованы в другом месте12,13, эти подходы в конечном итоге будет опираться на протокол инъекций подробно описано здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Установка оборудования и подготовка материалов
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с таблицей 1 и таблицей материалов для подготовки решений, реагентов и деталей оборудования.
- Навязайте расчленяющий микроскоп, чтобы увидеть яйца и направить иглу для инъекций. (На рисунке 1А показан расчленяющий микроскоп, оснащенный флуоресценцией.) Способность флуоресценции является выгодным, но не необходимым.
- Позиция 3-осевой микроманипулятор для маневра инъекционной иглы на место(рисунок 1A).
- Настройка микроинжектора с трубкой и держатель иглы, чтобы ввести небольшое количество материала(рисунок 1A). Дополнительно используйте педаль ноги, которая не показана на рисунке.
- Дизайн и создать штамп для создания колодцев для яиц(Рисунок 1С) путем печати обратного желаемого шаблона, либо с 3D-принтером или лазерным гравером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Показанная 3D печатная штампная марка составляет 4,5 см х 5 см с 128, 3 см х 1 см х 1 мм выступы для создания отдельных колодцев. Подробная информация о том, как сделать различные настраиваемые формы были опубликованы в другом месте16. - Подготовка 10x инъекционных буфера, HEPES буферного соля (HBS), а также фондовый раствор Tetrameththththamine Dextran красителя и хранить при 4 градусах Цельсия.
- Подготовьте экспериментальные решения, которые будут вводиться, такие как dsRNA, CRISPR/Cas912, транспозируемые элементы, in vitro capped mRNA 7,8,фармакологические агенты17, ЗФНС, или TALENS9.
- Поместите двухпалую ленту на несколько слоев стандартной лабораторной ленты на слайде стеклянного микроскопа, чтобы создать платформу на 1 мм или около того над стеклянной горкой, которая будет использоваться для проведения игл для оценки.
- Подготовьте контейнер для крикета размером около 40 см х 60 см с крышкой, обладающей сеткой, покрытым отверстием для циркуляции воздуха.
- Добавьте продукты питания, воду и материалы для укрытия.
- Добавьте несколько десятков здоровых мужчин и женщин взрослых сверчков. Определите взрослый крикет по наличию крыльев.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диапазон пост-воображаемых возрастов может увеличить урожайность яиц. Плотность сверчков должна быть относительно высокой, чтобы иметь возможность собрать достаточное количество яиц для эксперимента, но не настолько переполнена, что происходит каннибализм. Например, примерно два десятка здоровых сверчков, с примерно равным соотношением мужчин и женщин, в контейнере, указанном выше, должно быть достаточно для сбора около 200 яиц в течение одного-двух часов. Сверчки могут храниться при комнатной температуре, но развитие и поведение будет оптимальным, если сверчки поддерживаются в теплом (23,5-26 градусов по Цельсию), влажном (40 - 60% относительной влажности) инкубатора.
2. Изготовление игл для инъекций
- Используйте боризикатные стеклянные капилляры с нитью (см. таблицу материалов для деталей размера). Подготовка тянуть иглы в тот же день, или до нескольких дней до инъекции будут завершены.
- Поместите капиллярное стекло в шкив, центр стекла на нити, и затяните ручки, чтобы обеспечить стекло на месте.
- Установите температуру шкива вблизи стеклянной температуры рампы (от -5 до 10 градусов по Цельсию).
- Используйте одноступенчатый, высокотемпературный протокол, чтобы вытащить длинный конус с небольшим отверстием, но избежать плавления закрытых концов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при использовании микропипетета, подробно описанного в таблице материалов, оснащенных нитью коробки, используйте следующие параметры для стекла с температурой рампы 478: Тепло 478; Вытяните 45; Vel 75; Дель 120. Оптимальные условия для производства иглы с формой, показанной на рисунке 2B, должны быть эмпирически определены каждым пользователем. - Bevel иглы советы в рамках подготовки к инъекциям.
