Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

التحليل التجريبي لأحاطه الخلايا الشحمية بواسطة الضامة

Published: May 24, 2019 doi: 10.3791/59731
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunology, Allergy, and Rheumatology, Department of Internal Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لاعداد الخلايا الدهنية والضامة البريتونية وتحليل كفاءه افيروسيتوسيس والمثبطة المحددة بوساطة عرقله الخلايا الدهنية أحاطه. هذا البروتوكول لديه تطبيق واسعه في الخلية بوساطة أزاله الجزيئات الأخرى بما في ذلك الخرز الاصطناعي والبكتيريا.

Abstract

الخلية المبرمج هو عمليه طبيعيه ويلعب دورا حاسما في التنمية الجنينية ، وتنظيم التماثل ، والحث التسامح المناعي ، وحل التهاب. تراكم الحطام ابوتوتيك في الجسم قد يؤدي إلى الاستجابات التهابيه المزمنة التي تؤدي إلى امراض المناعة الذاتية الجهازية مع مرور الوقت. تم التورط في أزاله الخلايا الميتة المصابة بامراض المناعة الذاتية. أزاله ابوتوتيك هي عمليه معقده نادرا ما يتم الكشف عنها في ظل الظروف الفسيولوجية. انه ينطوي علي المستقبلات السطحية وفيرة واشاره جزيئات. دراسة عمليه أزاله الخلايا ابوتوتيك يوفر أليات الجزيئية الثاقبة والاستجابات البيولوجية اللاحقة ، والتي قد تؤدي إلى تطوير التداوي الجديدة. هنا ، ونحن وصف بروتوكولات لتحريض الخلايا الدهنية ، واعداد الضامة البريتوني ، وتحليل أزاله الخلايا ابوتوتيك عن طريق تدفق الخلوي والمجهر. وسوف تخضع جميع الخلايا المبرمج في مرحله معينه ، والعديد من الخلايا السكنية والمنتشرة يمكن امتصاص الحطام ابوتوتيك. ولذلك ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا في العديد من التطبيقات لتوصيف ربط الخلية ابوتوتيك والابتلاع بواسطة العديد من أنواع الخلايا الأخرى.

Introduction

جسمنا يولد 1-10 مليار خليه ابوتوتيك علي أساس يومي. يجب مسح مثل هذا العدد الكبير من الخلايا ابوتوتيك بطريقه ان الاستجابات المناعية لا تزال هادئه. لضمان أزاله الخلايا ابوتوتيك في الوقت المناسب ، وأنواع عديده من الخلايا المقيمة الانسجه والخلايا المتداولة تطوير أليات لابتلاع الخلايا ابوتوتيك1. وقد تورط تنظيم مختلة من موت الخلايا المبرمج في بداية وتطور مختلف الامراض التهابيه والحصانة الذاتية2. المبرمج أيضا يلعب دورا حاسما في التسبب في تطور السرطان ومقاومتها اللاحقة للعلاجات التقليدية3,4. أزاله الخلايا ابوتوتيك عموما يعزز استجابه مضاده للالتهابات ، والتي قد تكون مرتبطة بالتسامح المناعي5. اضطرابات أزاله الخلايا ابوتوتيك يدفع التمنيع الذاتي ويساهم في تطوير امراض المناعة المناعية الجهازية في كل من البشر والفئران6.

عندما الخلايا الخضوع للخلايا المبرمج, انها تعرض فوسفاتيديلسيرين (PtdSer) من النشرة الداخلية إلى النشرة الخارجية لغشاء. ثم سيتم التعرف علي PtdSer من قبل الخلايا الشحمية من خلال مستقبلات السطح. وقد تم تحديد أكثر من اثني عشر مستقبلا للاعتراف و/أو تسهيل أحاطه الخلايا الميتة. بشكل عام ، هناك ما لا يقل عن ثلاثه أنواع من المستقبلات السطحية المشاركة في أزاله الخلايا ابوتوتيك: مستقبلات الربط ، والتعرف علي الخلايا ابوتوتيك. المستقبلات دغدغه ، والشروع في أحاطه ؛ المستقبلات المشقوقة ، وتسهيل العملية برمتها7. [تام] مستقبلات [تيروزين] [كيناسيس] ([تام] [رتكس]) يتالف [ر] [ترو-3], [اكس], و [م] وعبر عن في الدرجة الاولي ب [ميلينويد] خلايا من ال [ايمون سستم]8. الوظيفة الرئيسية لل RTKs تام هو ان تكون بمثابه مستقبلات الربط ، وتسهيل أزاله الفاغميه من الخلايا ابوتوتيك والحطام. وقد درست مجموعتنا تام بوساطة أزاله الخلايا ابوتوتيك في وضع المناعة الذاتية لسنوات عديده. نمو البروتين المعتمدة علي فيتامين ك القبض علي بروتين محدد 6 (Gas6) والبروتين S (الإيجابيات) بربط وينشط مستقبلات تام9,10. يتم إنتاج Gas6 في القلب والكلي والرئتين. يتم إنتاج الإيجابيات أساسا في الكبد11. يدرك تام من الخلايا ابوتوتيك في مثل هذه الطريقة ان N-الطرفية من Gas6/الإيجابيات بربط PtdSer علي خليه ابوتوتيك والطرفية C من Gas6/الإيجابيات بربط مستقبلات تام التي ترتكز علي سطح الخلايا الشحمية. بالاضافه إلى المستقبلات الأخرى ، يحدث أحاطه الخلايا الميتة12. علي الرغم من ان مير يمكن ربط كل من الإيجابيات يغاندس و Gas6 ، وجدنا ان Gas6 يبدو ان الحرف الوحيد لالبلعمه مير بوساطة الضامة من الخلايا ابوتوتيك ، والتي يمكن حظرها من قبل المضادة--مير الأضداد13. الضامة هي البالعات المهنية. التخليص السريع للخلايا ابوتوتيك من قبل الضامة مهم لتثبيط التهاب والاستجابات المناعية الذاتية ضد المستضدات داخل الخلايا. مستقبلات مير التيروزين كيناز أمر بالغ الاهميه لأحاطه الضامة والتخليص الفعال للخلايا ابوتوتيك14. في الطحال الفار ، ويعبر مير أساسا علي المنطقة الهامشية والضامة الجسم ملموسه13.

يصف البروتوكول المعروض هنا أسلوبا أساسيا للحث علي الخلايا المبرمجة للخلايا ويوضح طرق قياس العملية وكفاءه افيروسيتوسيس. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهوله لدراسة الافيروسيتوسيس من قبل أنواع الخلايا الأخرى في أحاطه خلايا ابوتوتيك من أصول مختلفه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تربيه الفئران التجريبية والحفاظ عليها في مستعمره الفئران لدينا. وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية للرعاية والاستخدام الحيواني (IACUC) التابعة لجامعه سينسيناتي.

1. اعداد CFSE المسمية الخلايا الدهنية ثيتوتيك

  1. موت ببطء اثنين من الفئران الساذجة C57/B6 بواسطة CO2 استنشاق لمده 10 دقيقه وتشريح لفتح تجويف الصدر ، وأزاله (سحب) الغدة الصعتريه مع ملقط غرامه الطرف المنحني في الانسجه ثقافة بتري طبق يحتوي علي 10 مل من RPMI1640 المتوسطة.
  2. الحصول علي تعليق خليه واحده عن طريق طحن الغدة الصعتريه كله ضد اثنين من نهايات متجمد من الشرائح المجهر ومن ثم تصفيه التعليق من خلال 100 μm مصفاه الخلية.
  3. جمع 10 مل تعليق الغدة الصعتريه في أنبوب 50 mL والطرد المركزي في 300 x ز لمده 5 دقائق.
  4. أزاله supernatant ، أعاده التعليق في 40 mL من 1x تلفزيوني ، والعد أرقام الخلايا مع مقياس الكريات الدموية.
  5. الطرد المركزي في 300 x ز ل 5 دقيقه وأزاله supernatant.
  6. أعاده التعليق في 20 مل من 1x تلفزيوني في أنبوب 50 mL كتعليق خليه واحده مع ما يصل إلى 2 × 108 الخلايا (إذا كان أكثر من 2 × 108 خلايا ، أعاده تعليق بقية الخلايا في آخر 20 مل من 1 × تلفزيوني في أنبوب مختلف 50 ml).
  7. جعل 5 μM من CFSE في حجم متساو (20 مل) من 1x تلفزيوني في أنبوب منفصل 50 mL عن طريق التنضيد 40 μL من محلول الأسهم CFSE (2.5 mM) في 20 مل من 1x تلفزيوني وتخلط جيدا عن طريق عكس الأنبوب 2-3 مرات.
  8. أضافه 20 مل من CFSE من الخطوة 1.7 إلى 20 مل من تعليق الخلية من الخطوة 1.6 (التركيز النهائي من CFSE هو الآن 2.5 μM).
    ملاحظه: لكل تعليق الخلية 20 مل ، وهناك حاجه إلى 20 مل من أنبوب CFSE.
  9. عكس الخلية وخليط CFSE أنبوب 2-3 مرات واحتضان الخليط في الظلام في درجه حرارة الغرفة لمده أقصاها 2 دقيقه ، ثم وقف رد الفعل عن طريق أضافه 10 مل من مصل الحصان الحرارة المعطلة.
  10. الطرد المركزي الخليط أنبوب 50 mL في 300 x ز ل 5 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: إذا كانت العلامات CFSE ناجحه ، سوف تصبح الخلية بيليه الضوء الأصفر في اللون.
  11. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق علي بيليه الخلية في 40 mL من 1x تلفزيوني وأرقام الخلايا العد مع مقياس الكريات الدموية.
  12. الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 x ز ل 5 دقيقه وتجاهل supernatant.
  13. يغسل الخلية بيليه مره أخرى مع 40 mL من RPMI1640 المتوسطة.
  14. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا مع RPMI1640 الانسجه الثقافة المتوسطة (RPMI1640 ، 20 مم hepes ، 10 ٪ (الحرارة المعطلة) ، 20 مم الجلوتامين ، و 1x القلم/العقديات) بتركيز 7 × 106 خلايا/مل في صحن ثقافة الانسجه مم 100.
    ملاحظه: إذا تم الحصول علي المزيد من الخلايا ، ستكون هناك حاجه إلى طبق منفصل للثقافة النسيجية 100 ملم.
  15. أضافه ستوروبوروين في ثقافة تعليق الخلية في تركيز النهائي من 1 μM والثقافة ل 4 ح في 37 درجه مئوية في حاضنه ثقافة الانسجه الموردة مع 5% CO2.

2. اعداد الضامة الصفاقي

  1. حقن اثنين من الفئران C57B6 (أو اي الفئران التلاعب الجينات في المختبر) داخل الصفاق مع 1 مل من 3% الذين تتراوح أعمارهم بين ثيوغليتيجمع في اليوم 0.
  2. موت ببطء الفئران في اليوم 5 كما في الخطوة 1.1 ، وقطع وقشر فتح الجلد في البطن ولكن ترك الصفاق سليمه. مسح التجويف البريتوني عن طريق دفع بسرعة 10 مل من العازلة غسل (RPMI1640 ، 2 ٪ ، 0.04 ٪ أدتا) في التجويف البريتوني باستخدام حقنه 10 مل مرفقه مع ابره 18 غرام.
  3. استرداد المخزن المؤقت يغسل ببطء مع نفس الابره/حقنه ، وجمع العازلة يغسل في أنبوب 50 mL (التفاصيل تشير إلى المادة المختبر Janssen15).
  4. غسل أنبوبي البريتوني مرتين مع 1x تلفزيوني, أعاده تعليق الضامة البريتوني في RPMI1640 الانسجه ثقافة المتوسطة في كثافة 2 × 106 خلايا/مل و قسامه 500 μl في كل بئر من لوحه 24 بئر. اترك الصحن في حاضنه لزراعه الانسجه لمده 2 ساعة.
  5. أزاله الخلايا العائمة عن طريق الشفط واستبدال مع 500 μL من الثقافة الطازجة المتوسطة ، مرتين.
  6. بشكل اختياري ، أضافه مثبطات تيروزين مستقبلات TAM ، RXDX-106 ، في تركيزات المشار اليها في الأساطير الرقم في كل بئر من ثقافة الضامة واحتضان لأخر 2 ح.

3. شارك في الثقافة الضامة البريتوني مع الخلايا الدهنية

  1. جمع الخلايا الميتة من الخطوة 1 ويغسل ثلاث مرات مع RPMI1640 المتوسطة. ويمكن قياس كفاءه الحث ابوتوتيك في هذه المرحلة مع المرفق الخامس/7-عاد عده.
  2. توزيع 0-12 x 106 خلايا (في 500 μl المتوسطة) في كل بئر من الثقافات الضامة من #2 البروتوكول ، وفقا للترتيب التجريبي (علي سبيل المثال ، انظر الشكل 1). وهذا يجعل حجم الثقافة كله من 1 مل في كل بئر من لوحه 24 بئر. أضافه الأجسام المضادة حظر في الثقافة مباشره قبل أضافه الخلايا الدهنية.
  3. ثقافة الخلية خليط في 37 [ك] ل 4 [ه] في نسيج ثقافة حاضنه يزود مع 5% [كو]2.
  4. غسل كل بئر من الثقافة مع 1x تلفزيوني (تحتوي علي 500 μM أدتا) مرتين لأزاله الخلايا الحرة العائمة ابوتوتيك.
  5. وصمه عار الضامة لوحه ملزمه مع CD11b في هذه المرحلة.
    1. غسل الضامة لوحه منضم مع العازلة تلطيخ (1x تلفزيوني ، 1 ٪ بوسني) مره واحده.
    2. أضافه 200 μL من تلطيخ العازلة التي تحتوي علي 2 μL CD11b في كل بئر.
    3. احتضان لوحه في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
    4. اغسل كل بئر من لوحه ثلاث مرات مع العازلة تلطيخ.
    5. أضافه 200 μL من تلطيخ العازلة والمضي قدما في لوحه لتحليل الصور تحت المجهر الفلورسنت.
  6. بدلا من ذلك ، فصل الضامة لوحه منضمة باضافه 1 مل من ليدوكائين 1 ٪ في التلفزيونية واحتضان لمده 10 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  7. افصل الضامة ذات اللوحة المنضمة باستخدام الأنابيب المتكررة.
  8. نقل الضامة التعليق إلى 5 مل الفردية جولة أسفل أنبوب FACS من كل بئر من لوحه 24 بئر.
  9. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  10. أزاله ماده طافي وأضافه 200 μl من تلطيخ العازلة التي تحتوي علي 2 μl من CD11b (1:200 التخفيف في تلطيخ العازلة).
  11. احتضان تعليق الخلية في العازلة تلطيخ في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
  12. غسل تعليق الخلية مرتين مع العازلة تلطيخ.
  13. أضافه 200 μL من تلطيخ العازلة والمضي قدما لتحليل FACS مع تدفق المضخم وتحليل لنسبه مئوية من الضامة الايجابيه CFSE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحليل أحاطه الضامة البريتوني من الخلايا الدهنية. وقد أعدت الضامة البريتوني والخلايا ابوتوتيك وشارك في استزراع كما هو موضح في البروتوكول. وفصلت الضامة وملطخه PE المضادة لCD11b الجسم لمده 20 دقيقه علي الجليد. ثم تم غسل الضامة ومعالجتها في تدفق الخلوي. كما راينا, لا يوجد الضامة الايجابيه CFSE في الربع السفلي الأيمن عندما لم يتم أضافه اي خلايا ابوتوتيك في الثقافة (الشكل 1ا والشكل 2, اللوحة الاولي). ثغليتيجمع-الضامة البريتوني المحفزة لديها القدرة المتغيرة لابتلاع الخلايا ابوتوتيك. وأظهرت ما يصل إلى 30 ٪ من الضامة ايجابيه في قناه CFSE ، مشيرا إلى انها قد بلعها الخلايا ابوتوتيك المسمية CFSE في هذه التجربة (الشكل 1). ومن الجدير ان نلاحظ ان CFSE الضامة الايجابيه انتشرت في الربع الأيمن السفلي بسبب كثافة مختلفه ، مشيرا إلى ان عدد الخلايا ابوتوتيك داخل الضامة مختلفه. ولذلك ، الرصد المجهري لأحاطه الضامة من الخلايا ابوتوتيك أمر ضروري للتحقيق في قدره الضامة لاستيعاب الخلايا ابوتوتيك (الشكل 2). نسبه اعلي من الخلايا ابوتوتيك إلى الضامة ليس فقط يزيد من عدد الضامة تناول الخلايا ابوتوتيك ولكن أيضا يعزز قدره الضامة لاستيعاب المزيد من الخلايا ابوتوتيك (الشكل 2).

تثبيط تعتمد علي الجرعة من افيروسيتوسيس بواسطة انسداد مير.
في مجموعه أخرى من التجارب ، وجدنا ان حوالي 15 ٪ من الضامة أصبحت cfse ايجابيه عندما تمت أضافه الخلايا الدهنية المسمية cfse (التموينية من 6:1) إلى الثقافة الضامة لمده 4 ساعات ، مما يدل علي انها الضامة أكله (الشكل 3 ب). وظيفة واحده من مير علي الضامة هو التعرف علي والتوسط في كثرة الخلايا الخلوية عن طريق جزيء سد ، Gas6. لاختبار النسبة المئوية لافيروسيتوسيس المنسوبة من قبل تثبيط مير ، أضفنا مضادات المير إلى الثقافة لمنع افيروسيتوسيس بوساطة مير. الأجسام المضادة افيروسيتوسيس كتل الضامة بطريقه تعتمد علي الجرعة (الشكل 3ج، الشكل 3د) والانسداد الكلي قد يمثل حوالي 30 ٪ من كفاءه الافيروسيتوسيس في الاعداد الحالي (الشكل3) , وأكدت هذه البيانات أيضا في دراستنا السابقة مع مير الضامة المغلوب13. ثم اختبرنا كفاءه تثبيط مع هيئه الاغذيه والعقاقير المعتمدة حديثا المانع مستقبلات تام, RXDX-106, الذي يمنع جميع مستقبلات تام مع التقارب المختلفة (أكسل > > Tyro3 > مير). تمت أضافه RXDX-106 إلى ثقافة الضامة 2 ساعات قبل المشاركة في الاحتضان مع الخلايا الدهنية. كما هو مبين في الشكل 4، rxdx-106 تثبيط الضامة افيروسيتوسيس بطريقه تعتمد علي الجرعة. كان تركيز تثبيط المشبعة حوالي 100 nM (الشكل 4، خط الصلبة) ، وهو التركيز الذي يبدو أكثر فعاليه من مير-عوز (الشكل 4 خط منقط) أو الأجسام المضادة مير (الشكل 3، لوحه D) وحدها. منذ الضام يعبر عن جميع المستقبلات تام الثلاثة علي السطح16، فمن المتوقع ان نري ان تركيزات اعلي من RXDX-106 (أكثر من 100 nM) سيتم حظر جميع المستقبلات الثلاثة ، التالي ، سوف تكون أكثر فعاليه في منع افيروسيتوسيس من استهداف مستقبلات تامه واحده ، مير.

Figure 1
الشكل 1 . النسبة المئوية من كثرة كثرة الخلايا الصباغية من قبل الضامة البريتوني. وكانت الخلايا الدهنية المستحثة من قبل الاحتضان مع 1 ملم من ستوروبورنين لمده 4 ساعات وأضيفت إلى الثقافة الضامة في نسبه كما هو مبين في لوحات الشكل: (ا) 1:0 ؛ (ب) 1:1 ؛ (ج) 1:2 ؛ (د) 1:4 ؛ (ه) 1:6 ؛ (و) 1:8 ؛ (ز) 1:10 ؛ (ح) 1:12. تم الحصول علي البيانات باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تم تحليل النسبة المئوية من الضامة أكله باستخدام البرنامج المرتبطة تدفق المضخم. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . التحليل المجهري لافيروسيتوسيس. وقد أعدت افيروسيتوسيس كما في الشكل 1. تم تلطيخ الضامة phagocytic في الموقع علي لوحه مع CD11b ، الثابتة مع بارافورمالدهيد ، وتقييمها. تم الحصول علي الصور باستخدام المجهر الفلورسنت وتحليلها مع البرنامج المرتبط بالمجهر. وتم توسيع الادراج التمثيلية رقميا وعرضها أدناه في كل صوره. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . تثبيط الضامة البريتوني افيروسيتوسيس بواسطة الأجسام المضادة لل Mer. وقد أعدت خلايا ابوتوتيك وشارك في استزراع مع الضامة ل 4 ح كما هو موضح في البروتوكول. تمت أضافه مكافحه مير Ab إلى ثقافة الضامة مباشره قبل الثقافة المشتركة مع الخلايا ابوتوتيك. ثم تم فصل الضامة phagocytic وملطخه المضادة--الماوس CD11b-PE الأضداد علي الجليد لمده 20 دقيقه. وتم الحصول علي البيانات وتحليلها كما في الشكل 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . RXDX-106 بوساطة تثبيط افيروسيتوسيس الضامة. تم إنشاء افيروسيتوسيس كما هو موضح في الشكل 3. تم أضافه RXDX-106 قبل ساعتين من الثقافة المشتركة مع الخلايا الدهنية. [مر-فير] [بلبلسن] الصفاقي كان أعدت بالمثل وخدم كالتحكم مجموعه. تم الحصول علي البيانات والنسبة المئوية من الضامة التي تم بوابات علي CD11b خلايا ايجابيه وتحليلها باستخدام البرمجيات تدفق الخلوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المبرمج هو عمليه الموت خليه المحفوظة للغاية التي تنطوي علي العديد من الشلالات اشاره ويدفع التعبير البروتين, إفراز, والنقل. المبرمج غالبا ما يرتبط مع التغيرات المورفولوجية الخلوية17. الخلايا ابوتوتيك الإفراج بنشاط السايتوكينات والكيميائية التي تجذب البالعات للهجرة إلى الموقع والشروع في عمليه أحاطه ، مسار معقد للغاية تحت سيطرة مشدده18. من ناحية أخرى ، وفاه الخلايا الميتة تطلق إشارات الخطر التي تحفز الاستجابات التهابيه1. والتطهير المعيب أو لفتره طويلة من الخلايا ابوتوتيك يؤدي إلى نخر الثانوي من هذه الخلايا19. لذلك ، التوقيت في الحث المبرمج هو حرج جدا في التجربة. هناك العديد من الطرق للحث علي الخلايا المبرمج20. ومع ذلك ، فان مده وقوه الاستقراء هي نوع الخلية التابعة. نوصي باعداد تجربه المعايرة بالنسبة للمعايرة لتحديد الحالة المثلي للحد الأقصى (90-95%) إنتاج المبرمج. تم استخدام الملحق-V/7-عاد الكشف ابوتوتيك كيت واتبعت التعليمات في مختبرنا لتقييم الكفاءة ابوتوتيك. وقد حاول مختبرنا طريقتين مختلفتين للحث علي الخلايا المبرمجة في الماضي. ويبدو ان أشعه غاما هي طريقه أفضل ، لأنها لا تحتوي علي بقايا كيميائية في الثقافة ولا تفضي الا إلى عدد قليل من وفيات الخلايا الميتة. نحن فضح البويضات إلى 500 راد من الإشعاع ز تليها ثقافة 4-ح في RPMI1640 المتوسطة. لاحظنا حوالي 95 ٪ من الخلايا الدهنية الميتة13. عندما لا يتوفر المبرد ، ونحن المستحثة الخلايا الدهنية للخضوع لموت الخلايا مع 1 μM من ستوروبورنين في الثقافة لمده 4 ساعات (الخطوة 1.15). الخلايا الاساسيه عموما أكثر حساسية للاستقراء المبرمج. كما يلزم اتخاذ خطوات غسل واسعه لأزاله المواد الكيميائية من الثقافة قبل المشاركة في الثقافة مع البالعات. هناك العديد من الطرق لتسميه خلايا ابوتوتيك. علي الرغم من ان السمية ارتبطت بتركيز عال ، فان CFSE يتم الاحتفاظ بها بكفاءة عاليه داخل السيتوبلاسما عند الأمثل بعناية21. pHrodo هو صبغه حساسة للحمض ، والذي يزيد في فلوري كما يقلل من درجه الحموضة في البيئة. نظرا لانخفاض درجه الحموضة من phagolysosome ، يمكن تمييزها بسهوله الخلايا ابوتوتيك الخاصة بها من المرفقة جسديا ولكن لا غمرت الخلايا ابوتوتيك في الفحص22.

العديد من المستقبلات السطحية (مستقبلات تام ، مستقبلات الأنف ، التكاملات (CD11b/CD18) ، مستقبلات زبال ، مستقبلات Fc ، وآخرون) السماح للخلايا لتمييز النفس من مسببات الامراض وتمييز الاستجابات اللاحقة23. مستقبلات مختلفه تعمل معا لإنهاء عمليه معقده نوعا ما. حجب مستقبلات (ق) المحتمل ان يؤدي إلى تثبيط جزئي من كثرة الكريات. يمكن اعداد الضامة الابتدائية من موارد مختلفه مع أساليب مختلفه (نخاع العظم المشتقة الضامة ، الضامة البريتوني ، الضامة الطحال ، وآخرون.). ميزه الضامة التي يسببها ثيوغليفتيك هو النمط الظاهري المشوهة من الضامة. العيب هو ان ثيغليتيليس يحتاج إلى ان يكون المسنين في الظلام لمده 3 أشهر علي الأقل. ومع ذلك ، فان محلول ثيوجليتيليس له عمر افتراضي 2 سنه. وينبغي للمخزون الثابت من الحل ان يتغلب علي هذا العيب. في اعداد الضامة البريتوني ، ينبغي ان كميه ضئيله من خلايا الدم الحمراء في جمع الضامة البريتوني لا تؤثر علي التجربة ، لأنها تسير ليتم غسلها بعيدا مع الخلايا العائمة بعد 2 ح من الثقافة الضامة. وهناك كميه كبيره من خلايا الدم الحمراء (بيليه مرئية) قد تتطلب العلاج مع ACK ليسينج العازلة. الضامة تميل إلى التمسك باحكام علي سطح الثقافة. وقد استشهد أساليب مختلفه في الأدبيات لفصل خلايا التصاق من السطح24. وتؤدي المفرزة القائمة علي الانزيمات إلى اعلي مستويات استعاده الخلايا ولكنها قد تضر بمستقبلات السطح ، وتضعف وظيفة الخلايا والتحاليل المرتبطة بها. قد يؤثر تغيير المستقبلات السطحية أيضا علي تحليل التدفق الخلوي القائم علي المستقبلات. يسبب ليدوكائين شكل الخلية لتغيير إلى التشكيل كرويه أكثر بسبب الحصار من قنوات أيون الكالسيوم25. هذا هو أفضل وسيله لفصل الضامة من السطح مع اي ضرر ملحوظ في تجربتنا.

الضامة التي تحتوي علي خلايا ابوتوتيك يمكن تحليلها عن طريق القياسات الخلوية القائمة علي التدفق أو المجهر. يمكن تطبيق FACS لتحليل عدد كبير من الخلايا في وقت قصير ، ويمكن كذلك تحديد الأنواع الفرعية للخلايا عن طريق تلطيخ التفاضلية مع الأجسام المضادة ضد سطح معين أو البروتينات السيتوبلازمية. ويمكن أيضا ان يحدد التركيز الأمثل (نسبه) من أرقام الخلايا ابوتوتيك في نظام الثقافة المشتركة من قبل تحليل FACS. التحليل المجهري لديه قيود فيما يتعلق بأرقام الخلايا وتلطيخ التفاضلية بالمقارنة مع تحليل FACS. ومع ذلك ، يوفر المجهر الفلورسنت معلومات متعمقة. التحليل المجهري لأحاطه الضامة من الخلايا ابوتوتيك ضروري للتحقيق في القدرة وحركيه الضامة لاستيعاب الخلايا ابوتوتيك. قد الفاصل الزمني للتقدم ابتلاع كله توفير معلومات مفصله بشان كم من الوقت يستغرق لابتلاع خليه واحده ابوتوتيك, وكيف العديد من الخلايا ابوتوتيك يمكن استيعاب واحد الضامة في وقت واحد. ويمكن أيضا تحليل الضامة البالعة بواسطة لطخه الغربية للتحقيق في جزيئات الإشارات التي تنظمها عمليه أحاطه. يمكن تقييم ملفات تعريف التعبير الجيني المرتبطة بهذه العملية بواسطة PCR في الوقت الحقيقي.

وأخيرا ، يوفر هذا البروتوكول منصة أساسيه في التحليل التجريبي لافيروسيتوسيس. أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا الجذعية ، والخلايا المسمارية ، والخلايا الظهاريه) يمكن ان تعمل أيضا علي امتصاص الخلايا ابوتوتيك في مواقعها السكنية. هذه الخلايا لديها تفضيلات في الاستفادة من مستقبلات مختلفه للاعتراف والبدء في عمليه أزاله الخلايا الميتة2. قد يتاثر الكفاءة الاجماليه للفعمه بعوامل عده ، بما في ذلك العوامل التجريبية ونوع الخلية المحددة. ومن المحتمل ان تكون النتائج المتغيرة المبلغ عنها في الأدبيات بسبب 1) مده الثقافة المشتركة ؛ 2) الموارد واعداد الخلايا الشحمية والكريات الميتة ؛ 3) طرق لفك الخلايا ابوتوتيك من البالعات. قد ينطبق البروتوكول الموصوف هنا علي إمكانات الخلايا الأخرى. قد يكون التحسين مطلوبا لتعظيم إمكانات الخلايا المستهدفة. قمنا بتحليل كثرة الخلايا الكلوية الخلوية التي تم إنشاؤها بنفس الطريقة كما هو موضح في هذا البروتوكول. العدلات تلعب دورا رئيسيا في الجهاز المناعي الفطري من خلال القضاء علي مسببات الامراض. ويمكن تحليل كثرة العدلات من البكتيريا المسمية أو الجسيمات عن طريق تدفق الخلوي26. ومع ذلك ، العدلات لديها نصف عمر قصيرة جدا (6-8 h) وكثرة العدلات من البكتيريا أو الفطريات يحدث في غضون ثوان إلى دقائق27،28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويدعم البحث في مختبر شاو من قبل جائزه البحوث المبتكرة من كليه الطب والجائزة التجريبية كليه المبتدئين من قسم الطب الباطني ، جامعه سينسيناتي ومنح DK K01_095067 من NIDDK/المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 147 ، الضامة ، الخلايا ابوتوتيك ، افيروسيتوسيس ، المجهر المناعي ، التدفق الخلوي ، المستقبلات التامة التيروزين كيناسيس
التحليل التجريبي لأحاطه الخلايا الشحمية بواسطة الضامة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental… More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter