Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Eksperimentell analyse av apoptotisk Thymocyte Oppslukningsprosess av makrofager

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å forberede apoptotisk thymocytes og bukhulen makrofager og analysere effektiviteten av efferocytosis og den spesifikke hemmer-mediert blokkering av apoptotisk thymocytes oppslukningsprosess. Denne protokollen har en bred anvendelse i celle-mediert klaring av andre partikler, inkludert kunstige perler og bakterier.

Abstract

Cell apoptose er en naturlig prosess og spiller en avgjørende rolle i embryoutvikling, homøostatisk regulering, uimottakelig toleranse induksjon, og oppløsning av betennelse. Opphopning av apoptotisk rusk i kroppen kan utløse kroniske inflammatoriske reaksjoner som fører til systemiske autoimmune sykdommer over tid. Nedsatt apoptotisk celle klaring har vært innblandet i en rekke autoimmune sykdommer. Apoptotisk clearance er en kompleks prosess som sjelden oppdages under fysiologiske forhold. Det innebærer rikelig overflate reseptorer og signalering molekyler. Å studere prosessen med apoptotisk celle klaring gir innsiktsfulle molekylære mekanismer og påfølgende biologiske reaksjoner, noe som kan føre til utvikling av nye legemidler. Her beskriver vi protokoller for induksjon av apoptotisk thymocytes, utarbeidelse av bukhulen makrofager, og analyse av apoptotisk celle klaring ved flyt flowcytometri og mikroskopi. Alle celler vil gjennomgå apoptose på et visst Stadium, og mange boliger og sirkulerende celler kan opptaket apoptotisk rusk. Derfor protokollen som er beskrevet her kan brukes i mange programmer for å karakterisere apoptotisk celle binding og inntak av mange andre celletyper.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kroppen vår genererer 1-10 milliarder apoptotisk celler på daglig basis. Et slikt stort antall apoptotisk celler må tømmes på en måte som immunresponser forblir Quiescent. For å sikre clearance av apoptotisk celler på en riktig måte, mange typer vev bosatt celler og sirkulerende celler utvikle mekanismer for å sluker apoptotisk celler1. Dysfunksjonelle regulering av apoptose har vært innblandet i utbruddet og progresjon av ulike inflammatorisk sykdom og autoimmunitet2. Apoptose spiller også en avgjørende rolle i patogenesen av kreftutvikling og dens påfølgende motstand mot konvensjonelle behandlinger3,4. Fjerning av apoptotisk celler generelt fremmer en anti-inflammatorisk respons, som kan være knyttet til immunologiske toleranse5. Forstyrrelse av apoptotisk celle klaring kjører selv-immunisering og bidrar til utvikling av systemiske autoimmune sykdommer hos både mennesker og mus6.

Når cellene gjennomgår apoptose, utsetter de fosfatidylserin (PtdSer) fra det indre pakningsvedlegget til den ytre pakningsvedlegget til membranen. PtdSer vil da bli gjenkjent av phagocytes gjennom overflate reseptorer. Over et dusin reseptorer har blitt identifisert å anerkjenne og/eller tilrettelegge for oppslukningsprosess av apoptotisk celler. Generelt er det minst tre typer overflate reseptorer som er involvert i apoptotisk celle klaring: tethering reseptorer, gjenkjenne apoptotisk celler; kile reseptorer, initiere oppslukningsprosess; passe reseptorer, lette hele prosessen7. TAM reseptor tyrosin kinaser (TAM RTKs) består av Tyro-3, enXL, og Mer og er primært uttrykt ved myelogen celler i immunsystemet8. Den primære funksjon TAM RTKs er å tjene som tethering reseptorer, tilrettelegging for phagocytic fjerning av apoptotisk celler og rusk. Vår gruppe har studert TAM mediert apoptotisk celle klaring i innstillingen av autoimmunitet i mange år. Vitamin K-avhengige protein vekst arrest bestemt protein 6 (Gas6) og protein S (proffene) binder seg til og aktiverer TAM reseptorer9,10. Gas6 produseres i hjerte, nyrer og lunger. ProS er hovedsakelig produsert i leveren11. TAM anerkjenner av apoptotisk celler på en slik måte at N-terminalen av Gas6/ProS binder seg til PtdSer på en apoptotisk celle og C-terminal av Gas6/ProS binder seg til TAM-reseptorer som forankret på overflaten av phagocytes. Sammen med de andre reseptorene, oppslukningsprosess av apoptotisk celler forekommer12. Selv om mer kan binde til både ligander ProS og Gas6, fant vi ut at Gas6 synes å være den eneste ligand for mer-mediert macrophage fagocytose av apoptotisk celler, som kan blokkeres av anti-mer antistoff13. Makrofager er profesjonelle phagocytes. Rask clearance av apoptotisk celler av makrofager er viktig for hemming av betennelse og autoimmune responser mot intracellulære antigener. Mer reseptor tyrosin kinase er avgjørende for macrophage oppslukningsprosess og effektiv clearance av apoptotisk celler14. I mus milt, mer hovedsakelig uttrykker på marginale sonen og konkrete kroppen makrofager13.

Protokollen som presenteres her beskriver en grunnleggende metode for å indusere celle apoptose og demonstrere måter å måleprosessen og effektiviteten av efferocytosis. Disse protokollene kan lett tilpasses til å studere efferocytosis av andre celletyper i oppslukningsprosess av apoptotisk celler av ulik opprinnelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksperimentelle mus ble avlet og vedlikeholdt i vår mus koloni. Alle dyr arbeide var gjennomført alt etter veiledningene av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) av universitetet av Cincinnati.

1. utarbeidelse av CFSE merket apoptotisk thymocytes

  1. Euthanize to naive C57/B6 mus av CO2 inhalasjon i 10 min og analysere for å åpne brystet hulrom, fjerne (trekke ut) thymus med buede fine-tip tang i vev kultur Petri parabolen inneholder 10 ml RPMI1640 medium.
  2. Få enkelt celle suspensjon ved sliping hele thymus mot to frostet endene av mikroskopet lysbildene og deretter filtrere suspensjonen gjennom 100 μm celle sil.
  3. Samle 10 mL thymus suspensjonen i en 50 mL rør og sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
  4. Fjern supernatanten, resuspend i 40 mL 1x PBS, og telle celle tall med en hemocytometer.
  5. Sentrifuger på 300 x g i 5 min og fjern supernatanten.
  6. Resuspend i 20 mL 1x PBS i et 50 mL rør som en enkelt celle suspensjon med opptil 2 x 108 celler (Hvis mer enn 2 x 108 celler, Resuspend resten av cellene i en annen 20 ml av 1 x PBS i et annet 50 ml rør).
  7. Lag 5 μM av CFSE i lik volum (20 mL) av 1x PBS i et separat 50 mL rør ved pipettering 40 μL av CFSE lagerløsning (2,5 mM) i 20 mL 1x PBS og bland godt ved å invertere røret 2-3 ganger.
  8. Tilsett 20 mL CFSE fra trinn 1,7 inn i 20 mL celle suspensjon fra trinn 1,6 (den endelige konsentrasjonen av CFSE er nå 2,5 μM).
    Merk: for hver 20 mL celle fjæring er det nødvendig med en 20 mL CFSE tube.
  9. Inverter celle og CFSE blanding rør 2-3 ganger og ruge blandingen i mørket ved romtemperatur i maksimalt 2 min, og deretter stoppe reaksjonen ved å legge 10 mL av varme-deaktivert hest serum.
  10. Sentrifuger 50 mL rør blandingen ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur.
    Merk: Hvis CFSE-merkingen er vellykket, blir celle pellet lys gul i farge.
  11. Fjern supernatanten og resuspend celle pellet i 40 mL 1x PBS og telle celle tall med en hemocytometer.
  12. Sentrifuger celle fjæringen på 300 x g i 5 min og kast supernatanten.
  13. Vask celle pellet igjen med 40 mL RPMI1640 medium.
  14. Fjern supernatanten og resuspend celler med RPMI1640 vev kultur medium (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (varme deaktivert), 20 mM glutamin og 1x penn/strep) ved en konsentrasjon på 7 x 106 celler/ml i en 100 mm vevs kultur rett.
    Merk: Hvis flere celler er innhentet, en egen 100 mm vev kultur parabolen vil være nødvendig.
  15. Legg staurosporine inn i cellen suspensjon kulturen ved en endelig konsentrasjon av 1 μM og kultur for 4 h ved 37 ° c i en vev kultur inkubator leveres med 5% CO2.

