Summary
ここでは、アポトーシス胸腺細胞および腹膜マクロファージを調製するためのプロトコールを提示し、efferocytosis の効率および特異的阻害剤媒介性貪食のアポトーシス胸腺細胞のブロッキングを分析する。このプロトコルは、人工ビーズおよび細菌を含む他の粒子の細胞媒介性クリアランスにおいて広範な適用を有する。
Abstract
細胞のアポトーシスは自然なプロセスであり、胚発育、恒常性調節、免疫寛容誘導、および炎症の解決において重要な役割を果たします。体内のアポトーシス破片の蓄積は、時間をかけて全身性自己免疫疾患につながる慢性炎症反応を引き起こす可能性があります。アポトーシス細胞の障害は、様々な自己免疫疾患に関与している。アポトーシスクリアランスは、生理的条件下で稀に検出される複雑なプロセスである。それは豊富な表面受容体とシグナル分子を含みます。アポトーシス細胞クリアランスの過程を研究することは、洞察力のある分子メカニズムとその後の生物学的反応をもたらし、新しい治療法の開発につながる可能性があります。ここでは、アポトーシス胸腺細胞の誘導に関するプロトコール、腹膜マクロファージの調製、およびフローサイトメトリーおよび顕微鏡法によるアポトーシス細胞クリアランスの解析について説明します。すべての細胞は特定の段階でアポトーシスを受け、多くの住宅および循環細胞はアポトーシスの破片を吸収することができます。したがって、ここで説明するプロトコルは、多くのアプリケーションで、アポトーシス細胞の結合および他の多くの細胞型による摂取を特徴付けるために使用することができる。
Introduction
私たちの体は、毎日1-10 のアポトーシス細胞を生成します。このような多数のアポトーシス細胞は、免疫応答が静止したままである方法でクリアされなければならない。アポトーシス細胞のクリアランスを適時に確保するために、多数の種類の組織の居住細胞および循環細胞がアポトーシス細胞1を巻き込むメカニズムを開発する。アポトーシスの機能不全調節は、様々な炎症性疾患および自己免疫2の発症および進行に関与している。アポトーシスはまた、癌の発症の病因および従来の治療法3,4に対するその後の耐性において重要な役割を果たす。アポトーシス細胞の除去は、一般に抗炎症反応を促進し、これは免疫学的許容寛容に結合し得る5。アポトーシス細胞クリアランスの障害は、自己免疫を促進し、ヒトおよびマウス6の両方における全身性自己免疫疾患の発症に寄与する。
細胞がアポトーシスを受けると、それらは内部リーフレットから膜の外側リーフレットにホスファチジルセリン (PtdSer) を暴露する。PtdSer は、その後、表面受容体を介して食細胞によって認識されるであろう。1ダース以上の受容体がアポトーシス細胞の貪食を認識および/または促進することが同定されている。一般に、アポトーシス細胞クリアランスには少なくとも3種類の表面受容体が関与する: テザリング受容体は、アポトーシス細胞を認識する。貪食のくすぐり, 開始します。chaperoning 受容体は、全体のプロセス7を促進する。TAM 受容体チロシンキナーゼ (TAM RTKs) は、 Tyro-3、 xl、およびMer から成り、主に免疫系8の骨髄細胞によって発現される。TAM RTKs の主な機能は、テザリング受容体としての役割を果たし、アポトーシス細胞や破片の貪食除去を促進することです。当社グループは、長年にわたり自己免疫の設定において、TAM 媒介性アポトーシス細胞クリアランスを研究してきました。ビタミン K 依存性タンパク質成長停止特異的タンパク質 6 (Gas6) およびプロテイン S (ProS) は、TAM 受容体9,10に結合し、活性化する。Gas6 は、心臓、腎臓、および肺で生成されます。長所は主に肝臓11で生産される。TAM は、Gas6/ProS の N 末端がアポトーシス細胞上の PtdSer に結合するような方法でアポトーシス細胞を認識し、Gas6/プロの C 末端は食細胞の表面に固定された TAM 受容体に結合します。他の受容体と共に、アポトーシス細胞の貪食が12に生じる。Mer はリガンドの長所と Gas6 の両方に結合することができますが、Gas6 は、抗 Mer 抗体13によってブロックすることができる、アポトーシス細胞の mer 媒介マクロファージ食のための唯一のリガンドであると思われることがわかりました。マクロファージはプロの食細胞です。マクロファージによるアポトーシス細胞の迅速なクリアランスは、細胞内抗原に対する炎症や自己免疫反応の阻害にとって重要である。Mer 受容体チロシンキナーゼは、マクロファージ貪食およびアポトーシス細胞14の効率的なクリアランスにとって重要である。マウス脾臓では、Mer は主にマージナルゾーンおよび有形の体マクロファージ13上に発現する。
ここで提示されるプロトコルは、細胞のアポトーシスを誘導し、プロセスと efferocytosis の効率を測定する方法を示すための基本的な方法を説明しています。これらのプロトコールは、異なる起源のアポトーシス細胞の貪食における他の細胞型による efferocytosis の研究に容易に適応することができる。
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Protocol
実験マウスを、我々のマウスコロニーにおいて飼育および維持した。すべての動物の仕事は、シンシナティ大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) のガイドラインに従って行われました。
1. CFSE 標識されたアポトーシス胸腺細胞の調製
- Euthanize を10分間吸入して 2つのナイーブ C57/B6 マウスを解剖し、胸腔を開いて、湾曲した微細先端鉗子を有する胸腺を rpmi1640 培地培地 10 mL を含む組織培養ペトリ皿に取り出し (引き抜く)。
- 顕微鏡のスライドの2つの曇りの端に対して全体の胸腺を粉砕し、100μ m の細胞ストレーナーを介して懸濁液を濾過することにより、単一細胞懸濁液を得る。
- 10 mL の胸腺懸濁液を 50 mL チューブに集め、300 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を除去し、1x PBS の 40 mL で再懸濁し、血球計数器で細胞数をカウントする。
- 300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。
- 再懸濁は、1つの細胞懸濁液として 50 mL チューブ中に 20 mL の 1x PBS (2 x 10 8 細胞以上の場合は、残りの細胞を別の 50 ml チューブ中の 1 x PBS で再懸濁) にしました。
- 5μ m の CFSE を、CFSE ストック溶液 (2.5 mM) の40μ l を 1x PBS の 20 mL にピペットで50し、チューブ 2-3 回を反転させることによってよく混ぜることによって、別の 1 mL (20 mL) の 1x PBS を1つの容積 (20ml) で作ります。
- ステップ1.7 から CFSE の20ml をステップ1.6 からの細胞懸濁液の20ml に加える (CFSE の最終濃度は現在2.5 μ m である)。
注:20 mL の細胞懸濁液ごとに、20 mL の CFSE チューブが必要です。 - 細胞と CFSE 混合チューブを 2-3 回反転させ、室温で2分間の暗所で混合物をインキュベートしてから、10 mL の熱不活性化ウマ血清を加えて反応を停止する。
- 室温で5分間 300 x gで 50 mL チューブ混合物を遠心分離します。
注: CFSE ラベリングが成功すると、セルペレットは淡黄色になります。 - 上清を取り除き、40 mL の細胞ペレットを 1x PBS で再懸濁し、血球計数器で細胞数をカウントする。
- 細胞懸濁液を 300 x gで5分間遠心し、上清を廃棄する。
- 40 mL の RPMI1640 培地培地で再び細胞ペレットを洗浄する。
- 上清および再懸濁細胞を RPMI1640 培地組織培養培地 (RPMI1640 培地、20 mM HEPES、10% FBS (熱不活性化)、20 mM グルタミン、および1x ペン/喉頭炎) で除去し、100 mM組織培養皿にて 7 x 106 細胞/ml の濃度で行う。
注: より多くの細胞が得られる場合、別の 100 mm のティッシュの培養皿は必要である。 - 5% の CO2 で供給される組織培養インキュベーター内で、最終濃度1μ m の細胞懸濁培養にスタウロスポリンを加え、37° cで4時間培養する。
2. 腹膜マクロファージの作製
- 2つの C57B6 マウス (または実験室にある任意の遺伝子操作マウス) を、0日目に 3% 熟成したチオグリコール酸の1ml と共に腹腔内に注入する。
- Euthanize はステップ1.1 のように5日目にマウスを切断し、腹部の皮膚を切り取って皮を開け、腹膜をそのまま残す。10 ml の洗浄緩衝液 (RPMI1640 培地、2% FBS、0.04% EDTA) を 18 G 針で取り付けた10ml シリンジを使用して腹腔内にすばやく押し込むことによって腹膜腔を洗い流す。
- 同じ針/シリンジで洗浄緩衝液をゆっくりと回収し、洗浄緩衝液を 50 mL チューブに集めます (詳細はヤンセンラボの第15条を参照してください)。
- 腹膜 gavage を 1x PBS で2回洗浄し、RPMI1640 培地の組織培養培地中の腹膜マクロファージを、再懸濁プレートの各ウェルに 2 x 106 細胞/ml およびアリコート500μ l の密度で注入する。プレートを2時間組織培養インキュベーター内に残します。
- 500μ l のフレッシュカルチャー培地を2回吸引し、交換することにより、浮遊細胞を取り除きます。
- 必要に応じて、マクロファージ培養の各ウェルに図の凡例に示されている濃度で TAM 受容体チロシン阻害剤、RXDX-106 を追加し、別の2時間インキュベートします。
3. アポトーシス性胸腺細胞による腹膜マクロファージの共培養
- ステップ1からアポトーシス胸腺細胞を収集し、RPMI1640 培地培地で3回洗浄する。アポトーシス誘導の効率は、アネキシン V/7-AAD キットを使用してこの段階で測定することができます。
- プロトコル #2 からマクロファージ培養物の各ウェルに 0-12 x 106 個の細胞 (500 μ l 培地) を分配し、実験的な配置に従って (例えば、図 1を参照)。これにより、24ウェルプレートの各ウェルにおける 1 mL の全培養体積が可能になる。アポトーシス胸腺細胞の添加直前にブロッキング抗体を培養に加える。
- 培養液を 5% CO2 で供給した組織培養インキュベーター中で4時間37° cで混合する。
- 自由浮遊アポトーシス細胞を除去するために 1x PBS (500 μ m EDTA を含む) で培養の各ウェルを洗浄します。
- この段階で、CD11b でプレート結合マクロファージを染色する。
- 染色バッファー (1x PBS, 1% BSA) を用いてプレート結合マクロファージを1回洗浄する。
- 各ウェルに2μ l の CD11b を含む200μ l の染色緩衝液を加えます。
- プレートを4° c で20分間インキュベートします。
- 染色緩衝液でプレートの各ウェルを3回洗浄する。
- 200μ l の染色緩衝液を加え、蛍光顕微鏡下での画像分析のためにプレートを進行させる。
- あるいは、PBS に 1% リドカインの1ml を加え、37° c で10分間インキュベートすることによって、プレート結合性マクロファージを切り離します。
- 繰り返しピペッティングを使用して、プレート結合マクロファージをデタッチします。
- マクロファージ懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルからの個々の5ml の丸底 FACS チューブに移す。
- 300 x gで5分間遠心します。
- 上清を除去し、2μ l の CD11b (染色バッファー中の1:200 希釈) を含む200μ l の染色緩衝液を加えた。
- 染色バッファー内の細胞懸濁液を4° c で20分間インキュベートします。
- 細胞懸濁液を染色緩衝液で2回洗浄する。
- 200μ l の染色バッファーを加え、フローサイトメーターを用いて FACS 分析を行い、CFSE 陽性マクロファージの割合を分析します。
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Representative Results
腹膜マクロファージを媒介とするアポトーシス胸腺細胞の貪食の解析腹膜マクロファージおよびアポトーシス細胞を調製し、プロトコールで説明したように共培養した。マクロファージを、氷上で20分間にわたって PE 共役抗 CD11b 抗体で剥離および染色した。その後、マクロファージをフローサイトメーターで洗浄・処理した。見られるように、アポトーシス細胞が培養物に加えられなかったとき、右下の象限に CFSE 陽性マクロファージは存在しない (図 1Aおよび図 2、最初のパネル)。チオグリコール酸を刺激した腹腔マクロファージは、アポトーシス細胞を巻き込む可変容量を有する。マクロファージの最大 30% が CFSE チャネルで陽性を示し、この実験で CFSE 標識されたアポトーシス細胞を摂取したことを示した (図 1)。CFSE 陽性マクロファージが異なる強度のために右下の象限に広がることに注意する価値があり、マクロファージ内のアポトーシス細胞の数が異なることを示す。そのため、マクロファージ貪食のアポトーシス細胞を顕微鏡観察することは、マクロファージがアポトーシス細胞を摂取する能力を調べるために不可欠である (図 2)。アポトーシス細胞のマクロファージへの比率が高いほど、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの数が増えるだけでなく、マクロファージがより多くのアポトーシス細胞を摂取する能力も増強される (図 2)。
Mer 閉塞による efferocytosis の用量依存性の阻害。
別の実験セットでは、CFSE に標識されたアポトーシス胸腺細胞 (6:1 の CFSE) がマクロファージ培養に4時間に加えられると、マクロファージの約 15% が陽性になり、貪食マクロファージであることを示した (図 3B.マクロファージにおける Mer の機能の1つは、架橋分子である Gas6 を介してアポトーシス細胞の食作用を認識し、媒介することである。Mer 阻害によって帰因する efferocytosis の割合を試験するために、培養物に抗 Mer 抗体を添加し、Mer 媒介 efferocytosis をブロックした。Mer 抗体は、用量依存的にマクロファージ efferocytosis をブロックし (図3C、図 3D)、全体的な閉塞が現在の設定における efferocytosis 効率の約 30% を占めることがある (図 3)。、このデータは、Mer ノックアウトマクロファージ13との我々の以前の研究でも確認された。その後、新たに FDA が承認した TAM 受容体阻害剤 RXDX-106 が、異なる親和性 (Axl > > Tyro3 > Mer) を持つすべての TAM 受容体を阻害することで、阻害の効率を試験しました。RXDX-106 は、アポトーシス胸腺細胞との共培養の2時間前にマクロファージ培養液に添加された。図 4に示すように、RXDX-106 は、用量依存的にマクロファージ efferocytosis を阻害した。飽和阻害濃度は約 100 nM (図 4、実線)、mer (図4の点線) または mer 抗体 (図3、パネル D) 単独でより効果的であると思われる濃度であった。マクロファージは表面16上の3つの TAM 受容体すべてを発現するので、より高い濃度の RXDX-106 (100 nM 以上) が3つの受容体すべてをブロックすることが期待され、したがって、より efferocytosis をブロックするのにより効果的であろう。単一の TAM 受容体である Mer をターゲットにします。
図 1.腹膜マクロファージによるアポトーシス胸腺細胞の貪食作用の割合アポトーシス胸腺細胞は、1 mM のスタウロスポリンを用いて4時間インキュベートすることによって誘導され、図パネルに示されるような比率でマクロファージ培養に添加される:(a) 1:0;(B) 1:1;(C) 1:2;(D) 1:4;(E) 1:6;(F) 1:8;(G) 1:10;(H) 1:12。データをフローサイトメーターで取得した。フローサイトメーターに関連するソフトウェアを使用して貪食マクロファージの割合を分析した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.Efferocytosis の顕微鏡分析。Efferocytosis は図 1のようにして用意した。貪食マクロファージを CD11b でプレート上にその場で染色し、パラホルムアルデヒドで固定し、評価した。画像を蛍光顕微鏡を用いて取得し、顕微鏡に関連するソフトウェアで分析した。代表的な挿入をデジタルで拡大し、各画像に以下に示す。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.抗 Mer 抗体による腹腔マクロファージ efferocytosis の阻害。アポトーシス細胞を調製し、このプロトコールに記載されているように4時間のマクロファージと共培養した。抗 Mer Ab は、アポトーシス細胞との共培養の直前にマクロファージ培養に加えられた。その後、20分間氷上で抗マウス CD11b 抗体で貪食マクロファージを剥離し、染色した。データを取得し、図 1のように分析した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.RXDX-106 マクロファージ efferocytosis の媒介性阻害。Efferocytosis は、図 3に記載されているように設定した。RXDX-106 をアポトーシス胸腺細胞との共培養の2時間前に加えた。Mer 欠損腹膜マクロファージを同様に調製し、対照群とした。データを取得し、貪食マクロファージの割合を CD11b 陽性細胞にゲートし、フローサイトメーターソフトウェアを用いて分析した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
アポトーシスは、多くのシグナルカスケードを含み、タンパク質の発現、分泌、および輸送を誘導する高度に保存された細胞死プロセスです。アポトーシスは、しばしば細胞形態変化17に関連する。アポトーシス細胞は、食細胞を誘引するサイトカインおよびケモカインを積極的に放出し、貪食のプロセスを開始し、タイトコントロール18の下で非常に複雑な経路である。一方、壊死細胞死は、炎症反応を引き起こす危険信号を放出する1.アポトーシス細胞の欠損または長期のクリアランスは、これらの細胞19の二次壊死につながる。したがって、アポトーシス誘導におけるタイミングは、実験において非常に重要である。細胞アポトーシス20を誘導するための多数の方法がある。しかしながら、誘導の持続時間および強度は、細胞型に依存する。最大の最適条件を決定するために滴定実験を設定することをお勧めします (90-95%)アポトーシスの生産。アネキシン-V/7-AAD アポトーシス検出キットが使用され、アポトーシス効率を評価するために本研究室で指示が続きました。私たちの研究室は、過去の胸腺細胞のアポトーシスを誘導する2つの異なる方法を試みました。ガンマ線は、培養液に化学的残差がなく、壊死細胞死がほとんど誘発されないため、より良い方法であると思われる。我々は、RPMI1640 培地の中に 4 h の培養が続いて、g-放射線の 500 rad に胸腺細胞を暴露する。約 95% のアポトーシス胸腺細胞13を観察した。ラジエータが利用可能でない場合、我々は、培養物中の1μ m のスタウロスポリンを用いて4時間にわたってアポトーシスを起こすように胸腺細胞を誘導した (ステップ 1.15)。一次細胞は一般的にアポトーシス誘導に対してより敏感です。食細胞と共培養する前に、培養物から化学物質を除去するために、広範な洗浄工程も必要とされます。アポトーシス細胞の標識には多くの方法があります。毒性は高濃度に関連しているが、CFSE は、慎重に最適化された21を、細胞質の中に非常に効率的に保持する。pHrodo は酸感受性染料であり、環境の pH が低下するにつれて蛍光が増加する。ファゴリソソームの低い pH のために、phagocytized アポトーシス細胞は、アッセイ22中に物理的に付着したがアポトーシス細胞を飲み込まずに容易に区別することができる。
多数の表面受容体 (TAM 受容体、マンノース受容体、インテグリン (CD11b/CD18)、スカベンジャー受容体、Fc レセプター、et al) は、自己を病原体と区別し、その後の応答を判別することを可能にします。23.異なる受容体は、かなり複雑なプロセスを完了するために一緒に動作します.ブロッキング受容体 (複数可) は、貪食作用の部分的な阻害をもたらす可能性がある。一次マクロファージは、様々な方法 (骨髄由来マクロファージ、腹膜マクロファージ、脾臓マクロファージ、et al.) を有する異なる資源から調製することができる。チオグリコール酸誘発マクロファージの利点は、マクロファージの偏った貪食表現型である。欠点は、チオグリコール酸が少なくとも3ヶ月の暗闇の中で熟成させる必要があるということです。しかし、チオグリコール酸溶液は、2年の貯蔵寿命を有します。溶液の一定のストックは、この欠点を克服する必要があります。腹膜マクロファージの調製において、腹膜マクロファージ収集における赤血球の微量量は、マクロファージ培養の2時間後に浮遊細胞と共に洗い流されることになるので、実験に影響を与えてはならない。大量の赤血球 (目に見えるペレット) は、ACK 溶解するバッファーでの処理を必要とすることがある。マクロファージは培養表面にしっかりと付着する傾向がある。文献には異なる方法が引用されており、表面24から接着細胞を剥離する。酵素系剥離は最高レベルの細胞回復をもたらしますが、表面受容体を損傷し、細胞機能や関連分析を損なうことがあります。表面受容体の改変は、受容体ベースのフローサイトメトリー解析にも影響を及ぼす可能性がある。リドカインは、カルシウムイオンチャネル25の封鎖により、細胞形態をより球状の高次構造に変化させる。実験に顕著な損傷を与えることなく、マクロファージを表面から切り離す最善の方法です。
アポトーシス細胞を含むマクロファージは、フローサイトメトリーベースまたは顕微鏡ベースのアッセイによって分析することができる。FACS は、短時間で多数の細胞を分析するために適用することができ、さらに特定の表面または細胞質蛋白質に対する抗体との鑑別染色によって細胞亜型を同定することができる。また、共培養系におけるアポトーシス細胞数の最適濃度 (比) も FACS 分析によって決定することができる。顕微鏡分析では、FACS 分析と比較して、細胞数および微分染色に関する制限があります。しかし、蛍光顕微鏡検査は、詳細な情報を提供します。アポトーシス細胞のマクロファージ貪食の微視的分析は、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの容量と動態を調べるために不可欠である。全摂取進行のタイムラプスは、1つのアポトーシス細胞を巻き込むのにかかる時間と、1つのマクロファージが同時に摂取できるアポトーシス細胞の数に関する詳細な情報を提供することができる。貪食マクロファージは、貪食プロセスによって調節されるシグナル伝達分子を調べるためにウェスタンブロットによって分析することもできる。このプロセスに関連する遺伝子発現プロファイルは、リアルタイム PCR によって評価することができる。
最後に、このプロトコルは、efferocytosis の実験的分析における基本的なプラットフォームを提供する。他の細胞型 (樹状細胞、メサンギウム細胞、上皮細胞) は、それらの居住部位でアポトーシス細胞を取り込みする機能も有する。それらの細胞は、異なる受容体を利用してアポトーシス細胞クリアランス2のプロセスを認識して開始するという好みを有する。全体的な貪食効率は、実験的および細胞型特有の要因を含むいくつかの要因によって影響されるかもしれない。文献に報告された変数結果は、おそらく 1) 共培養の期間によるものである。2) 食細胞とアポトーシス細胞の資源と準備;3) 食細胞からアポトーシス細胞を解離させる方法。ここで説明するプロトコルは、他の細胞の貪食能に適用される可能性がある。最適化は、標的細胞の貪食能を最大化するために必要とされ得る。我々は、このプロトコルに記載されているのと同じ方法で生成したアポトーシス胸腺細胞の腎メサンギウムを分析した。好中球は、病原体の排除を通じて自然免疫系において重要な役割を果たす。標識された細菌または粒子の好中球貪食作用は、フローサイトメトリー26によって分析することができる。しかし、好中球は、非常に短い半減期 (6-8 h) を有し、細菌または真菌の好中球貪食作用は、数秒から数分の27、28で生じる。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
シャオ・ラボの研究は、医学部からの革新的な賞と、シンシナティ大学の内部医学部門からの若手教員パイロット賞と NIDDK/NIH からのグラント DK K01_095067 によって支えられています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ack lysing buffer | GIBCO | A10492 | |
| Annexin V/7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| Anti-Mer antibody | R&D Systems | BAF591 | |
| CD11b-PE (clone M1/70) | BD Pharmingen | 553311 | |
| CFSE | Invitrogen | C1157 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-2650 | |
| EDTA (0.5 mM) | GIBCO | 15575-020 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352017 | |
| Frosted slides | Fisher Scientific | 12-552-343 | |
| Horse Serum (Heat-inactivated) | Invitrogen | 26050088 | |
| Lidocaine | Sigma-Aldrich | L-5647 | Prepare 1% buffer in 1x PBS |
| PBS, 1x | Corning | 21040CV | |
| RPMI-1640 | Corning | 10040CV | |
| RXDX-106 | Selleck Chemicals | CEP-40783 | |
| Staurosprine (100mg) | Fisher Scientific | BP2541-100 | Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution |
| Thioglycolate Medium Brewer Modified | BD Biosciences | 243010 | Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months. |
References
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