Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung von apoptotischen Thymozyten und peritonealen Makrophagen vor und analysieren die Effizienz der Eskrozytose und die spezifische hemmungsvermittelte Blockierung apoptotischer Thymozyten-Verengungen. Dieses Protokoll hat eine breite Anwendung in der zellvermittelten Räumung anderer Partikel, einschließlich künstlicher Perlen und Bakterien.
Abstract
Die Zellapoptose ist ein natürlicher Prozess und spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung, der homöostatischen Regulierung, der Immuntoleranzinduktion und der Auflösung von Entzündungen. Die Ansammlung von apoptotischen Schutt im Körper kann chronisch entzündliche Reaktionen auslösen, die im Laufe der Zeit zu systemischen Autoimmunerkrankungen führen. Die gestörte Apoptotikzellfreiheit wurde in eine Vielzahl von Autoimmunerkrankungen verwickelt. Die Apoptotikabstände sind ein komplexer Prozess, der selten unter physiologischen Bedingungen entdeckt wird. Es handelt sich um reichlich Oberflächenrezeptoren und Signalmoleküle. Die Untersuchung des Prozesses der apoptotischen Zellfreiheit bietet aufschlussreiche molekulare Mechanismen und anschließende biologische Reaktionen, die zur Entwicklung neuer Therapeutika führen können. Hier beschreiben wir Protokolle zur Induktion von apoptotischen Thymozyten, zur Herstellung von peritonealen Makrophagen und zur Analyse der apoptotischen Zellfreiheit durch Strömungszytometrie und Mikroskopie. Alle Zellen werden sich in einem bestimmten Stadium einer Apoptose unterziehen, und viele Wohn-und Umlaufzellen können apoptotische Trümmer aufnehmen. Daher kann das hier beschriebene Protokoll in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und-einnahme durch viele andere Zelltypen zu charakterisieren.
Introduction
Unser Körper erzeugt 1-10 Milliarden apoptotische Zellen täglich. Eine so große Anzahl apoptotischer Zellen muss so geklärt werden, dass die Immunreaktionen ruhig bleiben. Um die rechtzeitige Freigabe von apoptotischen Zellen zu gewährleisten, entwickeln zahlreiche Arten von Gewebezellen und zirkulierenden Zellen Mechanismen, um apoptotische Zellenzu verschlingen. Die Dysfunktionale Regulierung der Apoptose wurde in den Beginn und das Fortschreiten verschiedener entzündlicher Erkrankungen und der Autoimmunität2 in den Körper verwickelt. Die Apoptose spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Krebsentwicklung und ihrer anschließenden Resistenz gegen konventionelle Behandlungen3,4. Das Entfernen von apoptotischen Zellen fördert in der Regel eine entzündungshemmende Reaktion, die mit der immunologischen Toleranz in Verbindung gebracht werden kann 5. Die Störung der apoptotischen Zellfreiheit treibt die Selbstironie voran und trägt zur Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen bei.
Wenn sich die Zellen einer Apoptose unterziehen, setzen sie das Phosphatidylserin (PtdSer) vom inneren Flugblatt zum äußeren Merkblatt der Membran aus. PtdSer wird dann durch Oberflächenrezeptoren durch Phagozyten erkannt. Mehr als ein Dutzend Rezeptoren wurden identifiziert, um die Verengung von apoptotischen Zellen zu erkennen und zu erleichtern. In der Regel sind mindestens drei Arten von Oberflächenrezeptoren in den apoptotischen Zellabstand involviert: Tethering-Rezeptoren, Apoptotikzellen erkennen; Tickling-Rezeptoren, Auflösung auslösen; Begleitrezeptoren, erleichtern den gesamtenProzess 7. TAM-Rezeptor-Tyrosinkinasen (TAM RTKs) bestehen aus T yro-3, Axl und M er und werdenvor allem durch myeloide Zellen des Immunsystems8 ausgedrückt. Die primäre Funktion von TAM RTKs ist es, als innimmende Rezeptoren zu dienen, was die phagozytische Entfernung von apoptotischen Zellen und Schutt erleichtert. Unsere Fraktion hat seit vielen Jahren die Behandlung von TAM vermittelter apoptotischer Zellfreiheit im Rahmen der Autoimmunität untersucht. Das Vitamin K-abhängige Proteinwachstum verhaftet spezifisches Protein 6 (Gas6) und Protein S (ProS) bindetundaktiviert TAM-Rezeptoren 9,10. Gas6 wird im Herzen, in den Nieren und in der Lunge produziert. ProS wird hauptsächlich in der Leber 11produziert. TAM erkennt die apoptotischen Zellen so, dass das N-Terminal von Gas6/ProS auf einer apoptotischen Zelle an den PtdSer bindet und das C-Terminal von Gas6/ProS an TAM-Rezeptoren bindet, die auf der Oberfläche von Phagozyten verankert sind. Zusammen mit den anderen Rezeptoren erfolgt die Verengung der apoptotischen Zellen 12. Obwohl Mer sowohl an die Liganden ProS als auch Gas6 binden kann, haben wir festgestellt, dass Gas6 der einzige Ligand für die von der Mer-vermittelten Makrophage-Phagozytosederapoptotischen Zellen zu sein scheint, die durch den Anti-Mer-Antikörper 13 blockiert werden kann. Makrophagen sind professionelle Phagozyten. Die schnelle Räumung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen ist wichtig für die Hemmung von Entzündungen und Autoimmunreaktionen gegen intrazelluläre Antigene. Die Mer-Rezeptor-Tyrosinkinase ist entscheidend für die Makrophage-Gravur und die effiziente Räumung der apoptotischen Zellen 14. In der Maus-Milz drückt Mer vor allem auf die Randzoneundgreifbare Körpermakrophagen 13.
Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode, um die Zellapoptose zu induzieren und Wege aufzuzeigen, wie der Prozess und die Effizienz der Eskrozytose gemessen werden können. Diese Protokolle können leicht angepasst werden, um die Eerozytose durch andere Zelltypen in der Verengung von apoptotischen Zellen unterschiedlicher Herkunft zu untersuchen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In unserer Mäusekolonie wurden experimentelle Mäuse gezüchtet und gepflegt. Alle Tierarbeiten wurden nach den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität von Cincinnati durchgeführt.
1. Zubereitung von CFSE mit Apoptotic Thymozyten gekennzeichnet
- Zwei naive C57/B6-Mäuse mit CO2 -Inhalation für 10 min und Sekt, um die Brusthöhle zu öffnen, entfernen (ziehen) den Thymus mit gekrümmten Feinspitzen-Zangen in die Gewebekultur Petrischale mit 10 ml RPMI1640-Medium.
- Erhalten Sie eine Einzelzellaufhängung, indem Sie den gesamten Thymus an zwei gefrosteten Enden der Mikroskop-Dias schleifen und dann die Aufhängung durch 100 μm Zellstrainer filtern.
- Sammeln Sie die 10-mL-Thymianaufhängung in ein 50 mL Rohr und Zentrifuge mit 300 x g für 5 min.
- Entfernen Sie den Supernatant, erneuern Sie die Zahl der Supernatanten in 40 mL von 1x PBS und zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer.
- Zentrifuge bei 300 x g für 5 min und entfernen Sie den Supernatant.
- Wiederbelebung in 20 mL von 1x PBS in einem 50 mL-Rohr als Einzelzellaufhängung mit bis zu 2 x 108 Zellen (wenn mehr als 2 x 108 Zellen, den Rest der Zellen in weiteren 20 mL von 1 x PBS in einem anderen 50 mL-Rohr wiederbeleben).
- Machen Sie 5 μM CFSE in gleichem Volumen (20 mL) von 1x PBS in einem separaten 50 mL-Rohr, indem Sie 40 μL CFSE-Lager-Lösung (2,5 mM) in 20 mL von 1x PBS pipettieren und gut vermischen, indem Sie das Rohr 2-3 Mal umkehren.
- Fügen Sie die 20 mL CFSE von Schritt 1.7 in die 20 mL Zellaufhängung ab Schritt 1.6 (die Endkonzentration von CFSE beträgt jetzt 2,5 μM) hinzu.
Hinweis: Für jede 20 mL-Zellaufhängung wird eine 20 mL CFSE-Röhre benötigt. - Das Zell-und CFSE-Gemischrohr 2-3 Mal umdrehen und das Gemisch im Dunkeln bei Raumtemperatur für maximal 2 Minuten inkubieren, dann die Reaktion stoppen, indem man 10 ml wärmeinaktiviertes Pferdeserum hinzufügt.
- Zentrifuge das 50 mL Röhrengemisch bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
Hinweis: Wenn die CFSE-Kennzeichnung erfolgreich ist, wird das Zellpellet hellgelb. - Entfernen Sie das Supernatant und erneuern Sie das Zellpellet in 40 ml von 1x PBS und zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer.
- Die Zellaufhängung auf 300 x g für 5 min zentrifugen und das Supernatant abwerfen.
- Das Zellpellet wieder mit 40 ml RPMI1640-Medium waschen.
- Entfernen Sie die Supernatant-und Wiederbelebungszellen mit RPMI1640 Gewebekulturmedium (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (Hitze inaktiviert), 20 mM-Glutamin und 1x Pen/Strep) bei einer Konzentration von 7 x 106 cells/mL in einer 100-mm-Gewebekulturschale.
Achtung: Wenn mehr Zellen gewonnen werden, wird eine separate 100-mm-Gewebekulturschale benötigt. - Mit einer Endkonzentration von 1 μM und einer 4 h igen Kultur bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator, der mit 5% CO2geliefert wird, fügt man die alteineswörende Kultur in die Zellaufhängung ein.
2. Zubereitung von Peritonealmakrophagen
- Injektieren Sie zwei C57B6-Mäuse (oder alle genmanipulierten Mäuse im Labor) intraperitoneal mit 1 mL von 3% gealterter Thioglykollekate am Tag 0.
- Sterbebegleitung der Mäuse bei Tag 5 wie in Schritt 1.1, schneiden und schälen die Bauchhaut, aber lassen Sie das Peritoneum intakt. Spülen Sie die Peritonealhöhle, indem Sie schnell 10 ml Waschpuffer (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) in die Peritonealhöhle mit einer 10 mL-Spritze drücken, die mit einer 18-G-Nadel befestigt ist.
- Den Waschpuffer langsam mit der gleichen Nadle/Spritze abholen und den Waschpuffer in ein 50 mL-Rohr einsammeln (Details siehe Janssen Laborartikel 15).
- Waschen Sie die Peritonealgavage zweimal mit 1x PBS, erneuern Sie die peritonealen Makrophagen in RPMI1640 Gewebekulturmedium in einer Dichte von 2 x 10 6 cells/mL und Aliquot 500 μL in jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Lassen Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator für 2 Stunden.
- Entfernen Sie die schwimmenden Zellen, indem Sie die schwimmenden Zellen saugen und durch 500 μL frisches Kulturmedium ersetzen, zweimal.
- Optional wird der TAM-Rezeptor-Tyrosinkemhirus RXDX-106 in den in den Figurenlegenden angegebenen Konzentrationen in jeden Brunnen der Makrophage-Kultur und Inkubat für weitere 2 Stunden eingefügt.
3. Ko-Kultur der peritonealen Makrophagen mit apoptotischen Thymozyten
- Sammeln Sie apoptotische Thymozyten aus Schritt 1 und waschen Sie dreimal mit RPMI1640-Medium. Die Effizienz der apoptotischen Induktion lässt sich in dieser Phase mit dem Annexin V/7-AAD-Kit messen.
- Verteilen Sie 0-12 x 106 Zellen (im 500 μL-Medium) in jede StröAnhängschaft der Makrophage-Kulturen aus dem Protokoll #2 entsprechend der Versuchsanordnung (siehe Abbildung 1). Das macht das gesamte Kulturvolumen von 1 mL in jedem Brunnen der 24-Well-Platte aus. Den blockierenden Antikörper unmittelbar vor dem Zusatz von apoptotischen Thymozyten in die Kultur einfügen.
- Kultur die Zellmischung bei 37 ° C für 4 h in einer Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO2versorgt.
- Waschen Sie jeden Brunnen der Kultur mit 1x PBS (mit 500 μM EDTA) zweimal, um die frei schwebenden apoptotischen Zellen zu entfernen.
- In dieser Phase können Sie die plattengebundenen Makrophagen mit CD11b-PE festigen.
- Waschen Sie die plattengebundenen Makrophagen einmal mit dem Färbepuffer (1x PBS, 1% BSA).
- Fügen Sie 200 μL Fleckenpuffer hinzu, der 2 μL CD11b-PE enthält.
- Die Platte bei 4 ° C 20 min umbauen.
- Mit dem Färbepuffer den einzelnen Blechbrunnen dreimal waschen.
- Fügen Sie 200 μL Färbepuffer hinzu und fahren Sie die Platte für die Bildanalyse unter dem Leuchtstoffmikroskop fort.
- Alternativ können Sie die plattengebundenen Makrophagen abtrennen, indem Sie 1 mL mit 1 ml Lidocain in PBS hinzufügen und bei 37 ° C 10 Minuten inkubieren.
- Plattiert gebundene Makrophagen mit wiederholter Pipettierung lösen.
- Übertragen Sie die Makrophage-Aufhängung in ein individuelles 5-mL-Rundboden-FACS-Rohr aus jedem Brunnen der 24-well-Platte.
- Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
- Entfernen Sie das Supernatant und fügen Sie 200 μL Färspuffer hinzu, der 2 μL von CD11b-PE (1:200 Verdünnung im Färbepuffer) enthält.
- Die Zellaufhängung im Färbepuffer bei 4 ° C 20 min inspucken.
- Waschen Sie die Zellaufhängung zweimal mit Färbepuffer.
- Fügen Sie 200 μL Färspuffer hinzu und gehen Sie mit einem Flow-Cytometer zur FACS-Analyse über und analysieren Sie den Anteil der CFSE-Positivitätsmakrophagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analyse der peritonealen makrophage-vermittelten Verengung von apoptotischen Thymozyten. Peritoneale Makrophagen und apoptotische Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben vorbereitet und mitkultiviert. Macrophagen wurden abgetrennt und mit PE-konjugierten Anti-CD11b-Antikörper für 20 Minuten auf Eis befleckt. Makrophagen wurden dann gewaschen und in einem Strömungszytometer verarbeitet. Wie man sieht, gibt es kein positives Makrophage in der unteren rechten Seite, wenn keine apoptotischen Zellen in die Kultur aufgenommen wurden (Abbildung1A und Abbildung 2, erste Tafel). Thioglycollate-stimulierte peritoneale Makrophagen haben die variable Fähigkeit, apoptotische Zellen zu verschlingen. Bis zu 30% der Makrophagen zeigten sich im CFSE-Kanal positiv, was darauf hindeutet, dass sie in diesem Experiment mit CFSE-beschrifteten Apoptotikzellen aufgenommen wurden (Abbildung1). Es ist erwähnenswert, dass sich positive Makrophagen der CFSE aufgrund unterschiedlicher Intensitäten im unteren rechten Quadranten ausbreiten, was darauf hindeutet, dass die Anzahl der apoptotischen Zellen innerhalb der Makrophagen unterschiedlich ist. Daher ist die mikroskopische Beobachtung der Makrophagen-Verengung von apoptotischen Zellen unerlässlich, um die Fähigkeit von Makrophagen zu untersuchen, apoptotische Zellen zu aufnehmen (Abbildung2). Das höhere Verhältnis von apoptotischen Zellen zu Makrophagen erhöht nicht nur die Anzahl der Makrophagen, die apoptotische Zellen aufnehmen, sondern erhöht auch die Fähigkeit von Makrophagen, mehr apoptotische Zellen zu entnehmen (Abbildung2).
Dosenabhängige Hemmung der Eskrozytose durch Mer Blockade.
In einer anderen Reihe von Experimenten fanden wir heraus, dass etwa 15% der Makrophagen CFSE positiv wurden, als die mit CFSE beschrifteten apoptotischen Thymozyten (Ration von 6:1) für 4 Stunden in die Makrophage-Kultur aufgenommen wurden, was darauf hindeutet, dass es sich um die phagozytischen Makrophagen handelt (Abbildung 3). EineFunktion von Mer auf Makrophagen ist es, die Phagozytose der apoptotischen Zellen durch das Brückenmolekül Gas6 zu erkennen und zu vermitteln. Um den durch die Mer-Hemmung zugeschriebenen Anteil an der Eskerozytose zu testen, haben wir Anti-Man-Antikörper in die Kultur aufgenommen, um die mediierte Eskrozytose von Mer zu blockieren. Der Mer-Antikörper blockiert die Makrophage-Ephage in einer dosis-abhängigen Weise (Abbildung3 C, Abbildung3 D) und die Gesamtblockade kann etwa 30% der Wirkstoffeffizienz in der aktuellen Einstellung ausmachen (Abbildung3). , Diese Daten wurden auch in unserer vorherigen Studie mit Mer Knockout Makrophagen13 bestätigt. Anschließend testeten wir die Effizienz der Hemmung mit dem neu FDA zugelassenen TAM-Rezeptor-Inhibitor RXDX-106, der alle TAM-Rezeptoren mit unterschiedlichen Affinitäten hemmt (Axl>>Tyro3>Mer). RXDX-106 wurde 2 Stunden vor der Ko-Inkubation mit apoptotischen Thymozyten in die Makrophage-Kultur aufgenommen. Wie in Abbildung 4gezeigt, hat RXDX-106 die Makrophage-Eerozytose in einer dosis-abhängigen Weise gehemmt. Die gesättigte Hembitionskonzentration lag bei etwa100 nM (Abbildung 4, feste Linie), eine Konzentration, die wirksamer zu sein scheint als Mer-Männer-Mangel (Abbildung 4 gestrichelte Linie) oder Mer-Antikörper (Abbildung3, Tafel D) allein. Da Makrophage alle drei TAM-Rezeptoren auf der Oberfläche16ausdrückt, wird erwartet, dass höhere Konzentrationen von RXDX-106 (über 100 nM) alle drei Rezeptoren blockieren und daher effektiver bei der Blockierung der Eerozytose als Auf einen einzigen TAM-Rezeptor, Mer.
Bild 1 . Prozentsatz der Phagozytose der apoptotischen Thymozyten durch peritoneale Makrophagen. Apoptotische Thymozyten wurden durch Inkubation mit 1 mM Herzmus für 4 Stunden induziert und in die Makrophage-Kultur in einem Verhältnis, wie in den Figurentafeln angegeben, hinzugefügt: (A) 1:0; (B) 1:1; (C) 1:2; (D) 1:4; (E) 1:6; (F) 1:8; (G) 1:10; (H) 1:12. Die Daten wurden mit einem Strömungszytometer erfasst. Der Anteil der phagozytischen Makrophagen wurde mit der Software analysiert, die mit dem Strömungszytometer in Verbindung gebracht wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 2 . Mikroskopische Analyse der Eskrozytose. Die Aerozytose wurde wie in Abbildung1 vorbereitet. Phagozytische Makrophagen wurden vor Ort auf der Platte mit CD11b-PE befleckt, mit Paraformaldehyd fixiert und ausgewertet. Die Bilder wurden mit Hilfe des fluoreszierenden Mikroskops erfasst und mit der mit dem Mikroskop verbundenen Software analysiert. Die repräsentativen Einfügungen wurden digital vergrößert und unten in jedem Bild gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 3 . Hemmung der peritonealen Makrophage-Eskrozytose durch einen Anti-Mer-Antikörper. Apoptotische Zellen wurden mit Makrophagen für 4 Stunden, wie im Protokoll beschrieben, vorbereitet und kokultiviert. Anti-Mer Ab wurde unmittelbar vor der Ko-Kultur mit apoptotischen Zellen in die Makrophage-Kultur aufgenommen. Phagozytische Makrophagen wurden dann abgetrennt und mit Anti-Maus-CD11b-PE-Antikörper auf Eis für 20 min gefärbt. Daten wurden wie in Abbildung1 erfasst und analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 4 . RXDX-106 vermittelte die Hemmung der Makrophage-Eskrozytose. Die Efferozytose wurde wie in Abbildung3 beschrieben. RXDX-106 wurde zwei Stunden vor der Co-Kultur mit apoptotischen Thymozyten hinzugefügt. Die mangelhaften peritonealen Makrophagen wurden ähnlich vorbereitet und dienten als Kontrollgruppe. Die Daten wurden erfasst und der Anteil der phagozytischen Makrophagen auf CD11b-positiven Zellen abgeleitet und mit der Flow-Cytometer-Software analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Apoptose ist ein hochkonservierter Zelltod Prozess, der viele Signalkaskaden mit sich bringt und Proteinausdruck, Sekretion und Transport hervorruft. Die Apoptose wird oft mit den Veränderungen der Zellmorphologie 17 in Verbindung gebracht. Apoptotische Zellen setzen aktiv Zytokine und Chemokine frei, die Phagozyten anziehen, um auf die Website zu migrieren und den Prozess der Enge einzuleiten, ein extrem komplexer Pfad unter strenger Kontrolle18. Auf der anderen Seite setzt der Nekrotische Zelltod Gefahrensignale frei, die entzündliche Reaktionen auslösen 1. Eine fehlerhafte oder längere Räumung der apoptotischen Zellen führt zu einer sekundären Nekrose dieser Zellen19. Daher ist das Timing in der Apoptose-Induktion im Experiment sehr kritisch. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, Zellapoptose20zu induzieren. Die Dauer und Stärke der Induktion sind jedoch von Zelltypen abhängig. Wir empfehlen, ein Titration Experiment einzurichten, um den optimalen Zustand des Maximums zu bestimmen (90-95%) Apoptose-Produktion. Das Annexin-V/7-AAD Apoptotic Detection Kit wurde verwendet und die Anweisungen wurden in unserem Labor befolgt, um die apoptotische Effizienz zu bewerten. Unser Labor hat in der Vergangenheit zwei verschiedene Möglichkeiten ausprobiert, um Thymozyten-Apoptose zu induzieren. Gamma-Strahlung scheint eine bessere Methode zu sein, da sie keine chemischen Rückstände in der Kultur hat und nur wenige nekrotische Zelltote verursacht. Wir setzen Thymozyten 500 rad g-Strahlung aus, gefolgt von 4-h Kultur in RPMI1640-Medium. Wir beobachteten etwa 95% apoptotische Thymozyten13. Wenn ein Heizkörper nicht zur Verfügung steht, haben wir die Thymozyten dazu gebracht, sich mit 1 μM Herzosporin in der Kultur für 4 Stunden zu einer Apoptose zu unterziehen (Schritt 1.15). Primärzellen sind in der Regel empfindlicher gegen Apoptose-Induktion. Auch umfangreiche Waschschritte sind erforderlich, um die Chemikalien vor der Mitkultur mit Phagozyten aus der Kultur zu entfernen. Es gibt viele Möglichkeiten, apoptotische Zellen zu kennzeichnen. Obwohl die Toxizität mit hoher Konzentration verbunden ist, wird CFSE sehr effizient im Zytoplasma gehalten, wenn siesorgfältig optimiert wird. 21. PHrodo ist ein säuresensibler Farbstoff, der mit zunehmender Fluoreszenz zunimmt, da der pH-Wert der Umwelt abnimmt. Durch den niedrigen pH-Wert des Phagolysosomas lassen sich phagozytisierte apoptotische Zellen leicht von physisch befestigten, aber nicht verschlungen apoptotischen Zellen im Assay22unterscheiden.
Zahlreiche Oberflächenrezeptoren (TAM-Rezeptoren, Mannos-Rezeptoren, Integrine (CD11b/CD18), Spaßrezeptoren, Fc-Rezeptoren, et al) ermöglichen es Phagozyten, sich von Krankheitserregernzu unterscheiden und die nachfolgenden Reaktionen zu unterscheiden. Verschiedene Rezeptoren arbeiten zusammen, um einen recht komplexen Prozess zu beenden. Blockierung von Rezeptoren (n) wahrscheinlich zu einer teilweisen Hemmung der Phagozytose führen. Primäre Makrophagen können aus verschiedenen Ressourcen mit verschiedenen Methoden (Knochenmark abgeleitete Makrophagen, peritoneale Makrophagen, Milz Makrophagen, et al.). Der Vorteil von Thiogly-Sammlungen induzierten Makrophagen ist der verzerrte phagozytische Phagotyp der Makrophagen; Der Nachteil ist, dass Thioglycollate mindestens 3 Monate im Dunkeln gealtert werden muss. Die Thioglycollate-Lösung hat jedoch eine Haltbarkeit von 2 Jahren. Ein konstanter Bestand an der Lösung sollte diesen Nachteil überwinden. Bei der Herstellung von peritonealen Makrophagen sollte die Spurenmenge roter Blutkörperchen in der peritonealen Makrophage-Sammlung das Experiment nicht beeinflussen, da sie zusammen mit den schwimmenden Zellen nach 2 Stunden Makrophage-Kultur weggespült werden. Eine große Menge roter Blutkörperchen (sichtbares Pellet) kann eine Behandlung mit ACK-Lysingpuffer erfordern. Makrophagen neigen dazu, sich eng an die Kulturoberfläche zu halten. In der Literatur wurden verschiedene Methoden angeführt, um die Klebezellen von der Oberfläche24zu trennen. Die Enzement-basierte Ablösung führt zu den höchsten Zellregenerationen, kann aber Oberflächenrezeptoren schädigen, die Zellfunktion beeinträchtigen und damit verbundene Analysen durchführen. Die Veränderung der Oberflächenrezeptoren kann sich auch auf die Rezeptor-basierte Strömungszytometrie-Analyse auswirken. Lidocaine führt dazu, dass die Zellmorphologie durch die Blockade der Kalzium-Ionenkanäle 25 zu einer sphärenderen Konformation wechselt. Es ist der beste Weg, Makrophagen von der Oberfläche zu lösen, ohne dass es in unserem Experiment zu spürbaren Schäden kommt.
Makrophagen, die apoptotische Zellen enthalten, können durch Strömungszytomie-oder mikroskopbasierte Untersuchungen analysiert werden. FACS kann angewendet werden, um eine große Anzahl von Zellen in kurzer Zeit zu analysieren und kann die Zellsubtypen durch Differentialfärbung mit Antikörpern gegen die spezifische Oberfläche oder zytoplasmatische Proteine weiter identifizieren. Eine optimale Konzentration (Verhältnis) der apoptotischen Zellzahlen im Ko-Kultur-System kann auch durch die FACS-Analyse entschieden werden. Die mikroskopische Analyse hat im Vergleich zur FACS-Analyse Einschränkungen in Bezug auf Zellzahlen und Differentialfärbung. Die fluoreszierende Mikroskopie liefert jedoch detaillierte Informationen. Die mikroskopische Analyse des Makrophagen-Engagements von apoptotischen Zellen ist unerlässlich, um die Kapazität und die Kinetik von Makrophagen zu untersuchen, um apoptotische Zellen zu sich zu nehmen. Ein Zeitraffer des gesamten Einachsverlaufs kann detaillierte Informationen darüber liefern, wie lange es dauert, eine apoptotische Zelle zu verschlingen, und wie viele apoptotische Zellen gleichzeitig ein einziges Makrophage aufnehmen können. Phagozytische Makrophagen können auch von Western Blot analysiert werden, um Signalmoleküle zu untersuchen, die durch den Grabprozess reguliert werden. Die mit diesem Prozess verbundenen Genexpressionsprofile können mit EchtzeitPCR bewertet werden.
Schließlich bietet dieses Protokoll eine grundlegende Plattform in der experimentellen Analyse der Eskerozytose. Auch andere Zelltypen (dendritische Zellen, mesangiale Zellen, Epithelzellen) können funktionieren, um apoptotische Zellen an ihren Wohngebieten aufzunehmen. Diese Zellen haben Vorlieben, verschiedene Rezeptoren zu verwenden, um den Prozess der apoptotischen Zellfreiheit zu erkennen undzu initiieren. Die gesamte phagozytische Effizienz kann durch mehrere Faktoren beeinflusst werden, darunter experimentelle und zelltypspezifische Faktoren. Variable Ergebnisse, die in der Literatur berichtet werden, sind wahrscheinlich auf 1) Dauer der Ko-Kultur zurückzuführen; 2) Ressource und Zubereitung von Phagozyten und apoptotischen Zellen; 3) Methoden, um die apoptotischen Zellen von Phagozyten zu trennen. Das hier beschriebene Protokoll kann für das phagozytische Potenzial anderer Zellen gelten. Optimierung kann erforderlich sein, um das phagozytische Potenzial von Zielzellen zu maximieren. Wir haben die Nierenmesangialphagozytose von apoptotischen Thymozyten analysiert, die auf die gleiche Weise erzeugt werden, wie in diesem Protokoll beschrieben. Neutrophilen spielen eine Schlüsselrolle im angeborenen Immunsystem durch die Eliminierung von Krankheitserregern. Neutrophile Phagozytose von beschrifteten Bakterien oder Partikeln kann durch Strömungszytometrie26analysiert werden. Neutrophilen haben jedoch eine sehr kurze Halbwertszeit (6-8 h) und die Neutrophilen Phagozytose von Bakterien oder Pilzen tritt innerhalb von Sekunden biszuMinuten27,28auf.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Forschung im Shao Lab wird unterstützt durch den Research Innovative Award des College of Medicine und den Junior Faculty Pilot Award von der Abteilung für Innere Medizin der Universität Cincinnati und gewähren DK K01_095067 von NIDDK/NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
- Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
- Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
- Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
- Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
- Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
- Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
- Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
- Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
- van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
- Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
- Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
- Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
- Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
- Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
- Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
- Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
- Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
- Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
- Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
- Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).