2. utarbeidelse av bukhulen makrofager

  1. Injiser to C57B6-mus (eller eventuelle gen-manipulert mus i laboratoriet) intraperitonealt med 1 mL 3% i alderen thioglycollate på dag 0.
  2. Euthanize musene på dag 5 som i trinn 1,1, kutt og skallet åpne mage huden, men la peritoneum intakt. Skyll bukhulen ved raskt å skyve 10 mL vaskebuffer (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) i bukhulen ved hjelp av en 10 mL sprøyte festet med en 18 G nål.
  3. Hent vaske bufferen langsomt med den samme nålen/sprøyten, og samle vaske bufferen i et 50 mL rør (detaljer referer til artikkel15i Janssen-laben).
  4. Vask bukhulen gavage to ganger med 1x PBS, resuspend de bukhulen makrofager i RPMI1640 vev kultur medium ved en tetthet på 2 x 106 celler/ml og Alikvot 500 μL i hver brønn av 24-brønn plate. La platen i en vev kultur inkubator for 2 t.
  5. Fjern de flytende cellene ved å aspirating og erstatte med 500 μL av friskt kultur medium, to ganger.
  6. Alternativt, Legg TAM reseptor tyrosin inhibitor, RXDX-106, ved konsentrasjoner angitt i figuren legender i hver brønn av macrophage kultur og ruge for ytterligere 2 h.

3. co-kultur av bukhulen makrofager med apoptotisk thymocytes

  1. Samle apoptotisk thymocytes fra trinn 1 og vask tre ganger med RPMI1640 medium. Effektiviteten av apoptotisk induksjon kan måles på dette stadiet med Annexin V/7-AAD Kit.
  2. Fordel 0-12 x 106 celler (i 500 μL medium) i hver brønn av macrophage kulturer fra protokoll #2, i henhold til eksperimentell ordning (f. eks, se figur 1). Dette gjør hele kulturen volumet av 1 mL i hver brønn av 24-brønn plate. Tilsett blokkerer antistoff i kulturen umiddelbart før tilsetning av apoptotisk thymocytes.
  3. Kultur cellen blandingen ved 37 ° c for 4 h i en vev kultur inkubator leveres med 5% CO2.
  4. Vask hver brønn av kulturen med 1x PBS (inneholder 500 μM EDTA) to ganger for å fjerne fritt flytende apoptotisk celler.
  5. Stain den plate-bundet makrofager med CD11b-PE på dette stadiet.
    1. Vask plate bundne makrofager med farge buffer (1x PBS, 1% BSA) én gang.
    2. Tilsett 200 μL av farge buffer som inneholder 2 μL CD11b-PE i hver brønn.
    3. Ruge platen ved 4 ° c i 20 min.
    4. Vask hver brønn av plate tre ganger med farge buffer.
    5. Tilsett 200 μL av farge buffer og Fortsett platen for bildeanalyse under det fluorescerende mikroskopet.
  6. Du kan også løsne den plate bundne makrofager ved å legge til 1 mL 1% lidokain i PBS og incubating i 10 min ved 37 ° c.
  7. Løsne plate-bundet makrofager med gjenta pipettering.
  8. Overfør macrophage suspensjon til en individuell 5 mL rund bunn FACS tube fra hver brønn av 24-brønn plate.
  9. Sentrifuger på 300 x g i 5 min.
  10. Fjern supernatanten og tilsett 200 μL av farge buffer som inneholder 2 μL av CD11b-PE (1:200 fortynning i farge buffer).
  11. Ruge celle fjæringen i farge buffer ved 4 ° c i 20 minutter.
  12. Vask celle fjæringen to ganger med farge buffer.
  13. Tilsett 200 μL av farge buffer og fortsette for FACS analyse med en Flow flowcytometer og analysere for prosentandelen av CFSE positivitet makrofager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analyse av bukhulen macrophage-mediert oppslukningsprosess av apoptotisk thymocytes. Bukhulen makrofager og apoptotisk celler ble utarbeidet og co-kultivert som beskrevet i protokollen. Makrofager ble løsrevet og farget med PE bøyd anti-CD11b antistoff for 20 min på isen. Makrofager ble deretter vasket og behandlet i en Flow flowcytometer. Som sett er det ingen CFSE positive macrophage i nedre høyre kvadrant når ingen apoptotisk celler ble lagt inn i kulturen (figur 1A og figur 2, First panel). Thioglycollate-stimulert bukhulen makrofager har variabel kapasitet til å sluker apoptotisk celler. Opptil 30% av makrofager viste positiv i CFSE-kanalen, noe som indikerer at de har inntatt CFSE-merkede apoptotisk celler i dette eksperimentet (figur 1). Det er verdt å merke seg at CFSE positive makrofager spredt ut i nedre høyre kvadrant på grunn av ulike intensitet, noe som indikerer at antall apoptotisk celler i makrofager er forskjellig. Derfor er mikroskopisk observasjon av macrophage oppslukningsprosess av apoptotisk celler avgjørende for å undersøke kapasiteten til makrofager for å innta apoptotisk celler (figur 2). Jo høyere ratio av apoptotisk celler til makrofager ikke bare øker antall makrofager inntak apoptotisk celler, men også forbedrer evnen til makrofager å innta mer apoptotisk celler (figur 2).

