Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.
Abstract
A apoptose celular é um processo natural e desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário, na regulação homeostática, na indução da tolerância imune e na resolução da inflamação. O acúmulo de detritos apoptóticos no corpo pode desencadear respostas inflamatórias crônicas que levam a doenças auto-imunes sistêmicas ao longo do tempo. O afastamento de pilha apoptóticas danificado foi implicado em uma variedade de doenças auto-imunes. A depuração apoptótica é um processo complexo raramente detectado em condições fisiológicas. Envolve receptores de superfície abundantes e moléculas de sinalização. Estudar o processo de liberação de células apoptóticas fornece mecanismos moleculares perspicazes e respostas biológicas subsequentes, o que pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas. Aqui, nós descrevemos protocolos para a indução de thymocytes apoptóticas, a preparação de macrófagos peritoneais, e a análise do afastamento de pilha apoptóticas pelo fluxo citometria e pela microscopia. Todas as células serão submetidas a apoptose em um determinado estágio, e muitas células residenciais e circulantes podem captação de detritos apoptóticos. Portanto, o protocolo descrito aqui pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação e a ingestão de células apoptóticas por muitos outros tipos de células.
Introduction
Nosso corpo gera 1-10 bilhões de células apoptóticas em uma base diária. Um número tão grande de pilhas apoptóticas deve ser cancelado de uma maneira que as respostas imunes permaneçam quiescentes. Para garantir o despejo de células apoptóticas em tempo hábil, inúmeros tipos de células residentes no tecido e células circulantes desenvolvem mecanismos para engolfo células apoptóticas1. A regulação disfuncional da apoptose tem sido implicada no início e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunidade2. A apoptose também desempenha um papel crítico na patogênese do desenvolvimento do câncer e sua subsequente resistência aos tratamentos convencionais3,4. A remoção de células apoptóticas geralmente promove uma resposta anti-inflamatória, que pode estar ligada à tolerância imunológica5. A violação do afastamento de pilha apoptóticas conduz o Self-imunização e contribui ao desenvolvimento de doenças auto-imunes sistemáticas em seres humanos e em ratos6.
Quando as células passam por apoptose, elas expõem a fosfatidilserina (PtdSer) do folheto interno ao folheto externo da membrana. O PtdSer será então reconhecido pelos fagócitos através de receptores de superfície. Mais de uma dúzia de receptores foram identificados para reconhecer e/ou facilitar o engulfment de células apoptóticas. Em geral, há pelo menos três tipos de receptores de superfície envolvidos na depuração celular apoptótica: receptores tethering, reconhecem células apoptóticas; fazer cócegas nos receptores, iniciar o engulfment; os receptores de chaperoning, facilitam o processo inteiro7. As tirosina cinases do receptor TAM (TAM RTKs) consistem em Tyro-3, AXL e Mer e são expressas principalmente por células mielóides do sistema imunológico8. A função primária de TAM RTKs é servir como receptores tethering, facilitando a remoção fagocítica de células apoptóticas e detritos. Nosso grupo tem estudado o afastamento de pilha apoptóticas negociado Tam no ajuste da autoimunidade por muitos anos. A proteína de crescimento protéico dependente de vitamina K 6 (Gas6) e proteína S (prós) vincula e ativa os receptores de Tam9,10. Gas6 é produzido no coração, rins e pulmões. ProS é produzido principalmente no fígado11. TAM reconhece de células apoptóticas de tal forma que o N-terminal de Gas6/ProS se liga ao PtdSer em uma célula apoptótica e o C-terminal de Gas6/ProS se liga aos receptores TAM que ancorados na superfície dos fagócitos. Juntamente com os outros receptores, a engulfment de células apoptóticas ocorre12. Embora o Mer possa se vincular tanto aos ligantes ProS e Gas6, descobrimos que Gas6 parece ser o único ligador para a fagocitose de macrófagos mediada por Mer de células apoptóticas, que podem ser bloqueadas pelo anticorpo anti-Mer13. Os macrófagos são fagócitos profissionais. O afastamento rápido de pilhas apoptóticas por macrófagos é importante para a inibição da inflamação e de respostas auto-imunes de encontro aos antígenos intracelular. A tirosina quinase do receptor de Mer é crítica para o engulfment do macrófago e o afastamento eficiente de pilhas apoptóticas14. No baço do camundongo, Mer expressa principalmente sobre a zona marginal e os macrófagos corpóreos13.
O protocolo aqui apresentado descreve um método básico para induzir a apoptose celular e demonstrar formas de mensurar o processo e a eficiência da eferocitose. Estes protocolos podem prontamente ser adaptados para estudar o macrófagos por outros tipos da pilha no engulfment de pilhas apoptóticas de origens diferentes.
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Protocol
Camundongos experimentais foram criados e mantidos em nossa colônia de camundongos. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes do Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Cincinnati.
1. preparação de CFSE rotulados timócitos apoptóticos
- Eutanizar dois ratos C57/B6 ingênuos por inalação de CO2 por 10 min e dissecar para abrir a cavidade torácica, remover (puxar) o Timo com fórceps curvo de ponta fina no prato de Petri de cultura de tecido contendo 10 ml de meio RPMI1640.
- Obtenha a única suspensão da pilha moendo o Timo inteiro de encontro a duas extremidades geadas das corrediças do microscópio e filtre então a suspensão com o filtro da pilha de 100 μm.
- Colete a suspensão de 10 ml de timo em um tubo de 50 ml e centrifugue em 300 x g por 5 minutos.
- Retire o sobrenadante, ressuscitem em 40 mL de 1X PBS, e contagem de números de células com um Hemocytometer.
- Centrifugue a 300 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.
- Ressuspender em 20 mL de 1X PBS em um tubo de 50 mL como uma única suspensão da pilha com até 2 x 108 pilhas (se mais de 2 x 108 pilhas, Ressuspender o descanso das pilhas em uns outros 20 ml de 1 x PBS em um tubo diferente de 50 ml).
- Faça 5 μM de CFSE em igual volume (20 mL) de 1X PBS em um tubo separado de 50 mL introduzindo 40 μL de solução de estoque CFSE (2,5 mM) em 20 mL de 1X PBS e misture bem invertendo o tubo 2-3 vezes.
- Adicione os 20 mL de CFSE da etapa 1,7 no 20 mL da suspensão da pilha da etapa 1,6 (a concentração final de CFSE é agora 2,5 μM).
Nota: para cada suspensão de célula de 20 mL, é necessário um tubo de 20 mL de CFSE. - Inverta o tubo da mistura da pilha e do CFSE 2-3 vezes e incubar a mistura no escuro na temperatura ambiente por um máximo de 2 minutos, a seguir pare a reação adicionando 10 mL do soro Calor-Inactivated do cavalo.
- Centrifugue a mistura do tubo de 50 mL em 300 x g por 5 minutos na temperatura ambiente.
Nota: se a rotulagem CFSE for bem-sucedida, o pellet de células se tornará amarelo claro na cor. - Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 40 mL de 1X PBS e contagem de números de células com um Hemocytometer.
- Centrifugue a suspensão celular a 300 x g durante 5 min e descarte o sobrenadante.
- Lave novamente a pastilha celular com 40 mL de meio RPMI1640.
- Remova as células sobrenadantes e ressuscitem com meio de cultura de tecido RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (calor inativado), 20 mM de glutamina e 1x Pen/Strep) em uma concentração de 7 x 106 células/ml em um prato de cultura de tecido de 100 mm.
Nota: se forem obtidas mais células, será necessário um prato de cultura de tecido de 100 mm separado. - Adicionar estaurosporina na cultura da suspensão da pilha em uma concentração final de 1 μm e cultura para 4 h em 37 ° c em uma incubadora da cultura do tecido fornecida com o co2de 5%.
2. preparação de macrófagos peritoneais
- Injete dois camundongos C57B6 (ou qualquer rato manipulado por genes no laboratório) intraperitonealmente com 1 mL de tioglicato de 3% envelhecido no dia 0.
- Eutanizar os camundongos no dia 5 como na etapa 1,1, cortar e descascar abrir a pele abdominal, mas deixar o peritônio intacto. Lave a cavidade peritoneal empurrando rapidamente 10 mL de tampão de lavagem (RPMI1640, 2% FBS, 0, 4% EDTA) na cavidade peritoneal usando uma seringa de 10 mL unida com uma agulha de 18 G.
- Recupere o tampão de lavagem lentamente com a mesma agulha/seringa e colete o tampão de lavagem em um tubo de 50 mL (detalhes referem-se ao artigo15do laboratório da Janssen).
- Lave o gavagem peritoneal duas vezes com 1X PBS, Ressuspender os macrófagos peritoneais no meio de cultura do tecido RPMI1640 em uma densidade de 2 x 106 Cells/ml e alíquota 500 μl em cada poço da placa 24-well. Deixe a placa em uma incubadora da cultura do tecido para 2 h.
- Remova as células flutuantes aspirando e substituindo com 500 μL de meio de cultura fresca, duas vezes.
- Opcionalmente, adicione o inibidor de tirosina do receptor TAM, RXDX-106, em concentrações indicadas nas legendas de figura em cada poço da cultura de macrófago e incubar por mais 2 h.
3. co-cultura de macrófagos peritoneais com timócitos apoptóticos
- Colete timócitos apoptóticos do passo 1 e lave três vezes com meio RPMI1640. A eficiência da indução apoptótica pode ser medida nesta fase com o kit Anexin V/7-AAD.
- Distribuir 0-12 x 106 células (em meio 500 μL) em cada poço das culturas de macrófago do protocolo #2, de acordo com o arranjo experimental (por exemplo, veja a Figura 1). Isso faz com que todo o volume de cultura de 1 mL em cada poço da placa de 24 poços. Adicione o anticorpo de obstrução na cultura imediatamente antes da adição de thymocytes apoptóticas.
- Cultura a mistura da pilha em 37 ° c por 4 h em uma incubadora da cultura do tecido fornecida com o CO2de 5%.
- Lave cada poço da cultura com 1X PBS (contendo 500 μM de EDTA) duas vezes para remover as células apoptóticas de flutuação livre.
- Manchar os macrófagos ligados à placa com CD11b-PE nesta fase.
- Lave os macrófagos ligados à placa com tampão de coloração (1X PBS, 1% BSA) uma vez.
- Adicionar 200 μL de tampão de coloração contendo 2 μL de CD11b-PE em cada poço.
- Incubar a placa a 4 ° c durante 20 min.
- Lave cada poço da placa três vezes com o amortecedor de coloração.
- Adicionar 200 μL de tampão de coloração e proceder a placa para análise de imagem o microscópio fluorescente.
- Alternativamente, separe os macrófagos ligados à placa adicionando 1 mL de lidocaína a 1% em PBS e incubando por 10 min a 37 ° c.
- Separe os macrófagos ligados à placa com pipetagem repetida.
- Transfira a suspensão de macrófago para um tubo FACS de 5 mL de fundo redondo de cada poço da placa de 24 poços.
- Centrifugador a 300 x g durante 5 min.
- Retire o sobrenadante e adicione 200 μL de tampão de coloração contendo 2 μL de CD11b-PE (1:200 diluição no tampão de coloração).
- Incubar a suspensão da célula no tampão de coloração a 4 ° c durante 20 min.
- Lave a suspensão da célula duas vezes com o tampão de coloração.
- Adicionar 200 μL de tampão de coloração e proceder para a análise de FACS com um citômetro do fluxo e para analisar para a porcentagem de macrófagos do positividade de CFSE.
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Representative Results
Análise do engulfment macrófago-negociado peritoneal de thymocytes apoptóticas. Macrófagos peritoneais e células apoptóticas foram preparadas e cocultivadas conforme descrito no protocolo. Os macrófagos foram destacados e corados com anticorpo CD11b conjugado PE por 20 min no gelo. Os macrófagos foram então lavados e processados em um citometro de fluxo. Como visto, não há nenhum macrófago positivo de CFSE no quadrante inferior direito quando nenhuma célula apoptótica foi adicionada na cultura (Figura 1A e Figura 2, primeiro painel). Os macrófagos peritonealny tioglycollate-estimulados têm a capacidade variável de engolir pilhas apoptóticas. Até 30% dos macrófagos mostraram-se positivos no canal CFSE, indicando que ingeriram células apoptóticas rotuladas pelo CFSE neste experimento (Figura 1). Vale ressaltar que os macrófagos positivos do CFSE se espalharam no quadrante inferior direito devido a diferentes intensidades, indicando que o número de células apoptóticas dentro dos macrófagos é diferente. Portanto, a observação microscópica do engulfment de macrófagos de células apoptóticas é essencial para investigar a capacidade dos macrófago de ingerir células apoptóticas (Figura 2). A maior proporção de células apoptóticas para macrófagos não só aumenta o número de macrófagos que ingerem células apoptóticas, mas também aumenta a capacidade dos macrófagos de ingerir mais células apoptóticas (Figura 2).
Inibição dose-dependente da eferocitose pelo bloqueio de Mer.
Em outro conjunto de experimentos, verificou-se que cerca de 15% dos macrófagos tornaram-se positivos para CFSE quando timócitos apoptóticos (ração de 6:1) foram adicionados à cultura do macrófago por 4 h, indicando que são os macrófagos fagocíticos (Figura 3 B). uma função de Mer em macrófagos é reconhecer e mediar a fagocitose de células apoptóticas através da molécula de ponte, Gas6. Para testar a porcentagem de eferocitose atribuída pela inibição de Mer, adicionamos anticorpos anti-Mer na cultura para bloquear a efferocitose mediada por Mer. O anticorpo Mer bloqueia a efferocitose de macrófago de forma dose-dependente (Figura3C, Figura 3D) e o bloqueio geral pode ser responsável por cerca de 30% da eficiência da eferocitose no ajuste atual (Figura 3) , Esses dados também foram confirmados em nosso estudo prévio com macrófagos13de Mer knockout. Nós testamos então a eficiência da inibição com o inibidor recentemente aprovado do receptor do TAM de FDA, RXDX-106, que inibe todos os receptores de TAM com afinidades diferentes (Axl > > Tyro3 > Mer). Rxdx-106 foi adicionado na cultura do macrófago 2 horas antes da coincubação com thymocytes apoptóticas. Como mostrado na Figura 4, rxdx-106 inibiu a efferocitose de macrófago de forma dependente da dose. A concentração de inibição saturada foi de cerca de 100 nM (Figura 4, linha sólida), uma concentração que parece ser mais efetiva do que a deficiência de Mer (Figura 4 linha pontilhada) ou o anticorpo Mer (Figura 3, painel D) isoladamente. Como o macrófago expressa todos os três receptores de TAM na superfície16, espera-se ver que concentrações mais elevadas de rxdx-106 (mais de 100 nm) bloquearão todos os três receptores e, portanto, serão mais eficazes no bloqueio da efferocitose do que visando um único receptor TAM, Mer.
Figura 1 . Porcentagem da fagocitose de timócitos apoptóticos por macrófagos peritoneais. Os timócitos de apoptotic foram induzidos incubando com 1 milímetro de estaurosporina para 4 h e adicionado na cultura do macrófago em uma relação como indicada nos painéis da figura: (a) 1:0; (B) 1:1; (C) 1:2; (D) 1:4; (E) 1:6; (F) 1:8; (G) 1:10; (H) 1:12. Os dados foram adquiridos com um citometro de fluxo. A porcentagem de macrófagos fagocíticos foi analisada por meio do software associado ao citometro de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Análise microscópica da eferocitose. A eferocitose foi preparada como na Figura 1. Os macrófagos fagocíticos foram corados in situ na placa com CD11b-PE, fixados com paraformaldeído, e avaliados. As imagens foram adquiridas utilizando-se o microscópio fluorescente e analisadas com o software associado ao microscópio. As inserções representativas foram ampliadas digitalmente e mostradas abaixo em cada imagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Inibição da efferocitose peritoneal do macrófago por um anticorpo de anti-Mer. As pilhas de apoptotic foram preparadas e cocultivadas com os macrófagos para 4 h como descrito no protocolo. O anti-Mer AB foi adicionado na cultura do macrófago imediatamente antes da cocultura com pilhas apoptóticas. Os macrófagos fagocíticos foram então destacados e corados com anticorpo CD11b-PE no gelo por 20 min. os dados foram adquiridos e analisados como na Figura 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . RXDX-106 inibição mediada da efferocitose de macrófago. A eferocitose foi configurada conforme descrito na Figura 3. RXDX-106 foi adicionado duas horas antes da cocultura com thymocytes apoptóticos. Os macrófagos peritonealny Mer-deficientes foram preparados similarmente e serviram como o grupo de controle. Os dados foram adquiridos e a porcentagem de macrófagos fagocíticos foi bloqueada em células positivas de CD11b e analisada por meio do software de citometro de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A apoptose é um processo de morte celular altamente conservado que envolve muitas cascatas de sinal e induz expressão protéica, secreção e transporte. A apoptose é frequentemente associada a alterações morfológicas celulares17. Células apoptóticas liberam ativamente citocinas e quimiocinas que atraem fagócitos para migrar para o local e iniciar o processo de engulfment, uma via extremamente complexa controle apertado18. Por outro lado, a morte celular necrótica libera sinais de perigo que desencadeiam respostas inflamatórias1. O despejo defeituoso ou prolongado de pilhas apoptóticas conduzirá à necrose secundária destas pilhas19. Portanto, o tempo na indução de apoptose é muito crítico no experimento. Existem inúmeras maneiras de induzir a apoptose celular20. No entanto, a duração e a força da indução são dependentes do tipo celular. Recomendamos a criação de um experimento de titulação para determinar a condição ideal de máximo (90-95%) produção de apoptose. O kit de detecção apoptótica anexina-V/7-AAD foi utilizado e as instruções foram seguidas em nosso laboratório para avaliar a eficiência apoptótica. Nosso laboratório tentou duas maneiras diferentes de induzir o apoptose dos timócitos no passado. A gama-radiação parece ser um método melhor, porque não tem nenhum resíduo químico na cultura e induz poucas mortes Necrotic da pilha. Nós exporemos timócitos a 500 RAD da g-radiação seguida pela cultura 4-h no meio RPMI1640. Observamos cerca de 95% de timócitos apoptóticos13. Quando um radiador não está disponível, nós induzidos timócitos para submeter-se ao apoptose com 1 μm do estaurosporina na cultura para 4 h (etapa 1,15). As células primárias são geralmente mais sensíveis à indução de apoptose. As etapas de lavagem extensivas são exigidas igualmente para remover os produtos químicos da cultura antes da cocultura com phagocytes. Há muitas maneiras de rotular células apoptóticas. Embora a toxicidade tenha sido associada com alta concentração, CFSE é muito eficientemente mantido dentro do citoplasma quando cuidadosamente otimizado21. pHrodo é um corante ácido-sensível, que aumente na fluorescência enquanto o pH do ambiente diminui. Devido ao pH baixo do phagolysosome, as pilhas apoptóticas fagocitada podem facilmente ser distinguidas das pilhas apoptóticas fisicamente Unidas mas não engolido no ensaio22.
Numerosos receptores de superfície (receptores TAM, receptor de manose, integrinas (CD11b/CD18), receptores de scavenger, receptores FC, et al) permitem que os fagócitos se diferenciem de patógenos e discriminem as respostas subsequentes23. Diferentes receptores trabalham juntos para terminar um processo bastante complexo. Receptores de bloqueio (s) provavelmente resulta em uma inibição parcial da fagocitose. Os macrófagos primários podem ser preparados a partir de diferentes recursos com vários métodos (macrófagos derivados da medula óssea, macrófagos peritoneais, macrófagos esplênicos, et al.). A vantagem de macrófagos thioglycollate-induzidos é o phenotype fagocitária distorcida dos macrófagos; a desvantagem é que o tioglicolato precisa de ser envelhecido no escuro por pelo menos 3 meses. Entretanto, a solução do tioglicolato tem uma vida útil de 2 anos. Um estoque constante da solução deve superar essa desvantagem. Na preparação de macrófagos peritoneais, a quantidade de vestígios de glóbulos vermelhos na coleta de macrófago peritoneal não deve afetar o experimento, uma vez que eles vão ser lavados junto com as células flutuantes após 2 h de cultura de macrófagos. Uma grande quantidade de glóbulos vermelhos (pellet visível) pode necessitar de tratamento com tampão de lisação ACK. Os macrófagos tendem a aderir firmemente à superfície da cultura. Diferentes métodos têm sido citados na literatura para separar as células de adesão da superfície24. O descolamento baseado em enzimas produz os mais altos níveis de recuperação celular, mas pode danificar os receptores de superfície, prejudicando a função celular e análises associadas. A alteração dos receptores de superfície também pode afetar a análise da citometria de fluxo baseada em receptores. A lidocaína faz com que a morfologia celular mude para uma conformação mais esférica devido ao bloqueio dos canais iônicos de cálcio25. É a melhor maneira de separar os macrófagos da superfície sem danos visíveis em nosso experimento.
Os macrófagos contendo células apoptóticas podem ser analisados por meio de ensaios baseados em citometria de fluxo ou microscópio. FACS pode ser aplicado para analisar um grande número de células em um curto espaço de tempo e pode ainda identificar subtipos de células por diferencial de coloração com anticorpos contra a superfície específica ou proteínas citoplasmáticas. Uma concentração óptima (relação) de números de pilha apoptóticas no sistema da cocultura pode igualmente ser decidida pela análise de FACS. A análise microscópica tem limitações quanto aos números celulares e à coloração diferencial em relação à análise do FACS. No entanto, a microscopia fluorescente fornece informações detalhadas. A análise microscópica do engulfment do macrófago de pilhas apoptóticas é essencial investigar a capacidade e a cinética dos macrófagos para ingerir pilhas apoptóticas. Um lapso de tempo da progressão inteira da ingestão pode fornecer a informação detalhada a respeito de quanto tempo toma para engolir uma pilha apoptóticas, e quantas pilhas apoptóticas podem um único macrófago ingerir simultaneamente. Os macrófagos fagocíticos também podem ser analisados por Western blot para investigar as moléculas de sinalização reguladas pelo processo de engulfment. Os perfis de expressão gênica associados a esse processo podem ser avaliados por PCR em tempo real.
Finalmente, este protocolo fornece uma plataforma básica na análise experimental da eferocitose. Outros tipos de células (células dendríticas, células mesangiais, células epiteliais) também podem funcionar para a captação de células apoptóticas em seus locais residenciais. Essas células têm preferências em utilizar diferentes receptores para reconhecer e iniciar o processo de afastamento celular apoptótico2. A eficiência fagocitítica global pode ser influenciada por vários fatores, incluindo fatores experimentais e de tipo celular específicos. Os resultados variáveis relatados na literatura são provavelmente devido a 1) duração da cocultura; 2) recurso e preparo de fagócitos e células apoptóticas; 3) métodos para dissociar as células apoptóticas dos fagócitos. O protocolo descrito aqui pode aplicar-se ao potencial fagocitítico de outras células. A otimização pode ser necessária para maximizar o potencial fagocitítico das células-alvo. Nós analisamos o fagocitose da pilha mesangial renal dos timócitos apoptóticas gerados na mesma maneira que descrito neste protocolo. Neutrófilos desempenham um papel fundamental no sistema imunológico inato através da eliminação de patógenos. A fagocitose de neutrófilos de bactérias ou partículas rotuladas pode ser analisada por citometria de fluxo26. No entanto, os neutrófilos têm uma meia-vida muito curta (6-8 h) e a fagocitose de neutrófilos de bactérias ou fungos ocorre dentro de segundos a minutos27,28.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
A pesquisa no laboratório de Shao é apoiada pela concessão inovativa da pesquisa da faculdade da medicina e da faculdade Júnior concessão do piloto do departamento da medicina interna, Universidade de Cincinnati e concessão DK K01_095067 de NIDDK/NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