- Влажная прядильной шлифовальной машины плоскости бевелер(Рисунок 2A) с капающей водой. Используйте либо обратный осмос (RO), либо диэтилпирокарбонат (DEPC) обработанные дистиллированной воды.
- Поместите вытащил иглы в beveler и повернуть на 20 "угол.
- Опустите иглу, пока она просто не коснется шлифовальной плоскости и скосается в течение 2 до 3 мин.
- Оцените скошенную иглу, поместив скошенную иглу на двухпалую ленту, которая была приклеена к слайду стеклянного микроскопа.
- Поместите слайд, держащий иглу, на сцене сложного микроскопа, оснащенного программным обеспечением для приобретения камеры и изображения.
- Приобретите изображение наконечника иглы, используя цель 20x.
- Используйте программное обеспечение для визуализации для измерения внутреннего просвет диаметра иглы просто проксимот к скошенной открытия(Рисунок 2C). Оптимальный размер составляет 10 мкм и 2 мкм.
- Откажитесь от игл, которые имеют отверстие ниже 8 мкм и выше 12 мкм.
- Храните иглы в контейнере с крышкой, чтобы избежать пыльной. Используйте полоску воска или аналогичный материал, чтобы поднять иглы от нижней части контейнера, чтобы предотвратить нарушение советы(Рисунок 2D).
3. Коллекция и приготовление яиц
- Увеличьте количество яиц, отложенных, лишив сверчков любого влажного материала для укладки (водяные флаконы, яичные блюда) на ночь или, по крайней мере, 8-10 ч, прежде чем пытаться собрать яйца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Так как женщины имеют возможность внутренне хранить сперму, по-разному приурочен процедура может быть необходимо, если тщательно приурочен оплодотворения экспериментально необходимо18. - Сделать 40 мл 1% агарозы в воде и залить в 10 см петри блюдо.
- Поместите яичный колодец на поверхность агарозы, прежде чем она затвердеет.
- Удалите штамп, как только агароза затвердевает, чтобы выявить скважины(рисунок 1C).
- Заполните агарозную пластину HBS, содержащую 1% пенициллина/стрептомицина.
- Поместите крышку на блюдо, оберните в parafilm и хранить при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блюда могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 градусов по Цельсию, но должны быть разогреты до комнатной температуры перед использованием, чтобы избежать конденсации. - Сделать блюдо сбора яиц для сверчков, чтобы отложить яйца, заполнив 35 мм петри блюдо с белым песком площадка(рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Песок, указанный в таблице материалов, имеет соответствующий размер зерна. Если песчинки слишком большие, песок повредит яйца. - Накройте яичную тарелку квадратом бумажного полотенца, вырезаем примерно 18 см х 18 см, и поместите на верхнюю часть блюда песком. Через это бумажное полотенце накрывают заполненную тарелку водопроводной водой.
- Наклоните чашку Петри и аккуратно сжать сверху, чтобы удалить избыток воды.
- Tuck углы бумажного полотенца квадрат под блюдо и поместите яйцо блюдо в перевернутой крышкой, которая поможет сохранить крышку бумажного полотенца на месте.
- Поместите яйцо блюдо в крикет бен и позволяют взрослым самкам oviposit яйца от одного до двух ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно короткое время здесь гарантирует, что все яйца будут похожи на стадии развития во время инъекции. Если инъекция до клетизации важно, инъекции должны произойти в течение 14 ч от яйцеклетки отложить19. - Между тем, позвольте блюдо агарозы (от шага 3.6) согреться до комнатной температуры в рамках подготовки к проведению яйца для инъекции.
- Удалите блюдо для сбора яиц, теперь содержащее свежеотложенные яйца, из корзины для крикета и удалите крышку с бумажным полотенцем. Поместите ситечко с размером поры 0,5-1 мм над стаканом емкостью не менее 500 мл(рисунок 1B).
- Промыть содержимое яйцекладка блюдо (песок и яйца) в ситечко под аккуратно работает водопроводная вода позволяя песчинки попадают через сетку ситечко в воду в стакан ниже, но оставляя крикет яйца в корзину ситечко.
- Заполните контейнер с дро водой и поместите его в лоток. Перевернуть ситечко над контейнером и нажмите его на блюдо, чтобы выбить яйца в воду. Яйца опустятся на дно контейнера.
- Отрежьте кончик от P1000 pipette наконечник с ножницами, чтобы сделать отверстие примерно 3 мм в диаметре. Поместите этот совет на P1000 пипетки и использовать его для передачи яиц из контейнера в блюдо из яичной формы агарозы, передавая как можно меньше воды, как это возможно.
- Используйте пластиковые пинцеты, чтобы выровнять яйца в колодцах агарозы заполнены HBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина. Каждое яйцо опустится на дно отдельного колодца. Накройте крышкой чашки Петри до готовности к впрыску.
4. Подготовка микроинжектора
- Прикрепите микроинжектор к источнику сжатого воздуха или газа(этот протокол был оптимизирован с использованием либо сжатого воздуха, либо N 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании портативного воздушного бака, заполнить, по крайней мере 75 пси. Танк потеряет давление воздуха во время инъекций и, возможно, потребуется пополнить; инъекции становятся трудными ниже 40psi. - Включите микроинжектор. Установите время инъекции до 0,17 с и давление до 10-15 пси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точное давление, необходимое будет зависеть от открытия иглы и должны быть определены эмпирически для каждого раунда инъекции и / или новой иглы используется. - Убедитесь, что ручка balance микроинжектора превращается в 0 (обычно полностью против часовой стрелки) и что микроинжектор находится под давлением и в режиме инъекций.
5. Инъекции
- Фильтр около 500 л 10-х инъекционных буфера с помощью шприца 1 мл и 0,45 мкм шприц фильтр.
- Смешайте инъекционные реагенты (детали, которые следуют для инъекции dsRNA подготовлены, как описано в12).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть целесообразным для разработки и выполнения нескольких элементов управления, особенно когда один впервые изучает эту технику. Тыкать яйца без инъекций, инъекционных буфера и красителя в одиночку, или инъекционных буфера и красителя и реагента управления (например, eGFP dsRNA) все хорошие тесты о том, как разрушительные различные элементы протокола инъекций может быть. См Рисунок 3 для живучести ряда различных элементов управления. - Начните с 4 мл dsRNA aliquot.
- Добавьте 0,5 мл отфильтрованного 10-x буфера инъекций в dsRNA aliquot.
- Добавьте 0,5 мл 50 мг/мл Тетраметил родамина Dextran раствор красителя. При работе над рассекающим областью без флуоресценции используйте вместо этого фенол Ред.
- Храните все материалы на льду в течение периода инъекций.
- Загрузите раствор впрыска в инъекционную иглу, используя 20 мл погрузочных наконечников и p10 pipet.
- Нарисуйте раствор для инъекций 1,5 мл и вставьте наконечник нагрузки в широкий конец иглы для инъекций.
- Избавьтесь от раствора как можно дальше в иглу и устраните пузырьки воздуха, мягко щелкнув; будьте осторожны, чтобы не сломать иглу.
- Поместите блюдо из яиц под рассекающим микроскопом и выберите низкое увеличение около 10x (1x увеличение рассматривается через 10x глаз целей).
- Вставьте иглу в инъекционный корпус и затяните.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы игла была правильно и прочно вставлена в корпус. Для этого вытащите широкий конец иглы из металлического корпуса, принося с собой кремниевые трубки в корпусе. Отрегулируйте силиконовые трубки так, чтобы стеклянный конец иглы выступает только за кремнием. Если этого не сделать, кремниевые трубки могут получить ущипнул между стеклом и металлическим корпусом, блокируя конец иглы. - Аккуратно вставьте инъекционный корпус с прикрепленной иглой в микроманипулятор. Будьте в курсе резкого конца иглы и будьте осторожны, чтобы она не наткнулась на поверхности и не сломалась.
- Глядя на яйца и иглу через микроскоп, переместите иглу рядом с яйцами в верхнем левом углу сетки тарелки.
- Нижняя игла, пока кончик входит HBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина буферного раствора в блюде.
- Центр иглы в поле зрения и переместить яйцо блюдо так, что игла на несколько мм ближе к краю блюда, чем яйца.
- Не препятствуйте обзору сетки яиц с помощью иглы.
- Установите микроскоп на фильтр, подходящий для родамина, чтобы можно было наблюдать флуоресценцию в игле и сосредоточиться на кончике иглы.
- На микроинжекторе медленно поверните ручку BALANCE по часовой стрелке до тех пор, пока раствор инъекций не начнет просачиваться из иглы в раствор подвески. Количество баланса на экране микроинжектора начнет увеличиваться, хотя численное значение не имеет значения. Далее, поверните ручку назад против часовой стрелки немного только до тех пор, пока краситель останавливается утечки из иглы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно установить этот баланс каждый раз, когда используется новая игла. Без правильного набора баланса, микроинжектор будет продолжать вводить в течение некоторого времени после инъекции срабатывает. Не исключено даже, что одним нажатием кнопки впрыска с несбалансированной иглой выведет все содержимое заряженной иглы. - С иглой, по центром в поле зрения, переместить яйцо блюдо так, что игла направлена на яйцо, которое будет введено в первую очередь. Рекомендуется, чтобы инъекции начинались в одном углу сетки расположенных яиц, например, в верхнем левом углу.
- Отрегулируйте увеличение примерно до 50x; при этом увеличении, одно яйцо будет заполнить большую часть поля зрения.
- Используйте как микроманипулятор, так и руку на яичной тарелке, чтобы переместить иглу в положение для инъекции.
- Заранее иглы с помощью микроманипулятора и вставить кончик иглы в первое яйцо, чтобы быть введены.
- Вставьте иглу на 20-30% длина яйца от задней (тупой) конце яйца(Рисунок 1E), перпендикулярно длинной оси яйца.
- Введите раствор либо с педалью ноги инъекций, либо с кнопкой впрыска на микроинжекторе. Небольшой болюс флуоресцентного материала внутри яйца будет означать успешную инъекцию(Рисунок 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это не редкость для некоторых желтка, которые будут извлечены из яйца во время инъекции(Рисунок 1F), и это не обязательно означает, что вводили яйцо будет нежизнеспособным. - Вырежай иглу из яйца. Если яйцо непреднамеренно поднял и его хорошо после опрокидки иглы, используйте небольшие щипцы, чтобы подтолкнуть яйцо обратно в его хорошо, втягивая иглу.
- Если игла забивает во время инъекции, удалить иглу из яйца и, сохраняя иглу погружен в HBS плюс 1% пенициллина / стрептомицина раствор, охватывающий яйца, очистить засоренные иглы, используя либо clear функции или путем нажатия инъекций Кнопку.
- Продолжая использовать ту же иглу, повторите процедуру инъекций для как можно больше яиц, как это возможно. Во-первых, это может быть только около 20 или 30 яиц, но увеличится до более чем 100 с практикой.
- Если игла засоряется и не может быть очищена, отбросьте иглу, заполните новую иглу и начните заново (т.е. вернитесь к шагу 5.7).
- Храните блюдо из инъекционных яиц в теплом инкубаторе (23,5-26 градусов по Цельсию), которое слегка влажно (для минимизации испарения) до тех пор, пока эмбрионы не достигнут желаемой стадии развития для анализа.
- По крайней мере, каждые 24 ч, удалить яйца, которые больше не являются жизнеспособными(Рисунок 3A, B), и заменить подвески решение со свежим HBS плюс 1% пенициллин / streptomycin.
- Через два-три дня после инъекции, перенесите яйца нежным пипеткой или с пластиковыми щипцами в бумажные полотенца, увлажненные HBS плюс 1% пенициллина/стрептомицина в крытом чашке Петри, чтобы продолжить развитие в теплом, влажном инкубаторе.
- Мониторинг яйца, и удалить яйца, которые больше не являются жизнеспособными каждый день(Рисунок 3A, B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сверчки легко откладывают яйца во влажный материал, и предоставление адекватного материала, такого как влажный песок или грязь, побуждает их отложить большое количество яиц. Это особенно эффективно, если сверчки сначала лишены яйцекладучий материал для 8-10 ч. Яйца, заложенные в чистый песок, могут быть легко разделены, собраны(рисунок 1B) и помещены в специально разработанные яичные колодцы для инъекций (рисунок1C). Рассекающий микроскоп, микроинжектор и микроманипулятор(рисунок 1A)могут быть использованы для введения отдельных яиц с различными материалами (рисунок1D). Яйца вводятся вблизи заднего конца, в точке примерно 20-30% вдоль передней задней оси(рисунок 1E). Отличить более остроконечный передний конец от более притупленного заднего конца может быть трудно, так как эти различия часто тонкие(рисунок 1E). Роллинг яйцо из стороны в сторону часто помогает выявить, какой конец, который. После удаления инъекционной иглы, яичный желток иногда выбрасывается(рисунок 1F), хотя это, как представляется, не ставит под угрозу здоровье развивающегося эмбриона внутри.
Одним из важнейших шагов в этом протоколе является подготовка смоченных игл. После вытягивать длинние, тонкие иглы они должны быть beveled к углом 20 'и иметь диаметр отверстия 10 м/м (2 мкм). Если диаметр слишком большой, раствор инъекций будет просачиваться из иглы, и эти иглы создадут большие отверстия в яйцах, уменьшая выживаемость. Узкие иглы увеличивают живучесть, но если они слишком узкие, они, как правило, засоряются легко, что делает инъекции медленными и разочаровывающими. С диаметром иглы 10 мкм и 2 мкм, можно вводить свыше 100 яиц с одной иглой, не имея иглы засорить.
Иглы можно сделать с помощью микромясорубки или бевлера(рисунок 2А). Эти единицы оборудования могут быть получены с микроскопом прилагается, или можно было бы добавить расчленения сферы на независимом стенде для моделей, которые не включают микроскоп. Небольшой микроманипулятор держит иглу, которую можно наклонить под нужный угол и опустить на поверхность вращающейся шлифовальной плоскости, которая увлажняется капающей водой. Пример вытащил, но unbeveled иглы можно увидеть на рисунке 2B, и игла с 20 "сковок показан на рисунке 2C. Иглы должны храниться безопасно, чтобы избежать повреждений и быть чистыми(рисунок 2D).
Установка баланса и давления инъекций надлежащим образом на микроинжектор должен позволить придать сопоставимое количество материала в каждое яйцо вводят с той же иглой. Оптимизация впрыска и балансдавления будет необходима при переходе на иглу с другим диаметром. Эта оптимизация позволит максимизировать консистенцию инъекционных импульсов.
Выживаемость является одним из важных параметров для оценки успеха этих экспериментов. Большинство мертвых яиц можно легко определить в поле зрения следующим образом: желток и эмбриональной ткани в яйце начинают слипаться неравномерно(рисунок 3A) и в конечном итоге большая часть желтка будет мигрировать в одну сторону яйца (Рисунок 3B). При оценке после 4-6 дней (эквивалент стадий 8-15)19, больше, чем 85% неинъекционных яиц выжил в то время как яйца вводят с экспериментальными реагентами, как правило, имели более низкую выживаемость(рисунок 3C). Контроль для всех аспектов самой инъекции, включая прокол иглы, введение красителя и буфера, или наличие транспортного средства или dsRNA, требуется для того, чтобы понять истинные последствия экспериментальной манипуляции попытка (Рисунок 3C), В зависимости от экспериментальной манипуляции, более высокий уровень летальности можно ожидать, и, возможно, потребуется изменить сроки проведения асссы или сроки инъекции для того, чтобы оценить любые нелетальные последствия манипуляции.
То, как человек оценивает фенотипические результаты инъекции, зависит от того, что было введено. Например, фенотипические изменения в результате конкретных нокдаунов мРНК могут быть очевидны на уровне брутто анатомии. Например, ген Enhancer zeste (E (z)) обычно подавляет гены Hox, включая Ultrabithorax (Ubx). Инъекционные dsRNA для E(z) сбивает E(z) функции и релизы Ubx подавления, в результате эктопического выражения Ubx. Это приводит к преобразованию пяти пар брюшных придатков (антенна, челюсть, лабий, T1 и T2 ноги) в T3 ноги, как придатки, в связи с дерепрессиями Ubx в этих сегментах20. Во втором примере можно использовать выражение GFP для того, чтобы рассказать об успешном вставке трансгена. Например, когда кДНК, кодирующая ген Histone 2B с тегами eGFP под контролем промоутера G. bimaculatus Actin, была вставлена в геном крикета с помощью piggyBac transposase, стало возможным визуализировать каждое ядро в яйце с помощью флуоресценции, чтобы возбудить eGFP помечены His2B белка(Рисунок 4C,D). При этом можно было следить за движением ядерс течением времени 7.
| Название решения | Компоненты | Комментарии/Описание |
| 10x Решение буфера для инъекций | В 1 L H2O добавить: 0,8 г NaCl, 0,09 г Na2HPO4, 0,04 г KH2PO4, 2,98 г KCl | Храните запас при 4 градусах по Цельсию. Фильтр небольшое количество непосредственно перед использованием с 1 мл шприц оснащен 0,45 мкм шприц фильтр. Повторите по мере необходимости, чтобы отфильтровать около 500 л инъекционного раствора. Храните отфильтрованное решение для инъекций на льду в течение всего эксперимента. |
| HEPES буферный солен | В 1 L H2O, добавить: 8,77 г NaCl, 5,2 г HEPES, | рН до 7,0 и хранить при 4 градусах Цельсия. |
| Тетраметил Родамин Dextran (10000 МВт) красителя запас решение | Родамин краситель от термофишер | Этот краситель часто продается как лиофилизированный порошок. В этом случае составьте запасраствор 50 мг/мл с водой. Центрифуга при 12000 х г в течение 5 мин, чтобы удалить любые нерастворимые частицы. Соберите супернатант после центрифугации, избегая каких-либо твердых частиц в нижней части трубки, aliquot и заморозить при -20 градусов по Цельсию. Фондовые aliquots в использовании могут храниться при 4 градусах По Цельсию в течение одной-двух недель. Избегайте замораживания оттаивания aliquots несколько раз. Если иглы засорения из-за красителя, краситель также может быть отфильтровался через Whatman #2 фильтровальной бумаги. |
Таблица 1: Рецепты решений и заметки.
Рисунок 1: Обзор протокола инъекций яйцеклеток. (A) Типичная установка, которая может быть использована для инъекций яйцеклеток. (B) Яйца отделены от песка через сито. (C) Яйца проводятся для инъекций в небольших колодцах, сделанные путем размещения плесени в теплый, жидкий агароз. (D) Флуоресценция в игле и в пяти вводили яйца можно увидеть через флуоресцентный рассечение микроскопа. (E) Невпрятое яйцо. Передний конец (слегка заостренный; левый) и задний (более притупленный; правый) отличаются друг от друга. Область, наиболее подходящую для инъекций, вблизи заднего конца, показана с помощью кронштейна. (F) Яйцо через два дня после инъекции. Место инъекции видно как небольшое обесцвечивание, и небольшое количество исключенного желтка очевидно (стрелка). Шкала баров No 1 мм (D); 0,5 мм (E и F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Иглы смягчаются с помощью микромясорубки или бевеллера. (A) Пример микро шлифовальной машины с круглой, вращающейся шлифовальной поверхностью, увлажненной капающей водой RO (вода капает из шприца, показанного в верхней части изображения). (B) Перед beveling, вытащил иглы длинные и узкие. (C) После того, как выскакивая до 20 ", резкое введение иглы создается. Обратите внимание на диаметр 10 мкм внутреннего просвета. (Красные бары масштаба - 10 мкм). (D) Вытащил, скошенные иглы могут храниться в чашке Петри с крышкой и удерживается на месте с помощью зубного воска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Инъекции могут снизить уровень выживаемости. (A) Мертвые и умирающие яйца очевидны при визуальном осмотре. (B) Со временем материал будет мигрировать в одну сторону яйца. (C) Сравнение показателей выживаемости через четыре-шесть дней после откладки яйцеклеток для различных условий, в том числе: неинъекционные яйца (n No 6 экспериментов); яйца проколоты иглой 9 мкм, но не впрыскиваются (n no 2 эксперименты); яйца, вводимые буфером и красителями (n No 13 экспериментов); яйца, вводимые с буфером, краситель, и плазмидный вектор (n No 2 экспериментов); яйца, вводимые с буфером, красителями и DMSO (n No 11 экспериментов); и яйца вводят с буфером, красителя, и контроля dsRNA (n No 22 экспериментов). Тип контроля dsRNA используется включены dsRNA против eGFP или dsRed. Цифры в основании каждого бара отметить общее количество выживших яиц / общее количество яиц, используемых для каждого состояния. Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего значения. Шкала бар 1 мм (A и B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Оценка результатов инъекций. (A-B) Инъекция Enhancer из Зесте (Z)) dsRNA изменяет нормальное выражение Ubx mRNA (дикий тип показано в (A) и приводит к преобразованию антенн (AN) и ротовых полотен (Mx, Lb) в ноги, как придатки (B). (C-D) Инъекции ранних яйцеклеток с транспозируемым элементом piggyBac и histone2B-eGFP производят трансгенные эмбрионы, выражающие GFP во всех ядрах. Расположение ядер можно наблюдать 8 ч послеоткладки яйца (C ) и 20 ч после откладки яйцеклеток (D ). Аббревиаты: Антенна; Mx и челюсть; Lb й лабий; T1-3 - грудные ножки от 1 до 3; РНК и РНК-интерференции; Гб и Г. бимакулат; Акт и актин; H2B - Хистон H2B; GFP - зеленый флуоресцентный белок. Шкала баров - 200 мкм (А и В); 500 мкм (E и F). Эти экспериментальные результаты были первоначально описаны в другом месте7,20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Двумя основными проблемами с этой техникой являются связанные с этим вопросы оптимального размера иглы и живучести. Хотя меньшие иглы улучшить живучесть, иглы с более узкими люминесцентными имеют большую степень капиллярных сил на работе, что делает его более вероятным, что желток будет двигаться в иглу заставляя его засорить. В лучшем случае, завалы могут быть очищены просто путем введения другого яйца или путем очистки иглы, как описано выше. Можно также попытаться увеличить давление баланса на микроинжектор, пока желток выталкивается из иглы. Другой серьезной проблемой с этой техникой является живучесть. В наших руках, выживаемость для яиц, вводимых с экспериментальными решениями, как правило, между 40 и 80%. Выживаемость может быть как низко как 10% для тех, кто начинает изучать эту технику, но улучшится с практикой. Отрицательные элементы управления, как описано выше, имеют важное значение для исследователей, чтобы точно оценить изменения в выживаемости с практикой, учитывая, что введение различных материалов может снизить выживаемость(Рисунок 3C).
Сроки инъекций является важным фактором для каждого экспериментального подхода, а также. Более старые яичка более трудны для того чтобы впрыснуть чем более молодые одни, и вообще, тарифы выживания более высоки когда впрыскивать более молодые довольно чем более старые яичка. Введение иглы и инъекционного материала на более поздних стадиях может привести к непреднамеренному анатомическому повреждению. С опытом, однако, инъекция двух-трехдневных старых яиц возможно. Ориентация на тонкую сторону яйцеклетки на этих стадиях помогает избежать повреждения эмбриона, который впервые образуется на брюшной стороне. Ориентация на задний конец может увеличить доступ реагента к первым ядерным делениям и образованию зародышевой полосы, которые происходят вблизи этого конца яйца19,21. Если кто-то пытается манипулировать геномом, с целью достижения либо широко распространенной соматической или зародышевой передачи изменения генома, инъекции должны быть выполнены до клетчатки, которая начинается примерно 14 ч после откладкияйца 19 . Если инъекционные dsRNA нокдаун мРНК уровнях, временное окно для инъекций должно быть определено на основе того, как на ранних стадиях развития один хочет сбить ген интереса. Хотя эффекты РНК, вероятно, длятся в течение некоторого времени, dsRNA должна быть введена до того времени, когда один планирует оценить любые изменения в фенотипе. Отслеживание времени, прошедшего во время инъекций, и прогрессирование эмбрионального развития может иметь важное значение для обеспечения правильной стадии яйцеклеток вводятся. Независимо от того, какой материал вводится, задержки развития после инъекции являются общими, хотя степень задержки может варьироваться в зависимости от инъекций.
Представленный здесь протокол опирается на ряд относительно дорогостоящих единиц оборудования. Это должно быть возможно, однако, вводить яйца успешно без использования некоторых или даже всех этих элементов. Например, есть целый ряд микроинжекторов на рынке, и некоторые из них могут быть дешевле, чем тот, который предлагается в таблице материалов. Также можно просто использовать шприц для введения соответствующего количества материала, хотя для этого потребуется некоторая практика. Вместо дорогого микроманипулятора, можно было бы использовать различные материалы, чтобы держать иглу устойчивым и позволяют медленно, контролируемый заранее, и простой дизайн пластилина был использован другими22. Это также может быть возможным, чтобы избежать использования beveller, хотя в нашем опыте надлежащего beveling может иметь огромное значение для успеха инъекций. Это может быть возможным, чтобы заточить вытащил иглы, перетащив кончик иглы вручную через лучшие песчаной бумаги, оценивая этот процесс под микроскопом. Несмотря на это, заточенные иглы сделают инъекции легче и улучшить живучесть.
Этот метод инъекций является гибким и может быть использован для различных манипуляций. Здесь мы показали результаты для dsRNA и piggyBac-зависимых экспериментов геномной модификации, но это также можно использовать CRISPR / Cas или другие подходы с этой техникой. В экспериментах, включенных здесь, в результате фенотипы были очевидны и легко оценить. Некоторые эксперименты могут потребовать использования иммуногистохимии или других инструментов визуализации для того, чтобы увидеть последствия экспериментальных манипуляций. Одной из альтернатив инъекциям является использование электропорации, которая может быть использована для внедрения ДНК или других макромолекулв в клетки и ткани in vivo. Электропорация может быть использована в старых яйцах крикет, где эмбрионы уже сформировались для того, чтобы целевые конкретные регионы8, но инъекции более полезны, когда эксперимент требует, чтобы весь развивающийся эмбрион ориентирован. Этот метод инъекций также должен быть легко адаптируется для использования в яйцах от различных гемиметаболических и голометаболических насекомых, в идеале улучшая способность проводить значимые сравнительные исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследования, о которых сообщалось в рамках этого проекта, были поддержаны премией институционального развития (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантом P20GM10342 до HH3, а также номером премии NSF IOS-1257217 Цгэ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | |
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | |
| Tubing to connect air source to microinjector | |||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic |
| Microwave | various | ||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26 °C are needed. | |
| Cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | |
| Cricket water | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | |
| Cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100 mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90 mm diameter |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 - 1.0 mm |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118 mm |
| Syringe filters, 25 mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 mL syringe |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20 μL Microloader |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | |
| 20x objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | |
| Camera | Leica | DMC 5400 | |
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. Cricket neurobiology and behavior. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , Springer. Tokyo. (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. Developmental Biology. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