Dose avhengig hemming av efferocytosis av mer blokkering.
I et annet sett med eksperimenter, fant vi at om lag 15% av makrofager ble CFSE positive når CFSE-merket apoptotisk thymocytes (rasjon av 6:1) ble lagt inn i macrophage kulturen for 4 h, indikerer de er phagocytic makrofager (Figur 3 B). en funksjon av mer på makrofager er å anerkjenne og megle fagocytose av apoptotisk celler gjennom bygge bro molekylet, Gas6. For å teste prosentandelen av efferocytosis tilskrevet mer hemming, la vi anti-mer antistoffer inn i kulturen for å blokkere mer-mediert efferocytosis. Mer antistoff blokker macrophage efferocytosis i en dose avhengig måte (Figur 3C, Figur 3D) og den generelle blokkeringen kan gjøre rede for om lag 30% av efferocytosis effektivitet i den gjeldende innstillingen (Figur 3) Ble disse dataene også bekreftet i vår tidligere studie med mer knockout makrofager13. Vi deretter testet effektiviteten av hemming med den nylig FDA godkjente TAM reseptor inhibitor, RXDX-106, som hemmer alle TAM reseptorer med ulike slektskap (Axl > > Tyro3 > mer). RXDX-106 ble lagt inn i macrophage kulturen 2 timer før co-inkubasjons med apoptotisk thymocytes. Som vist i Figur 4, RXDX-106 hemmet macrophage efferocytosis i en dose avhengig måte. Den mettede hemming konsentrasjonen var om 100 nM (Figur 4, solid linje), en konsentrasjon som synes å være mer effektiv enn mer-mangel (Figur 4 stiplede linjen) eller mer antistoff (Figur 3, panel D) alene. Siden macrophage uttrykker alle tre TAM reseptorer på overflaten16, er det forventet å se at høyere KONSENTRASJONER av RXDX-106 (over 100 nM) vil blokkere alle tre reseptorer, og derfor vil være mer effektive i å blokkere efferocytosis enn målrettet mot en enkelt TAM-reseptor, mer.

Figure 1
Figur 1 . Prosentandel av fagocytose av apoptotisk thymocytes av bukhulen makrofager. Apoptotisk thymocytes ble indusert av incubating med 1 mm staurosporine for 4 h og tilsatt i macrophage kulturen i forholdet som indikert i figur panelene: (a) 1:0; (B) 1:1; (C) 1:2; (D) 1:4; (E) 1:6; (F) 1:8; (G) 1:10; (H) 1:12. Data ble anskaffet med en strømnings flowcytometer. Prosentandel av phagocytic makrofager ble analysert ved hjelp av programvaren som er knyttet til flyt flowcytometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Mikroskopisk analyse av efferocytosis. Efferocytosis ble fremstilt som i figur 1. Phagocytic makrofager ble beiset in situ på tallerkenen med CD11b-PE, fast med paraformaldehyde, og evaluert. Bildene ble anskaffet ved hjelp av fluorescerende mikroskop og analyseres med programvaren som er knyttet til mikroskopet. Representative innsettinger ble digitalt forstørret og vist nedenfor i hvert bilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Hemming av bukhulen macrophage efferocytosis av et anti-mer antistoff. Apoptotisk celler ble utarbeidet og co-kultivert med makrofager for 4 h som beskrevet i protokollen. Anti-mer AB ble lagt inn i macrophage kulturen umiddelbart før co-kulturen med apoptotisk celler. Phagocytic makrofager ble deretter løsrevet og farget med anti-mus CD11b-PE antistoff på isen i 20 min. data ble anskaffet og analysert som i figur 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . RXDX-106 mediert hemming av macrophage efferocytosis. Efferocytosis ble satt opp som beskrevet i Figur 3. RXDX-106 ble lagt til to timer før co-kulturen med apoptotisk thymocytes. Mer-mangelfull bukhulen makrofager ble utarbeidet på samme måte og fungerte som kontrollgruppen. Data ble anskaffet og prosentandelen av phagocytic makrofager var gated på CD11b positive celler og analysert ved hjelp av flyten flowcytometer programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Apoptose er en svært bevart celle død prosess som involverer mange signal kaskader og induserer protein uttrykk, sekresjon og transport. Apoptose er ofte forbundet med cellulære morfologi endringer17. Apoptotisk celler aktivt løslate cytokiner og chemokiner som tiltrekker phagocytes å migrere til området og starte prosessen med oppslukningsprosess, en ekstremt kompleks vei under stram kontroll18. På den annen side, nekrotisk celle død utgivelser faresignaler som utløser inflammatoriske reaksjoner1. Defekt eller langvarig clearance av apoptotisk celler vil føre til sekundær nekrose av disse cellene19. Derfor er timing i apoptose induksjon svært kritisk i eksperimentet. Det er mange måter å indusere celle apoptose20. Imidlertid er varigheten og styrken av induksjon celle type avhengige. Vi anbefaler å sette opp et titrering eksperiment for å fastslå optimal tilstand av maksimal (90-95%) apoptose produksjon. Den Annexin-V/7-AAD apoptotisk Detection Kit ble brukt og instruksjonene ble fulgt i laboratoriet vårt for å evaluere apoptotisk effektivitet. Vårt laboratorium har forsøkt to forskjellige måter å indusere thymocytes apoptose i fortiden. Gamma-stråling synes å være en bedre metode, som det har ingen kjemiske rester i kulturen og induserer få nekrotisk celle dødsfall. Vi utsetter thymocytes til 500 rad av g-stråling etterfulgt av 4-h kultur i RPMI1640 medium. Vi observerte om 95% apoptotisk thymocytes13. Når en radiator ikke er tilgjengelig, vi indusert thymocytes å gjennomgå apoptose med 1 μM av staurosporine i kulturen for 4 h (trinn 1,15). Primær celler er generelt mer følsomme for apoptose induksjon. Omfattende vasketrinn er også nødvendig for å fjerne kjemikaliene fra kultur før co-kultur med phagocytes. Det er mange måter å merke apoptotisk celler på. Selv om toksisitet har vært forbundet med høy konsentrasjon, er CFSE svært effektivt beholdes i cytoplasma når nøye optimalisert21. pHrodo er en syre-følsom fargestoff, som øker i fluorescens som pH i miljøet avtar. På grunn av den lave pH i phagolysosome, phagocytized apoptotisk celler kan lett skilles fra fysisk festet, men ikke oppslukt apoptotisk celler i analysen22.

Tallrike overflate reseptorer (TAM-reseptorer, mannose reseptor, integrins (CD11b/CD18), renovasjons reseptorer, FC-reseptorer, et al) tillater phagocytes å skille seg selv fra patogener og diskriminere påfølgende svar23. Forskjellige reseptorer arbeider sammen for å fullføre en ganske komplisert prosess. Blokkering av reseptor (er) sannsynligvis resulterer i en delvis hemming av fagocytose. Primær makrofager kan tilberedes fra ulike ressurser med ulike metoder (benmarg avledet makrofager, bukhulen makrofager, milt makrofager, et al.). Fordelen med thioglycollate-indusert makrofager er skjev phagocytic fenotype av makrofager; Ulempen er at thioglycollate må være alderen i mørket i minst 3 måneder. Imidlertid har thioglycollate løsning en hylle livet på 2 år. En konstant lager av oppløsningen burde seire over denne ulempen. I utarbeidelsen av bukhulen for makrofager, bør spor mengden av røde blodlegemer i bukhulen macrophage samlingen ikke påvirke eksperimentet, siden de kommer til å bli vasket bort sammen med de flytende cellene etter 2 h av macrophage kultur. En stor mengde røde blodlegemer (synlig pellet) kan kreve behandling med ACK lysering buffer. Makrofager har en tendens til å holde seg tett til kulturen overflaten. Ulike metoder har blitt sitert i litteraturen for å løsne vedheft celler fra overflaten24. Enzymbasert avløsning gir de høyeste nivåene av celle utvinning, men kan skade overflate reseptorer, svekke celle funksjon og tilhørende analyser. Endring av overflate reseptorer kan også påvirke reseptor-basert flyt flowcytometri analyse. Lidokain forårsaker celle morfologi til å endre til en mer sfærisk konformasjon på grunn av blokaden av kalsium ion kanaler25. Det er den beste måten å løsne makrofager fra overflaten uten merkbar skade i eksperimentet vårt.

Makrofager som inneholder apoptotisk celler kan analyseres ved å strømme flowcytometri eller mikroskop BAS ert analyser. FACS kan brukes til å analysere et stort antall celler på kort tid og kan ytterligere identifisere celle under typer ved differensial farging med antistoffer mot den spesifikke overflaten eller cytoplasmatiske proteiner. En optimal konsentrasjon (ratio) av apoptotisk celle tall i co-kultur systemet kan også avgjøres av FACS analysen. Mikroskopisk analyse har begrensninger vedrørende celle tall og differensial farging i forhold til FACS analysen. Men fluorescerende mikroskopi gir dyptgående informasjon. Mikroskopisk analyse av macrophage oppslukningsprosess av apoptotisk celler er avgjørende for å undersøke kapasiteten og Kinetics av makrofager for å innta apoptotisk celler. En tidsforløp av hele inntak progresjon kan gi detaljert informasjon om hvor lang tid det tar å sluker en apoptotisk celle, og hvor mange apoptotisk celler kan en enkelt macrophage svelges samtidig. Phagocytic makrofager kan også analyseres av Western Blot for å undersøke signalmolekyler som reguleres av oppslukningsprosess prosessen. Gen uttrykks profiler knyttet til denne prosessen kan evalueres av PCR i sanntid.

Til slutt gir denne protokollen en grunnleggende plattform i den eksperimentelle analysen av efferocytosis. Andre celletyper (dendrittiske celler, Mesangial celler, epitelceller) kan også fungere til opptak apoptotisk celler på deres boligområder. Disse cellene har preferanser i å utnytte ulike reseptorer å anerkjenne og starte prosessen med apoptotisk celle klaring2. Den generelle phagocytic effektiviteten kan påvirkes av flere faktorer, inkludert eksperimentelle og celle type spesifikke faktorer. Variable resultater rapportert i litteraturen er trolig på grunn av 1) varighet av co-kultur; 2) ressurs og utarbeidelse av phagocytes og apoptotisk celler; 3) metoder for å distansere de apoptotisk cellene fra phagocytes. Protokollen som beskrives her, kan gjelde phagocytic potensialet i andre celler. Optimalisering kan kreves for å maksimere phagocytic potensialet i målcellene. Vi har analysert renal Mesangial celle fagocytose av apoptotisk thymocytes generert på samme måte som beskrevet i denne protokollen. Nøytrofile spiller en nøkkelrolle i det medfødte immunsystemet gjennom eliminering av patogener. Nøytrofile fagocytose av merket bakterier eller partikler kan analyseres ved strømning flowcytometri26. Men, nøytrofile har en svært kort halveringstid (6-8 h) og nøytrofile fagocytose av bakterier eller sopp oppstår i løpet av sekunder til minutter27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forskning i Shao Lab er støttet av forskning innovative Award fra College of Medicine og Junior fakultet pilot Award fra Institutt for indremedisin, Universitetet i Cincinnati og gi DK K01_095067 fra NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
Eksperimentell analyse av apoptotisk Thymocyte Oppslukningsprosess av makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter