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Immunology and Infection

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

여기서, 우리는 사 멸 티 모 세포와 복 막 대 식 세포를 준비 하 고 efferocytosis 및 특정 억제제의 효율성을 분석 하 사 멸 티 모 세포의 침 지에 관한 프로토콜을 제시 한다. 이 프로토콜은 인공 구슬과 박테리아를 포함 한 다른 입자의 세포 매개 클리어런스에 광범위 한 응용 프로그램을가지고 있습니다.

Abstract

세포 자 멸은 자연 스러운 과정으로 서 배아 발달, 항상성 조절, 면역 내성 유도 및 염증의 해결에 중요 한 역할을 한다. 바디에 있는 사 멸 파편의 축적은 시간이 지남에 따라 전신 자기 면역 질병으로 이끌어 내는 만성 선 동적인 반응을 시작할 수 있습니다. 손상 된 사 멸 세포 클리어런스는 다양 한 자가 면역 질환에 연루 되었습니다. 사 멸 클리어런스는 생리학적 조건에서 거의 검출 되지 않는 복잡 한 과정입니다. 그것은 풍부한 표면 수용 체 및 신호 분자를 포함 한다. 사 멸 세포 클리어런스 과정을 연구 하는 것은 통찰력 있는 분자 메커니즘과 후속 생물학적 반응을 제공 하 여 새로운 치료제의 발달로 이어질 수 있습니다. 여기에서 우리는 사 멸 티 모 세포의 유도를 위한 프로토콜, 복 막 대 식 세포의 준비, 유 세포 분석기 및 현미경 검사 법에의 한 사 멸 세포 클리어런스 분석을 설명 합니다. 모든 세포는 특정 단계에서 아 폽 토시 스를 겪을 것 이며, 많은 주거 및 순환 세포는 사 멸 파편을 흡수 할 수 있다. 따라서 여기에 설명 된 프로토콜은 많은 다른 세포 유형에 의해 사 멸 세포 결합 및 섭취를 특성화 하기 위해 여러 응용 프로그램에서 사용 될 수 있습니다.

Introduction

우리 몸은 매일 1-10 억 사 멸 세포를 생성 합니다. 이러한 많은 수의 사 멸 세포는 면역 반응이 정지 상태를 유지 하는 방식으로 지워야 합니다. 적시에 사 멸 세포의 틈새를 지키기 위하여는, 조직 주민 세포의 수많은 모형 및 회람 세포는 사 멸 세포를 삼 켜 하는 기계 장치를 개발 합니다1. 아 폽 토시 스의 기능 장애 조절은 다양 한 염증 성 질환 및 자기 면역의 발병 및 진행에 연루 되어 있다2. 아 폽 토시 스는 또한 종래의 치료법3,4에 대 한 그의 후속 내성 및 암 발병의 발병 기 전에 서 중요 한 역할을 한다. 사 멸 세포의 제거는 일반적으로 면역 내성5에 연결 될 수 있는 항 염증 반응을 촉진 합니다. 사 멸 세포 클리어런스의 교란은 자기 면역을 촉진 하 고 인간 및 생쥐6의 전신 자가 면역 질환의 발병에 기여 합니다.

세포가 아 폽 토시 스를 겪을 때, 그들은 포스 파티 딜 세 린 (PtdSer)을 내부 리플 렛에서 멤브레인의 외부 리플 렛에 노출 시킵니다. PtdSer는 표면 수용 체를 통해 식 세포에 의해 인식 될 것입니다. 12 개 이상의 수용 체는 사 멸 세포의 침 몰을 인식 및/또는 촉진 하는 것으로 확인 되었습니다. 일반적으로, 사 멸 세포 클리어런스에 관여 하는 표면 수용 체의 적어도 3 가지의 종류가 있습니다: 테 더 링 수용 체, 사 멸 세포를 인식; 수용 체 간 질, 침 몰 시작; 수용 체, 전체 과정을 용이 하 게7. 탐 수용 체 티로신 키나 제 (TAM RTKs)는 Tyro-3, xl 및 Mer로 구성 되 고 주로 면역 시스템 (8)의 골수성 세포에 의해 표현 된다. TAM RTKs의 주된 기능은 테 더 링 수용 체 역할을 하 여 사 멸 세포와 파편의 포식 제거를 촉진 하는 것입니다. 우리 그룹은 수 년 동안 자동 면역의 설정에서 TAM 매개 사 멸 세포 클리어런스를 연구 했습니다. 비타민 K-의존성 단백질 성장 체포 특이 단백질 6 (Gas6) 및 단백질 S (프로)는 탐 수용 체를 결합 및활성화 시킨다. Gas6는 심장, 신장 및 폐에서 생산 됩니다. 프로는 주로 간에 서 생산11. TAM은 Gas6/프로의 N-말단이 사 멸 세포에 PtdSer에 결합 하 고 Gas6/프로의 C-말단을 식 세포의 표면에 부착 된 탐 수용 체에 결합 하는 방식으로 사 멸 셀을 인식 한다. 다른 수용 체와 함께, 사 멸 세포의 침 몰은 발생12. Mer는 리간드 프로와 Gas6 모두에 결합할 수 있지만, 우리는 항-메 르 항 체 (13)에 의해 차단 될 수 있는 사 멸 세포에 대 한 mer 매개 식 세포의 포식에 대 한 유일한 리간드 인 것으로 Gas6 것으로 나타났습니다. 대 식 세포는 전문 포식 세포입니다. 식 세포에의 한 사 멸 세포의 급속 한 클리어런스는 세포내 항 원에 대 한 염증 및 자가 면역 반응의 억제에 중요 합니다. Mer 수용 체 티로신 키나 아 제는 대 식 세포 침 적 및 효율적인 사 멸 셀 (14)의 클리어런스에 중요 하다. 마우스 비장에서 Mer는 주로 한계 구역과 유형 신체 대 식 세포13에 대해 표현 합니다.

여기에 제시 된 프로토콜은 세포 사 멸을 유도 하 고 efferocytosis의 과정과 효율성을 측정 하는 방법을 입증 하는 기본적인 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 기원의 사 멸 세포의 침 몰에서 다른 세포 유형에 의해 efferocytosis를 연구 하기 위하여 쉽게 적응 될 수 있습니다.

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Protocol

실험 마우스는 우리의 마우스 콜로 니에서 사육 되 고 유지 되었다. 모든 동물 작업은 신시내티 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행 되었다.

1. CFSE 표지 된 사 멸 계 세포의 준비

  1. 두 명의 순진한 C57/B6 마우스를 CO2 흡입 하 여 흉 강을 열고 해 부에 2 개의 생쥐를 안락사 시키고, 10 ML의 RPMI1640 배지를 함유 하는 조직 배양 페 트리 디쉬에 곡선형 파인 팁 집게를 사용 하 여 흉 선을 제거 한다.
  2. 현미경 슬라이드의 두 프 로스트 엔드에 대해 전체 흉 선을 연 삭 하 여 단일 세포 현 탁 액을 얻은 다음 100 μ m 세포 스 트레이너를 통해 현 탁 액을 필터링 합니다.
  3. 10 mL의 흉 선 현 탁 액을 50 mL 튜브에 넣고, 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 합니다.
  4. 상층 액을 제거 하 고, 1pb1의 40 mL의 소생을 하 고, 혈 세포 측정기로 세포 수를 셉니다.
  5. 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 제거 한다.
  6. 50 mL 튜브의 단일 세포 현 탁 액으로 서 20ml(12 x 8 세포 이상)의 1 세포 서 스 펜 션으로 20 ML의 pbs에서 소생 하 여 다른 50 ml 튜브에서 1xpbs의 다른 20ml의 다른 세포를 소생 시켰다.
  7. 5 μ m의 cfse를 별도의 50 ml 튜브에 1pbs의 동일한 부피 (20ml)로 만들고 cfse 스톡 솔루션 (2.5 mM)의 40 μ l을 1x pbs로 파이 펫 팅 하 고 2-3 튜브를 반전 하 여 잘 섞어 줍니다.
  8. 1.7 단계에서 CFSE 20 mL를 1.6 단계에서 20 mL의 세포 현 탁 액으로 추가 합니다 (CFSE의 최종 농도는 지금 2.5 μ m).
    참고: 20Ml 셀 서 스 펜 션 마다 20 mL의 CFSE 튜브가 필요 합니다.
  9. 세포 및 CFSE 혼합물 튜브를 2-3 번 반전 하 고 실 온에서 최대 2 분 동안 암실에서 혼합물을 배양 한 후, 열 불 활성화 말 세럼 10ml를 첨가 하 여 반응을 중지 한다.
  10. 50 mL 튜브 혼합물을 실 온에서 5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기.
    참고: CFSE 라벨링이 성공적 이면 셀 펠 릿은 컬러로 연한 노란색이 됩니다.
  11. 상층 액을 제거 하 고 세포 펠 릿을 1x PBS의 40 mL로 소생 하 고 혈 세포 측정기로 세포 수를 셉니다.
  12. 세포 현 탁 액을 300 x g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 상층 액을 버립니다.
  13. RPMI1640 배지 40 mL로 세포 펠 렛을 다시 씻으십시오.
  14. RPMI1640 조직 배양 배지에서 상 등 액 및 소생 세포를 제거 하 고, 100 mm 조직 배양 접시에 7x106 세포/m l의 농도로 10% FBS (열 불 활성화), 20mm 글루타민 및 1x 펜/ strep를 사용 한다.
    참고: 더 많은 세포를 얻을 경우, 별도의 100 mm 조직 배양 접시가 필요 합니다.
  15. 5% CO2와 함께 공급 되는 조직 배양 인큐베이터에서 37 ° c에서 4 시간 동안 최종 농도 1 μ m의 세포 현 탁 액 배양 물에 슈 타우 로스포 린을 첨가 한다.

2. 복 막 대 식 세포의 제조

  1. 두 개의 C57B6 마우스 (또는 실험실에서 유전자 조작 된 마우스)를 주사 하 여 0 일째에 3% 숙성 된 티 오 글 리 한을 1 mL로 복 강 내.
  2. 단계 1.1에서와 같이 5 일째에 마우스를 안락사 시키고, 복 부 피부를 절단 하 고 껍질을 벗 겨 내 고 그대로 복 막 상태로 남겨 둡니다. 18G 바늘이 부착 된 10ml 주사기를 사용 하 여 10 mL의 세척 완충 액 (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA)을 복 강 내로 빠르게 밀어 복 강 세척.
  3. 동일한 바늘/주사기로 세척 버퍼를 천천히 검색 하 고 세척 완충 액을 50 mL 튜브에 모읍니다 (자세한 내용은 Janssen 연구소 제15조참조).
  4. 복 막가 위를 1x PBS로 2 회 세척 하 고 24 웰 플레이트의 각 웰에 RPMI1640 세포/m l 및 분 취 액 500 μ l의 밀도로 하 여 조직 배양 배지에서 복 막 대 식 세포를 소생 시켰다. 2 시간 동안 티슈 배양 인큐베이터에 플레이트를 남겨 두십시오.
  5. 신선한 배양 배지를 2 ~ 500 μ l로 흡입 및 교체 하 여 부유 세포를 제거 하십시오.
  6. 선택적으로, 탐 수용 체 티로신 억제제, RXDX-106을 추가 하 고,도 전설에 나타난 농도에서 대 식 세포 배양의 각각의 웰에 넣고 또 다른 2 h를 배양 한다.

3. 사 멸 티 세포가 있는 복 막 대 식 세포의 공동 배양

  1. 1 단계에서 사 멸 티 모 세포를 수집 하 고 RPMI1640 배지로 세 번 씻으십시오. 사 멸 유도의 효율은 아 넥 타 V/7-AAD 키트와 함께이 단계에서 측정할 수 있습니다.
  2. 실험 배열 (예: 1참조)에 따라 #2 프로토콜 로부터 대 식 세포 배양 액의 각각의 웰에 0-12 x6 세포 (500 μ l 배지)를 분배 한다. 이는 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 전체 배양 체적을 만든다. 사 멸 티 모 세포를 첨가 하기 직전에 상기 배양 액에 블로킹 항 체를 첨가 한다.
  3. 세포 혼합물을 4 시간 동안 37 ° c에서 5% CO2와 함께 공급 된 조직 배양 인큐베이터에서 배양 한다.
  4. 배양 액의 각 웰을 1x PBS (500 μ m EDTA를 함유)로 2 회 세척 하 여 자유 부유 사 멸 세포를 제거 한다.
  5. 이 단계에서 CD11b으로 플레이트 바인딩된 대 식 세포를 얼룩.
    1. 염색 완충 액으로 플레이트에 바인딩된 대 식 세포를 한 번 세척 하십시오 (PBS 1% BSA).
    2. 각 웰에 CD11b 2 μ l를 함유 하는 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 한다.
    3. 플레이트를 4°c에서 20 분 동안 배양 하였다.
    4. 염색 완충 제를 사용 하 여 각 접시를 세 번 세척 합니다.
    5. 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 하 고, 형광 현미경 하에서 이미지 분석용 판을 진행 한다.
  6. 대안적으로, PBS에 1% lidocaine를 첨가 하 고 37 ° c에서 10 분 동안 배양 하 여 플레이트 결합 대 식 세포를 분리 한다.
  7. 반복 파이 펫 팅으로 플레이트 바운드 대 식 세포를 분리 합니다.
  8. 대 식 세포 현 탁 액을 24 웰 플레이트의 각 웰에서 개별 5ml 둥근 바닥 FACS 튜브에 넣어 이동 합니다.
  9. 5 분 동안 300 x g 에서 원심 분리기.
  10. 상층 액을 제거 하 고 CD11b (1:200 염색 완충 액에서의 희석)의 2 μ l를 함유 하는 염색 완충 액의 200 μ l를 첨가 한다.
  11. 세포 현 탁 액을 4°c에서 20 분 동안 염색 버퍼로 배양 한다.
  12. 염색 버퍼로 세포 현 탁 액을 두 번 씻으십시오.
  13. 염색 버퍼의 200 μ l를 추가 하 고 유 세포 측정기로 FACS 분석을 진행 하 고 CFSE 양성 대 식 세포의 백분율을 분석 합니다.

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Representative Results

복 막 대 식 세포의 분석-사 멸 티 세포의 매개 침 몰. 복 막 대 식 세포 및 사 멸는 상기 프로토콜에 기재 된 바와 같이 제조 하 고 공동 배양 하였다. 대 식 세포는 분리 되 고 얼음에 20 분 동안 PE 공액 항 CD11b 항 체로 염색 되었다. 대 식 세포는 이어서 유 세포 계에서 세척 및 처리 되었다. 본 바와 같이, 사 멸 세포가 배양 물에 첨가 되지 않았을 때 우측 하단 사분면에는 CFSE 양성 대 식 세포가 없다 (도 1A도 2, 1 패널). 티 오 글 리코-자극 복 막 대 식 세포는 사 멸 세포를 삼 켜 가변 용량을 갖는다. 대 식 세포의 30%까지 CFSE 채널에서 긍정적인 것을 보여주었습니다,이 실험에서 CFSE-레이블이 붙은 사 멸 세포를 섭취 했음을 나타냅니다 (그림 1). CFSE 양성 대 식 세포는 다른 강도로 인해 오른쪽 아래 사분면에 퍼져 있다는 것을 주목할 가치가 있으며, 대 식 세포 내 사 멸 세포의 수가 다르다는 것을 나타냅니다. 따라서 사 멸 세포를 섭취 하는 대 식 세포의 용량을 조사 하는 것이 필수적입니다 (도 2) 셀 사 멸에 대 한 세포의 침 지의 현미경 관찰. 대 식 세포에 대 한 사 멸 셀의 비율이 높을수록 사 멸 세포를 섭취 하는 식 세포의 수를 증가 시킬 뿐만 아니라 더 많은 사 멸 세포를 섭취 하는 대 식 세포의 능력을 향상 시킨다 (도 2).

Mer 막힘에의 한 efferocytosis의 용량 의존적 저해.
다른 실험 세트에서, 우리는 대 식 세포의 약 15%가 CFSE-라벨링 된 사 멸 티 모 세포 (6:1의 배급)가 4 h를 대 식 세포 배양 물에 첨가 되었을 때 양성 인 것을 발견 하였다 (도 3 B). 대 식 세포에 Mer의 1 개의 기능은 다리 분자, Gas6를 통해 서 사 멸 세포의 포식 작용을 인식 하 고 중재 하는 것입니다. Mer 억제에 의해 기인 하는 efferocytosis의 백분율을 시험 하기 위하여는, 우리는 Mer 매개 된 efferocytosis를 막기 위하여 반대로 Mer 항 체를 문화에 추가 했습니다. 메 르 항 체 블록 대 식 세포는 용량 의존적 방식으로 efferocytosis (3c, 도 3D) 및 전체 막힘은 현재 설정에서 efferocytosis 효율의 약 30%를 차지 한다 (도 3) ,이 데이터는 또한 Mer 녹아웃 대 식 세포13으로 우리의 이전 연구에서 확인 되었다. 우리는 다른 친화와 모든 탐 수용 체를 억제 하는 새로 FDA 승인 탐 수용 체 억제제 인 RXDX-106 억제의 효율성을 테스트 (Axl > > Tyro3 > Mer). RXDX-106은 사 멸 티 모 세포와 공동 인큐베이션 하기 전에 2 시간 전에 대 식 세포 배양 액을 첨가 하였다. 도 4에 도시 된 바와 같이, rxdx-106은 투여 량 의존적 방식으로 efferocytosis 대 식 세포를 저해 하였다. 상기 포화 저해 농도는 약 100 nM (도4, 실선), 메 르 결핍 (도4 의 점선) 또는 메 르 항 체 (도 3, 패널 D) 보다 더 효과적인 것으로 보이는 농도가 단독 이다. 대 식 세포가 표면16에 있는 3 개의 탐 수용 체를 모두 표현 하기 때문에, rxdx-106 (100 nM 이상)의 높은 농도가 3 개의 수용 체를 모두 차단할 것 이라는 것을 볼 것으로 예상 되 고, 그러므로 efferocytosis 보다는 차단에 더 효과적일 것입니다 단일 탐 수용 체를 표적화 하는, Mer.

Figure 1
그림 1 . 복 막 대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포의 포식의 백분율. 사 멸 티 모 세포를 4 시간 동안 슈 타우로 스 테 린 1 mM로 배양 하 고,도 패널에 나타난 바와 같은 비율로 대 식 세포 배양 액을 첨가 하 여 유도 하였다: (a) 1:0; (B) 1:1; (C) 1:2; (D) 1:4; (E) 1:6; (F) 1:8; (G) 1:10; (H) 1:12. 데이터는 유 세포 측정기로 획득 되었다. 포식 성 대 식 세포의 비율은 유 세포 계와 관련 된 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . Efferocytosis의 현미경 분석. Efferocytosis를 도 1과 같이 제조 하였다. 포식 성 대 식 세포는 CD11b로 플레이트 상에 서 원위치에서 염색 되었고, 파라 포름알데히드로 고정 되 고, 평가 되었다. 이미지는 형광 현미경을 사용 하 여 획득 하 고 현미경과 관련 된 소프트웨어로 분석 하였다. 대표 삽입은 디지털 방식으로 확대 되어 각 이미지 아래에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 항-Mer 항 체에의 한 복 막 대 식 세포의 efferocytosis 억제. 사 멸 세포를 상기 프로토콜에 기재 된 바와 같이 4 시간 동안 대 식 세포와 함께 공동 배양 하였다. 항-Mer Ab는 사 멸 세포와의 공동 배양 직전에 대 식 세포 배양 액에 첨가 되었다. 포식 성 대 식 세포를 분리 하 고 얼음에 마우스 CD11b 항 체를 사용 하 여 20 분간 염색 한 후, 도 1에서와 같이 데이터를 획득 하 고 분석 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . RXDX-106 대 식 세포 efferocytosis의 중재 억제. Efferocytosis는 도 3에서 설명한 바와 같이 설정 되었다. RXDX-106는 사 멸 티 모 세포와 공동 배양 하기 전에 2 시간을 첨가 하였다. Mer 결핍 복 막 대 식 세포는 유사 하 게 제조 되 고 대조 군으로 서 서빙 되었다. 데이터를 획득 하 고 포식 성 대 식 세포의 비율은 CD11b 양성 세포에서 제어 되 고 유 세포 측정기 소프트웨어를 사용 하 여 분석 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

세포 사 멸은 많은 신호 캐스케이드를 수반 하 고 단백질 발현, 분 비 및 수송을 유도 하는 고도로 보존 된 세포 사 멸 과정 이다. 아 폽 토시 스는 종종 세포 형태학 변화 (17)와 연관 된다. 사 멸 세포는 사이트에 이주 하 고 엄격한 통제18에서 매우 복잡 한 통로의 과정을 시작 하는 포식을 유치 하는 사이토카인 및 케 모카 인를 활발히 풀어 놓습니다. 한편, 괴 사 세포 사 멸은 염증 반응1을 유발 하는 위험 신호를 방출 한다. 사 멸 세포의 결함 또는 머리말을 붙인 클리어런스는이 세포의 이차 괴 사로 이끌어 냅니다19. 따라서, 세포 사 멸 유도의 타이밍은 실험에서 매우 중요 하다. 세포 아 폽 토시 스 (20)를 유도 하는 수많은 방법이 있다. 그러나 유도의 지속 기간과 강도는 셀 타입에 따라 다릅니다. 최대의 최적 조건을 결정 하기 위해 적정 실험을 설정 하는 것이 좋습니다 (90-95%). 세포 사 멸 생산. 아 넥 인 V/7-AAD 사 멸 검출 키트가 사용 되었으며, 사 멸 효율을 평가 하기 위해 실험실에서 지침을 따랐습니다. 우리 연구실은 과거에는 티 세포 세포 사 멸을 유발 하는 두 가지 다른 방법을 시도 했습니다. 감마-방사선은 더 나은 방법, 그것은 문화에 있는 화학 잔차가 없고 괴 사 세포 죽음을 유도 하는 것 처럼 보입니다. 우리는 500에 티 모 세포를 노출 시켜 g-방사선을 RPMI1640 배지에 4-h 배양을 하였다. 우리는 약 95% 사 멸 티 모 세포13을 관찰 했습니다. 라디에이터를 사용할 수 없을 때, 우리는 4 h (단계 1.15)에 대 한 배양에서 1 μ m의 슈 타우 롤로 아 폽 토시 스를 겪는 티 모 세포를 유도 하였다. 일차 세포는 일반적으로 세포 사 멸 유도에 더 민감 하다. 광범위 한 세척 단계는 식 세포와 공동 배양 하기 전에 문화에서 화학 물질을 제거 하는 데에도 필요 합니다. 사 멸 셀에 레이블을 지정 하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 독성은 고 농도와 연관 되어 있지만, CFSE는 신중 하 게 최적화21때 세포질 내에서 매우 효율적으로 유지 됩니다. pHrodo는 산에 민감한 염료로, 환경 pH가 감소 함에 따라 형광이 증가 합니다. 식 각의 낮은 pH로 인해, 식 균 화 된 사 멸 세포는 물리적으로 부착 된 것과는 쉽게 구별 될 수 있지만 분석 법22에서 사 멸 세포를 침 몰 하지는 않습니다.

수많은 표면 수용 체 (탐 수용 체,만 노스 수용 체, 인 테 그린 (CD11b/CD18), 포착 수용 체, Fc 수용 체, 외 용 제 등은 식 세포가 병원 균 으로부터 자기를 구별 하 고 후속 응답을 감 별 할 수 있다 (23). 다른 수용 체는 다소 복잡 한 과정을 완료 하기 위해 함께 작동. 차단 수용 체 (들)는 식 균 작용의 부분적인 억제를 초래 합니다. 1 차적인 대 식 세포는 다양 한 방법 (골 수 유래 대 식 세포, 복 막 대 식 세포, 비장 대 식 세포, 외)와 다른 자원 으로부터 제조 될 수 있다. 티 오 글로-유도 된 대 식 세포의 이점은 대 식 세포의 기울어진 포식 표현 형; 단점은 3 개월 이상 어두운 곳에서 숙성 시켜야 한다는 것입니다. 그러나, 티 오이 한 대조 용액은 2 년의 유효 기간을 갖는다. 용액의 일정 한 주식은이 단점을 극복 한다. 복 막 대 식 세포의 제조에 있어서, 복 막 대 대 세포 수집에서 적혈구의 미 량은 실험에 영향을 주지 않아야 하며, 이후 그들은 2 시간 후에 떠 있는 세포와 함께 용 대 세포 배양을 함께 씻어 낼 것 이다. 다량의 적혈구 (가시 펠 릿)는 ACK 일차 완충 액으로 치료가 필요할 수 있습니다. 대 식 세포는 배양 표면에 단단히 부착 하는 경향이 있다. 문헌에서 상이한 방법 들은 표면 (24) 로부터 유착 세포를 분리 하는 것으로 인용 되었다. 효소 기반 분리는 세포 회복의 최고 수준을 제공 하지만 표면 수용 체를 손상 시킬 수 있습니다., 세포 기능 및 관련 된 분석을 방해. 표면 수용 체의 변형은 또한 수용 체-기반 유동 세포 분석기 분석에 영향을 미칠 수 있다. Lidocaine는 칼슘 이온 채널 (25)의 봉쇄로 인해 세포 형태학이 보다 구형으로 변화 하는 원인이 된다. 그것은 우리의 실험에서 눈에 띄는 손상이 없는 표면에서 대 식 세포를 분리 하는 가장 좋은 방법입니다.

사 멸를 포함 하는 대 식 세포는 유 세포 분석 계 또는 현미경 기반 분석 법에 의해 분석 될 수 있다. FACS는 짧은 시간에 다 수의 세포를 분석 하기 위해 적용 될 수 있으며 특정 표면 또는 세포질 단백질에 대 한 항 체와의 차동 염색에 의해 세포 아 류 형을 더욱 식별할 수 있다. 공동 배양 시스템에서 사 멸 세포 수의 최적 농도 (비)는 FACS 분석에 의해 결정 될 수도 있다. 현미경 분석에는 FACS 분석과 비교 하 여 세포 수 및 차동 염색에 관한 제한이 있습니다. 그러나 형광 현미경은 심도 있는 정보를 제공 합니다. 사 멸 세포를 섭취 하는 대 식 세포의 용량과 동역학을 조사 하는 것은 사 멸 cell을 침 몰의 현미경 적 분석은 필수적입니다. 전체 섭취 진행 시간의 경과는 하나의 사 멸 세포를 삼 켜 하는 데 걸리는 시간에 대 한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다, 얼마나 많은 사 멸 세포는 단일 대 식 세포가 동시에 섭취 할 수 있습니다. 포식 성 대 식 세포는 또한 침 몰 과정에 의해 조절 된 신호 분자를 조사 하기 위해 웨스턴 블랏에 의해 분석 될 수 있다. 이 과정과 관련 된 유전자 발현 프로필은 실시간 PCR로 평가할 수 있다.

마지막으로,이 프로토콜은 efferocytosis의 실험 분석에서 기본 플랫폼을 제공 한다. 다른 세포 유형 (수지상 세포, 메 종 세포, 상피 세포) 또한 그들의 주거 사이트에 있는 통풍 관 사 멸 세포에 작동할 수 있습니다. 그 세포는 인식 하 고 사 멸 세포 클리어런스2의 과정을 시작 하는 다른 수용 체를 이용 하 여 환경 설정이 있습니다. 전체 포식 효율은 실험적 및 세포 유형별 특정 요인을 포함 한 여러 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 문헌에 보고 된 가변 결과는 1) 공동 배양 기간으로 인 한 것일 수 있다. 2) 식 구와 사 멸 세포의 자원 및 준비; 3) 식에서 사 멸 세포를 해리 하는 방법. 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 세포의 포식 잠재력에 적용 될 수 있습니다. 목표 세포의 포식 잠재력을 극대화 하기 위해 최적화가 필요할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜에서 기술 한 바와 같은 방법으로 발생 하는 사 멸 티 세포의 신장 메앙모 균 작용을 분석 하였다. 호 중구 병원 균의 제거를 통해 타고 난 면역 체계에서 중요 한 역할을 합니다. 표지 된 세균 또는 입자의 호 중구 포식 작용은 유 세포 분석기 (26)에 의해 분석 될 수 있다. 그러나, 호 중구은 매우 짧은 반감기 (6-8 h) 및 세균 또는 곰 팡이의 호 중구 포식 작용은 수 초 내에27,28까지 발생 한다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

Shao 연구소에서 연구는 의학의 대학에서 연구 혁신 상을 지원 하 고 내과, 신시내티 대학과 NIDDK/NIH에서 DK K01_095067에서 주니어 학부 조종사 상을 수상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

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References

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대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석
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Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

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