Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Eksperimentel analyse af apoptotisk Thymocyt engulfment af makrofager

Published: May 24, 2019 doi: 10.3791/59731
Automatic Translation
1, 1
1Division of Immunology, Allergy, and Rheumatology, Department of Internal Medicine, College of Medicine, University of Cincinnati

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at forberede apoptotiske thymocytter og peritonealdialyse makrofager og analysere effektiviteten af efferocytose og den specifikke inhibitor-medieret blokering af apoptotiske thymocytter engulfment. Denne protokol har en bred anvendelse i celle-medieret clearance af andre partikler, herunder kunstige perler og bakterier.

Abstract

Cell apoptose er en naturlig proces og spiller en afgørende rolle i fosterudvikling, homeostatisk regulering, immuntoleranceinduktion, og opløsning af betændelse. Ophobning af apoptotiske rester i kroppen kan udløse kroniske inflammatoriske reaktioner, der fører til systemiske autoimmune sygdomme over tid. Nedsat apoptotisk celle clearance har været impliceret i en række autoimmune sygdomme. Apoptotisk clearance er en kompleks proces, der sjældent påvises under fysiologiske forhold. Det involverer rigelige overflade receptorer og signalering molekyler. Studiet af processen med apoptotisk celle clearance giver indsigtsfulde molekylære mekanismer og efterfølgende biologiske reaktioner, som kan føre til udvikling af nye behandlingsmetoder. Her beskriver vi protokoller til induktion af apoptotiske thymocytter, fremstilling af peritonealdialyse makrofager og analyse af apoptotisk celle clearance ved flow cytometri og mikroskopi. Alle celler vil gennemgå apoptose på et bestemt stadie, og mange beboelses-og cirkulerende celler kan optages apoptotisk snavs. Derfor kan den protokol, der er beskrevet her, bruges i mange applikationer til at karakterisere apoptotiske cellebinding og indtagelse af mange andre celletyper.

Introduction

Vores krop genererer 1-10 milliarder apoptotiske celler på daglig basis. Et så stort antal apoptotiske celler skal ryddes på en sådan måde, at immunresponset fortsat er i stigning. For at sikre clearance af apoptotiske celler i tide, mange typer af væv residente celler og cirkulerende celler udvikle mekanismer til at opsluge apoptotiske celler1. Dysfunktionel regulering af apoptose har været impliceret i debut og progression af forskellige inflammatoriske sygdom og autoimmunitet2. Apoptose spiller også en afgørende rolle i patogenesen af kræft udvikling og dens efterfølgende resistens over for konventionelle behandlinger3,4. Fjernelse af apoptotiske celler generelt fremmer en anti-inflammatorisk respons, som kan være forbundet med immunologisk tolerance5. Forstyrrelse af apoptotisk celle rydning driver selv immunisering og bidrager til udviklingen af systemiske autoimmune sygdomme hos både mennesker og mus6.

Når cellerne gennemgår apoptose, eksponerer de Phosphatidylserin (PtdSer) fra den indre indlægsseddel til membranens ydre indlægsseddel. PtdSer vil derefter blive genkendt af fagocytter gennem overflade receptorer. Over et dusin receptorer er blevet identificeret til at genkende og/eller lette optænding af apoptotiske celler. Generelt er der mindst tre typer af overflade receptorer involveret i apoptotiske celle clearance: tethering receptorer, genkende apoptotiske celler; tikkende receptorer, initiere optænding; kaperening receptorer, lette hele processen7. TAM-receptor tyrosinkinaser (TAM RTKs) består af TYRO-3, AXL og Mer og udtrykkes primært ved myeloide celler i immunsystemet8. Den primære funktion af TAM RTKs er at tjene som tethering receptorer, lette den fagocytiske fjernelse af apoptotiske celler og snavs. Vores gruppe har studeret Tam medieret apoptotiske celle clearance i fastsættelsen af autoimmuniteten i mange år. Den vitamin K-afhængige protein vækst arrestere specifikke protein 6 (Gas6) og protein S (ProS) binder sig til og aktiverer Tam receptorer9,10. Gas6 er fremstillet i hjertet, nyrerne og lungerne. ProS er hovedsageligt produceret i leveren11. TAM genkender apoptotiske celler på en sådan måde, at N-terminalen i Gas6/ProS binder sig til PtdSer på en apoptotisk celle og C-terminalen i Gas6/ProS binder sig til TAM-receptorer, der er forankret på overfladen af fagocytter. Sammen med de andre receptorer, optænding af apoptotiske celler forekommer12. Selv om Mer kan binde til både ligander ProS og Gas6, vi fandt, at Gas6 synes at være den eneste ligand for Mer-medieret makrophage fagocytose af apoptotiske celler, som kan blokeres af anti-Mer antistof13. Makrofager er professionelle fagocytter. Hurtig clearance af apoptotiske celler ved makrofager er vigtig for hæmning af inflammation og autoimmune reaktioner mod intracellulære antigener. Mer-receptor-tyrosinkinase er afgørende for makrofag-opløbet og effektiv clearance af apoptotiske celler14. I muse milt udtrykker Mer hovedsageligt den marginale zone og de håndgribelige makrofager13.

Den protokol, der præsenteres her beskriver en grundlæggende metode til at fremkalde Cell apoptose og demonstrere måder at måleprocessen og effektiviteten af efferocytose. Disse protokoller kan let tilpasses til at studere efferocytose af andre celletyper i engulfment af apoptotiske celler af forskellig oprindelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle mus blev opdrættet og vedligeholdt i vores mus koloni. Alt dyre arbejde blev udført i henhold til retningslinjerne fra det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) ved universitetet i Cincinnati.

1. klargøring af cfse mærket apoptotiske thymocytter

  1. Euthanize to naive C57/B6 mus ved co2 indånding i 10 min og dissekere for at åbne brystet hulrum, fjerne (trække) thymus med buede fine-spids pincet i vævskultur petriskål indeholdende 10 ml RPMI1640 medium.
  2. Opnå enkelt cellesuspension ved slibning hele thymus mod to matteret ender af mikroskop slides og derefter filtrere suspensionen gennem 100 μm celle Strainer.
  3. 10 mL thymus-suspension opsamles i et 50 mL rør og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
  4. Fjern supernatanten, resuspender i 40 mL 1x PBS, og Tæl celletallene med et hemocytometer.
  5. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, og supernatanten fjernes.
  6. Der resuspenderes i 20 mL 1x PBS i et 50 mL rør som en enkelt cellesuspension med op til 2 x 108 celler (hvis mere end 2 x 108 celler, resuspension resten af cellerne i en anden 20 ml af 1 x PBS i et andet 50 ml rør).
  7. Der skal fremstille 5 μM CFSE i samme volumen (20 mL) 1x PBS i et separat 50 mL rør ved at afpipette 40 μL CFSE-stamopløsning (2,5 mM) i 20 mL 1x PBS og blandes godt ved at invertere røret 2-3 gange.
  8. Tilsæt 20 mL CFSE fra trin 1,7 til 20 mL af cellesuspensionen fra trin 1,6 (den endelige koncentration af CFSE er nu 2,5 μM).
    Bemærk: for hver 20 mL cellesuspension er der behov for 20 mL CFSE-rør.
  9. Vend cellen og CFSE-blandings røret 2-3 gange og inkuberer blandingen i mørke ved stuetemperatur i højst 2 minutter, og stop derefter reaktionen ved at tilsætte 10 mL varme inaktiveret heste serum.
  10. Der centrifugeres 50 mL slange blandingen ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    Bemærk: Hvis CFSE-mærkningen lykkes, bliver celle pellet lysegul i farve.
  11. Supernatanten fjernes, og celle pillen resuspenderes i 40 mL 1x PBS, og celletallet tælles med et hemocytometer.
  12. Cellesuspensionen centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, og supernatanten kasseres.
  13. Vask celle pillen igen med 40 mL RPMI1640 medium.
  14. Fjern supernatanten og resuspender celler med RPMI1640 vævskultur medium (RPMI1640 mM HEPES, 10% FBS (varme inaktiveret), 20 mM glutamin og 1x pen/STREP) i en koncentration på 7 x 106 celler/ml i en 100 mm vævskultur skål.
    Bemærk: Hvis der opnås flere celler, vil en separat 100 mm vævskultur skål være nødvendig.
  15. Der tilsættes staurosporin til celle ophængs kulturen ved en slutkoncentration på 1 μM og kultur i 4 timer ved 37 °C i en vævskultur-inkubator, der leveres med 5% CO2.

2. fremstilling af peritonealdialyse makrofager

  1. Injicer to C57B6 mus (eller alle genmanipulerede mus i laboratoriet) intraperitonealt med 1 ml 3% i alderen thioglycollate på dag 0.
  2. Euthanize musene på dag 5 som i trin 1,1, skæres og skræl åbne maveskindet, men lad bughinden intakt. Skyl peritonealhulrummet ved hurtigt at skubbe 10 mL vaskebuffer (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) ind i peritonealhulen ved hjælp af en 10 mL sprøjte fastgjort med en 18 G nål.
  3. Hent vaskebufferen langsomt med den samme nål/sprøjte, og saml vaskebufferen i et 50 mL-rør (detaljer henviser til Janssen Lab-artikel15).
  4. Den peritoneale sonde vaskes to gange med 1x PBS, og de peritoneale makrofager resuspenderes i RPMI1640 vævskultur medium med en densitet på 2 x 106 celler/ml og alikvot 500 μl i hver brønd af 24-brønd pladen. Lad pladen være i en vævskultur-inkubator i 2 timer.
  5. Fjern de flydende celler ved at aspirere og udskifte med 500 μL af frisk dyrkningsmedium, to gange.
  6. Eventuelt tilsættes TAM receptor tyrosin-hæmmer, RXDX-106, i koncentrationer, der er angivet i figur legender i hver brønd af makro fagkulturen og inkube til en anden 2 h.

3. co-kultur af peritonealdialyse makrofager med apoptotiske thymocytter

  1. Saml apoptotiske thymocytter fra trin 1 og vask tre gange med RPMI1640 medium. Effektiviteten af apoptotisk induktion kan måles på dette stadie med annexin V/7-AAD-sættet.
  2. Fordel 0-12 x 106 celler (i 500 μl medium) i hver brønd af makrofag kulturer fra protokol #2, i henhold til forsøgsordningen (f. eks. se figur 1). Dette gør hele kultur mængden af 1 mL i hver brønd af 24-brønd pladen. Tilsæt det blokerende antistof i kulturen umiddelbart før tilsætning af apoptotiske thymocytter.
  3. Kultur celle blandingen ved 37 °C i 4 timer i en vævskultur-inkubator, der leveres med 5% CO2.
  4. Vask hver brønd af kulturen med 1x PBS (indeholdende 500 μM EDTA) to gange for at fjerne de fritflydende apoptotiske celler.
  5. Pletter de plade bundne makrofager med CD11b-PE på dette stadie.
    1. Vask de plade bundne makrofager med farvnings buffer (1x PBS, 1% BSA) én gang.
    2. Der tilsættes 200 μL farvnings buffer indeholdende 2 μL CD11b-PE i hver brønd.
    3. Pladen ved 4 °C inkueres i 20 min.
    4. Vask hver brønd af pladen tre gange med farvnings bufferen.
    5. Tilsæt 200 μL farvnings buffer, og Fortsæt pladen til billedanalyse under fluorescerende mikroskop.
  6. Alternativt kan du fjerne de plade bundne makrofager ved at tilsætte 1 mL 1% lidocain i PBS og inkuere i 10 min ved 37 °C.
  7. Løsner plade bundne makrofager med gentagen pipettering.
  8. Overfør makrofag suspension til et individuelt 5 mL FACS-rør med rund bund fra hver brønd af 24-brønd pladen.
  9. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
  10. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 200 μL farvnings buffer indeholdende 2 μL CD11b-PE (1:200 fortynding i farvnings buffer).
  11. Cellesuspensionen inkuleeres i farvnings buffer ved 4 °C i 20 min.
  12. Vask cellesuspensionen to gange med farvnings buffer.
  13. Tilsæt 200 μL farvnings buffer, og Fortsæt til FACS-analyse med et flow flowcytometer, og analysér for procentdelen af CFSE positivitetsmakro fager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Analyse af peritonealdialyse macrophage-medieret optænding af apoptotiske thymocytter. Peritoneal makrofager og apoptotiske celler blev tilberedt og co-kuleret som beskrevet i protokollen. Makrofager blev løsrevet og plettet med PE konjugeret anti-CD11b-antistof i 20 minutter på is. Makrofager blev derefter vasket og forarbejdet i et flow cytometer. Som set er der ingen CFSE-positiv makrofag i nederste højre kvadrant, når der ikke er tilsat apoptotiske celler i kulturen (figur 1A og figur 2, første panel). Thioglycollate-stimuleret peritonealdialyse makrofager har den variable kapacitet til at opsluge apoptotiske celler. Op til 30% af makrofager viste positive i CFSE-kanalen, hvilket indikerer, at de har indtaget CFSE-mærkede apoptotiske celler i dette eksperiment (figur 1). Det er værd at bemærke, at CFSE positive makrofager spredt ud i den nederste højre kvadrant på grund af forskellige intensiteter, hvilket indikerer, at antallet af apoptotiske celler i makrofager er anderledes. Derfor er mikroskopisk observation af makrofag optænding af apoptotiske celler af afgørende betydning for at undersøge makro Fages evne til at indtage apoptotiske celler (figur 2). Det højere forhold mellem apoptotiske celler og makrofager øger ikke blot antallet af makrofager, der indtager apoptotiske celler, men forbedrer også makrofages evne til at indtage flere apoptotiske celler (figur 2).

Dosisafhængig hæmning af efferocytose af Mer-blokering.
I et andet sæt eksperimenter fandt vi ud af, at ca. 15% af makrofager blev CFSE positive, når CFSE-mærkede apoptotiske thymocytter (ration af 6:1) blev føjet til makro fagkulturen i 4 timer, hvilket indikerer, at de er de fagocytiske makrofager (figur 3 B). en funktion af Mer på makrofager er at genkende og mægle fagocytose af apoptotiske celler gennem bridging molekyle, Gas6. For at teste den procentdel af efferocytose tilskrives Mer hæmning, tilføjede vi anti-Mer antistoffer i kulturen til at blokere Mer-medieret efferocytose. Mer-antistof blokerer makrofag-efferocytose på en dosisafhængig måde (figur 3C, figur 3D), og den samlede blokering kan være ca. 30% af efferocytosis-effektiviteten i den aktuelle indstilling (figur 3) , Disse data blev også bekræftet i vores tidligere undersøgelse med Mer knockout makrofager13. Vi testede derefter effektiviteten af hæmning med den nyligt FDA godkendte TAM receptor hæmmer, RXDX-106, som hæmmer alle TAM-receptorer med forskellige tilhørsforhold (Axl > > Tyro3 > mer). RXDX-106 blev føjet til makro fagkulturen 2 timer før Co-inkubation med apoptotiske thymocytter. Som vist i figur 4hæmmede rxdx-106 makrophage efferocytose i en dosisafhængig måde. Den mættede hæmnings koncentration var ca. 100 nM (figur 4, fast linje), en koncentration, der synes at være mere effektiv end Mer-mangel (figur 4 punkteret linje) eller Mer-antistof (figur 3, panel D) alene. Da makrofag udtrykker alle tre Tam-receptorer på overfladen16, forventes det at se, at højere koncentrationer af rxdx-106 (over 100 nm) vil blokere alle tre receptorer, og derfor vil være mere effektive til at blokere for efferocytose end målretning mod en enkelt TAM-receptor, Mer.

Figure 1
Figur 1 . Procentdel af fagocytose af apoptotiske thymocytter af peritonealdialyse makrofager. Apoptotiske thymocytter blev induceret ved inkuering med 1 mm staurosporin i 4 timer og tilsat i makro fagkulturen i et forhold som angivet i figur panelerne: (a) 1:0; B) 1:1; C) 1:2; D) 1:4; E) 1:6; F) 1:8; G) 1:10; H) 1:12. Data blev anskaffet med et flow cytometer. Procentdelen af fagocytiske makrofager blev analyseret ved hjælp af den software, der er forbundet med flow cytometer. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Mikroskopisk analyse af efferocytose. Efferocytose blev fremstillet som i figur 1. Fagocytiske makrofager blev plettet in situ på pladen med CD11b-PE, fastgjort med PARAFORMALDEHYD, og evalueret. Billeder blev erhvervet ved hjælp af fluorescerende mikroskop og analyseret med den software, der er forbundet med mikroskop. Repræsentative indsættelser blev digitalt forstørret og vist nedenfor i hvert billede. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Hæmning af peritonealdialyse makrophage efferocytose af et anti-Mer antistof. Apoptotiske celler blev tilberedt og co-kuleret med makrofager i 4 timer som beskrevet i protokollen. Anti-Mer AB blev tilføjet til makrofag kulturen umiddelbart før Co-kulturen med apoptotiske celler. Phagocytiske makrofager blev derefter løsrevet og farves med anti-mus CD11b-PE antistof på is i 20 min. data blev anskaffet og analyseret som i figur 1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . RXDX-106 medieret hæmning af makrophage efferocytose. Efferocytose blev oprettet som beskrevet i figur 3. RXDX-106 blev tilføjet to timer før Co-kulturen med apoptotiske thymocytter. Mer-mangelfulde peritonealdialyse makrofager blev forberedt på samme måde og fungerede som kontrolgruppen. Data blev erhvervet og procentdelen af fagocytiske makrofager blev gated på CD11b positive celler og analyseret ved hjælp af flow flowcytometer software. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Apoptose er en meget velbevaret celledød proces, der involverer mange signal kaskader og inducerer protein udtryk, sekretion, og transport. Apoptose er ofte forbundet med cellulære morfologi ændringer17. Apoptotiske celler frigive aktivt cytokiner og chemokiner, der tiltrækker fagocytter at migrere til stedet og indlede processen med optænding, en yderst kompleks vej under stram kontrol18. På den anden side frigiver nekrotisk celledød faresignaler, der udløser inflammatoriske reaktioner1. Defekt eller langvarig clearance af apoptotiske celler vil føre til sekundær nekrose af disse celler19. Derfor er timing i apoptose induktion meget kritisk i forsøget. Der er mange måder at fremkalde celle apoptose20. Men varigheden og styrken af induktion er celletype afhængige. Vi anbefaler at opsætte et titrerings eksperiment for at bestemme den optimale tilstand for maksimum (90-95%) produktion af apoptose. Annexin-V/7-Aad apoptotiske detection kit blev brugt og instruktionerne blev fulgt i vores laboratorium for at evaluere apoptotiske effektivitet. Vores laboratorium har prøvet to forskellige måder at fremkalde thymocytter apoptose i fortiden. Gamma-stråling synes at være en bedre metode, da den ikke har nogen kemiske residualer i kulturen og inducerer få nekrotiske celledød. Vi udsætter thymocytter til 500 rad af g-stråling efterfulgt af 4-h kultur i RPMI1640 medium. Vi observerede omkring 95% apoptotiske thymocytter13. Når en radiator ikke er tilgængelig, inducerede vi thymocytter til at gennemgå apoptose med 1 μM staurosporin i kulturen i 4 timer (trin 1,15). Primær cellerne er generelt mere følsomme over for induktion af apoptose. Omfattende vask trin er også forpligtet til at fjerne kemikalier fra kultur før Co-kultur med fagocytter. Der er mange måder at mærke apoptotiske celler. Selvom toksicitet har været forbundet med høj koncentration, CFSE er meget effektivt bevaret i cytoplasma når omhyggeligt optimeret21. pHrodo er et syre følsomt farvestof, som øger fluorescens, efterhånden som pH i miljøet aftager. På grund af den lave pH af phagolysosome, kan fagocyterede apoptotiske celler let skelnes fra fysisk fastgjort, men ikke opslugt apoptotiske celler i assay22.

Talrige overflade receptorer (TAM-receptorer, mannose receptor, integrins (CD11b/CD18), Scavenger receptorer, FC receptorer, et al) tillade fagocytter at skelne sig selv fra patogener og diskriminere de efterfølgende svar23. Forskellige receptorer arbejde sammen for at afslutte en temmelig kompliceret proces. Blokerende receptor (e) sandsynligvis resulterer i en delvis hæmning af fagocytose. Primære makrofager kan fremstilles af forskellige ressourcer med forskellige metoder (knoglemarvs afledte makrofager, peritonealdialyse makrofager, milt makrofager, et al.). Fordelen ved thioglycollate-induceret makrofager er den skæve phagocytiske fænotype af makrofager; Ulempen er, at thioglycollate skal ældes i mørke i mindst 3 måneder. Men, thioglycollate opløsning har en holdbarhed på 2 år. En konstant bestand af løsningen bør overvinde denne ulempe. Ved fremstilling af peritonealdialyse makrofager bør spor mængden af røde blodlegemer i den peritoneale makrofag-samling ikke påvirke forsøget, da de vil blive vasket væk sammen med de flydende celler efter 2 timer makro fagkultur. En stor mængde røde blodlegemer (synlig pellet) kan kræve behandling med ACK lyserende buffer. Makrofager har tendens til at holde sig stramt til kultur overfladen. Forskellige metoder er blevet citeret i litteraturen for at frigøre vedhæftnings celler fra overfladen24. Enzym-baseret løsrivelse giver de højeste niveauer af celle opsving, men kan beskadige overflade receptorer, forringe cellefunktion og tilhørende analyser. Ændring af overflade receptorer kan også påvirke receptor-baserede flow cytometri analyse. Lidocain forårsager cellens morfologi at skifte til en mere sfærisk kropsbygning på grund af blokaden af calcium Ionkanaler25. Det er den bedste måde at frigøre makrofager fra overfladen uden mærkbar skade i vores eksperiment.

Makrofager indeholdende apoptotiske celler kan analyseres ved flow cytometri-baserede eller mikroskopi baserede assays. FACS kan anvendes til at analysere et stort antal celler på kort tid og kan yderligere identificere celle undertyper ved differentialfarvning med antistoffer mod de specifikke overflade eller cytoplasmatiske proteiner. En optimal koncentration (ratio) af apoptotiske cellenumre i co-Culture-systemet kan også afgøres af FACS-analysen. Mikroskopisk analyse har begrænsninger med hensyn til cellenumre og differentialfarvning i forhold til FACS-analysen. Fluorescerende mikroskopi giver imidlertid dybdegående information. Mikroskopisk analyse af makrofag engulfment af apoptotiske celler er afgørende for at undersøge makro Fages kapacitet og kinetik til at indtage apoptotiske celler. En time-lapse af hele indtagelse progression kan give detaljerede oplysninger om, hvor lang tid det tager at opsluge en apoptotiske celle, og hvor mange apoptotiske celler kan en enkelt makrofag indtage samtidig. Fagocytiske makrofager kan også analyseres af Western blot for at undersøge signalering molekyler reguleres af engulfment proces. Genekspression profiler forbundet med denne proces kan evalueres ved real time PCR.

Endelig udgør denne protokol en grundlæggende platform i den eksperimentelle analyse af efferocytose. Andre celletyper (dendritiske celler, mesangiale celler, epitelceller) kan også fungere til optagelse af apoptotiske celler på deres beboelses steder. Disse celler har præferencer i at udnytte forskellige receptorer til at genkende og indlede processen med apoptotiske celle clearance2. Den overordnede fagocytiske effektivitet kan være påvirket af flere faktorer, herunder eksperimentelle og celletype specifikke faktorer. De variable resultater, der rapporteres i litteraturen, skyldes sandsynligvis 1) samkulturens varighed. 2) ressource og forberedelse af fagocytter og apoptotiske celler; 3) metoder til at dissociere apoptotiske celler fra fagocytter. Den protokol, der er beskrevet her, kan gælde for de phagocytiske potentialer i andre celler. Optimering kan være nødvendig for at maksimere det phagocytiske potentiale af målceller. Vi har analyseret renal mesangialceller celle fagocytose af apoptotiske thymocytter genereret på samme måde som beskrevet i denne protokol. Neutrofiler spiller en central rolle i det medfødte immunsystem gennem eliminering af patogener. Neutrofile fagocytose af mærkede bakterier eller partikler kan analyseres ved flow cytometri26. Men, neutrofiler har en meget kort halveringstid (6-8 h) og neutrofile fagocytose af bakterier eller svampe opstår inden for sekunder til minutter27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forskning i Shao Lab understøttes af forsknings innovativ pris fra College of Medicine og Junior Faculty pilot Award fra Institut for intern medicin, University of Cincinnati og Grant DK K01_095067 fra NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).

Tags

Immunologi og infektion udstedelse 147 makrofag apoptotiske celler efferocytose immuno Fluorescens mikroskopi flow cytometri TAM receptor tyrosinkinaser
Eksperimentel analyse af apoptotisk Thymocyt engulfment af makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental… More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter