Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Экспериментальный анализ Апоптотического тимоцита с помощью макрофагов

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

Здесь мы представляем протокол для подготовки апоптозных тимоцитов и перитонеальных макрофагов и анализировать эффективность эффофоцитоз и конкретных ингибитор-опосредованной блокировки апоптотического тимоцитов поглощает. Этот протокол имеет широкое применение в клеточной опосредованной зазор других частиц, включая искусственные бусы и бактерии.

Abstract

Апоптоз клеток является естественный процесс и играет решающую роль в эмбрионального развития, гомеостатическое регулирование, индукции иммунной толерантности, и разрешение воспаления. Накопление апоптотического мусора в организме может вызвать хронические воспалительные реакции, которые приводят к системным аутоиммунным заболеваниям с течением времени. Нарушенного апоптотического клеточного допуска был замешан в различных аутоиммунных заболеваний. Апоптотический зазор – это сложный процесс, который редко обнаруживается в физиологических условиях. Она включает в себя обильные поверхностные рецепторы и сигнальные молекулы. Изучение процесса апоптотического клеточного расчистки обеспечивает проницательные молекулярные механизмы и последующие биологические реакции, которые могут привести к развитию новых терапевтических средств. Здесь мы описываем протоколы для индукции апоптотических тимоцитов, подготовку перитонеальных макрофагов, а так же анализ апоптотических клеточных расчистки по течению цитометрии и микроскопии. Все клетки будут подвергаться апоптозу на определенном этапе, и многие жилые и циркулирующих клеток может поглощения апоптотического мусора. Таким образом, описанный здесь протокол может быть использован во многих приложениях для характеризации апоптотического клеточного связывания и проглатывания многими другими типами клеток.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Наше тело генерирует 1-10 миллиард апоптотических клеток на ежедневной основе. Такое большое количество апоптотических клеток должно быть очищено таким образом, что иммунные реакции остаются покоя. Для обеспечения очистки апоптотических клеток своевременно, многочисленные виды тканей резидентов клеток и циркулирующих клеток разработать механизмы, чтобы поглотить апоптотических клеток1. Дисфункциональные регулирование апоптоза был замешан в возникновении и прогрессирования различных воспалительных заболеваний и аутоиммунитет2. Апоптоз также играет решающую роль в патогенезе развития рака и его последующее сопротивление традиционным лечения3,4. Удаление апоптотических клеток обычно способствует противовоспалительной реакции, которые могут быть связаны с иммунологической толерантности5. Нарушение апоптотического клеточного расчистки стимулирует самоиммунизацию и способствует развитию системных аутоиммунных заболеваний как у людей, так и у мышей6.

Когда клетки проходят апоптоз, они подвергают воздействию фосфатидилсерина (Птдзер) из внутренней листки в внешнюю брошюру мембраны. Птдзер будет распознан фагоцитами через поверхностные рецепторы. Более десятка рецепторов были определены распознавать и/или способствовать поглощает апоптозных клеток. В общем, есть по крайней мере три типа поверхностных рецепторов, участвующих в апоптосной клеточной очистки: привязывая рецепторы, признают Апоптотические клетки; Щекотка рецепторов, инициировать поглощает; рецепторы, облегчающие весь процесс7. Таминовых рецепторов тирозина (там Риткс) состоят из Tyro-3, AXL, и мER и в первую очередь выражены миелоидных клеток иммунной системы8. Основная функция там Риткс заключается в том, чтобы служить привязывая рецепторы, облегчая фагоцитическое удаление апоптотических клеток и мусора. Наша группа изучила там опосредованный апоптотический клеточный зазор в условиях аутоиммунитета на долгие годы. Витамин к-зависимый рост белка арест специфического белка 6 (Gas6) и белка S (плюсы) связывается и активирует там рецепторы9,10. Gas6 вырабатывается в сердце, почках и легких. Профи в основном производятся в печени11. ТАМ признает апоптозных клеток таким образом, что N-терминал Gas6/профи связывается с Птдзер на апоптотической клетке и C-терминал Gas6/профи связывается с там рецепторов, которые закреплены на поверхности фагоцитов. Вместе с другими рецепторами, поглощает Апоптотические клетки происходит12. Хотя Mer может связываться как с лигандами профи и Gas6, мы обнаружили, что Gas6, как представляется, единственным лигандов для Mer опосредованного фагоцитоза апоптоз клеток, которые могут быть заблокированы анти-Mer антитела13. Макрофаги являются профессиональными гогоцитами. Быстрое оформление апоптозных клеток макрофагами имеет важное значение для ингибирования воспаления и аутоиммунные реакции против внутриклеточных антигенов. Mer рецептор тирозинкиназы имеет решающее значение для затопления макрофагов и эффективного оформления апоптотических клеток14. В селезенке мыши, Mer главным образом выражает на предельной зоне и материальном теле макрофагах13.

Представленный здесь протокол описывает базовый метод индуцирования апоптоза клеток и демонстрирует способы измерения процесса и эффективности эффоцитоза. Эти протоколы могут быть легко адаптированы для изучения эффофоцитоз другими типами клеток в поглощает апоптозных клеток различного происхождения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Подопытных мышей разводили и поддерживали в нашей мышиных колониях. Все животные работы были проведены в соответствии с руководящими принципами институционального ухода за животными и Комитета по использованию (ИАКУК) Университета Цинциннати.

1. Подготовка CFSE помечены апоптотических тимоцитов

  1. Эвтаназии двух наивных C57/В6 мышей по CO2 вдыхании 10 мин и рассечения, чтобы открыть грудную полость, удалить (вытащить) тимуса с изогнутыми тонкой наконечник щипцы в ткань культуры Петри, содержащий 10 мл RPMI1640 среды.
  2. Получить одну клеточную суспензию, шлифовальные весь тимус против двух матовое концы микроскопа слайды, а затем фильтр подвески через 100 мкм сетчатый фильтр.
  3. Соберите суспензию 10 мл тимуса в трубку 50 mL и центрифугу на 300 x g в течение 5 мин.
  4. Снимите supernatant, ресуспензируем в 40 мл 1x PBS, и Кол-во номера клеток с хемоцитометер.
  5. Центрифуга на 300 x g для 5 мин и удалить supernatant.
  6. Ресуспензируем в 20 мл 1x PBS в 50 mL трубки в качестве одной ячейки подвески с до 2 х 108 клеток (если больше, чем 2 х 108 клеток, ресуспензируем остальные клетки в другой 20 мл 1 х PBS в различных 50 ml трубки).
  7. Сделать 5 мкм CFSE в равном объеме (20 мл) 1x PBS в отдельной 50 mL трубки на пипетки 40 мкл из CFSE складе решение (2,5 mM) в 20 мл 1x PBS и хорошо перемешать путем инвертинг трубки 2-3 раз.
  8. Добавить 20 мл CFSE из шага 1,7 в 20 мл клеточной суспензии из шага 1,6 (окончательная концентрация CFSE в настоящее время 2,5 мкм).
    Примечание: для каждой ячейки суспензии 20 мл требуется 20 мл трубки CFSE.
  9. Инвертировать ячейку и CFSE смесь трубки 2-3 раз и инкубировать смесь в темноте при комнатной температуре в течение максимум 2 мин, затем остановить реакцию, добавив 10 мл тепла-инактивированных лошадь сыворотки.
  10. Центрифуга 50 mL смесь трубки на 300 x g для 5 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Если маркировка CFSE успешно, ячейки гранулы станет светло-желтого цвета.
  11. Удалите супернатант и ресуспензируем ячейки гранул в 40 мл 1x PBS и Кол-номера клеток с хемоцитометер.
  12. Центрифуга ячейки подвески на 300 x g в течение 5 минут и отбросить supernatant.
  13. Вымойте ячейку гранул снова с 40 мл среднего RPMI1640.
  14. Удалите супернатант и ресуспензируем клетки с RPMI1640 культуры ткани среды (RPMI1640, 20 мм HEPES, 10% ФБС (тепло инактивированных), 20 мм глютамина, и 1x Пен/стрептококк) при концентрации 7 х 106 клеток/мл в 100 мм ткани культуры блюдо.
    Примечание: если больше клеток получены, отдельный 100-мм ткани культуры блюдо будет необходимо.
  15. Добавьте ставроспорина в культуру суспензии клеток в конечной концентрации 1 мкм и культуры на 4 ч при температуре 37 ° с в инкубаторе культуры ткани поставляется с 5% CO2.

2. Приготовление перитонеальных макрофагов

  1. Впрыснуть два C57B6 мышей (или любой ген-манипулировали мышей в лаборатории) интрааперитиально с 1 мл 3% в возрасте тиоглисопоставления в день 0.
  2. Эвтаназии мышей в день 5, как в шаге 1,1, вырезать и очистить открытой брюшной кожи, но оставить брюшины нетронутыми. Флеш брюшной полости, быстро нажав 10 мл буфера мытья (RPMI1640, 2% ФБС, 0,04% ЭДТА) в брюшной полости с использованием шприца 10 мл прилагается с 18 г иглы.
  3. Медленно извлекайте буфер мытья с той же иглой/шприцом и соберите буфер для мытья в 50 mL (подробности относятся к лабораторной статье Янссен15).
  4. Вымойте перитонеальный Гавриил дважды с 1x PBS, ресуспензируем перитонеальный макрофаги в RPMI1640 ткань культуры среды при плотности 2 х 106 клеток/мл и Алиготе 500 мкл в каждый колодец 24-хорошо пластины. Оставьте тарелку в инкубаторе тканевой культуры на 2 ч.
  5. Удалите плавающие клетки, аспирин и заменив 500 мкл свежей культуры среды, в два раза.
  6. По желанию добавьте ингибитор тирозин там рецептора, RXDX-106, в концентрациях, указанных в рисунке легенды в каждый колодец макрофагов культуры и инкубировать еще 2 ч.

3. co-культура перитонеальных макрофагов с апоптотической тимоцитов

  1. Соберите Апоптотические тимоциты из шага 1 и промойте три раза с RPMI1640 средой. Эффективность апоптотической индукции можно измерить на данном этапе с помощью приложения V/7-ад.
  2. Распределите 0-12 x 106 клеток (в 500 мкл среды) в каждый колодец макрофагов культур от протокола #2, в соответствии с экспериментальной договоренности (например, см. диаграмму 1). Это делает весь объем культуры 1 мл в каждом хорошо 24-хорошо пластины. Добавить блокирующего антитела в культуру непосредственно перед добавлением апоптотических тимоцитов.
  3. Культура клеточной смеси при температуре 37 ° c для 4 ч в инкубаторе культуры ткани поставляется с 5% CO2.
  4. Вымойте каждый колодец культуры с 1x PBS (содержащий 500 мкм ЭДТА) дважды, чтобы удалить свободно плавающие апоптозных клеток.
  5. Пятно пластины связанных макрофаги с CD11b-PE на данном этапе.
    1. Вымойте пластины связанных макрофаги с окрашивания буфера (1x PBS, 1% БСА) один раз.
    2. Добавьте 200 мкл окрашивания буфера, содержащего 2 мкл CD11b-PE в каждый колодец.
    3. Инкубировать пластины при температуре 4 °C в течение 20 мин.
    4. Вымойте каждый колодец пластины три раза с окрашивания буфера.
    5. Добавить 200 мкл окрашивания буфера и приступить пластины для анализа изображений под флуоресцентным микроскопом.
  6. Кроме того, отделить пластины связанных макрофагов, добавив 1 мл 1% лидокаин в PBS и инкубации в течение 10 минут при температуре 37 ° c.
  7. Отсоедините пластину связанных макрофагов с повторным пипеткой.
  8. Перенесите суспензию макрофагов в индивидуальную 5 мл-нижнюю панель FACS с каждой скважины 24-хорошо пластины.
  9. Центрифуга на 300 x g в течение 5 мин.
  10. Удалите супернатант и добавьте 200 мкл окрашивания буфера, содержащего 2 мкл CD11b-PE (1:200 разбавления в буфере окрашивания).
  11. Инкубировать клеточную суспензию в окрашивании буфера при температуре 4 °C в течение 20 мин.
  12. Вымойте клеточную подвеску дважды при окрашивании буфера.
  13. Добавить 200 мкл окрашивания буфера и приступить к анализу FACS с потоком cytometer и проанализировать процент от макрофагов положительности CFSE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Анализ перитонеального макрофага-опосредованного затопления апоптотических тимоцитов. Перитонеальных макрофагов и апоптотических клеток были подготовлены и совместно культивировали как описано в протоколе. Макрофаги были отделены и запятнанные с a сопрягано Anti-CD11b антитело PE для 20 минут на льдах. Макрофаги затем промывают и обрабатываются в потоке cytometer. Как видно, в правом нижнем квадранте нет положительного макрофага CFSE, когда в культуру не добавлялись Апоптотические клетки (рис. 1 а и Рисунок 2, первая панель). Тиоглисопоставления-стимулируемые перитонеальный макрофаги имеют переменную способность поглощать Апоптотические клетки. До 30% макрофагов показали положительный в канале CFSE, указывая, что они проглотили CFSE-помечены апоптозных клеток в этом эксперименте (рис. 1). Стоит отметить, что CFSE позитивные макрофаги распространено в нижнем правом квадранте из-за разной интенсивности, указывая, что количество апоптотических клеток в макрофагах отличается. Таким образом, микроскопическое наблюдение за тем, как макрофаги поглощает Апоптотические клетки, имеет важное значение для исследования способности макрофогов глотать Апоптотические клетки (рис. 2). Более высокое соотношение апоптотических клеток к макрофагов не только увеличивает количество макрофагов глотания апоптозных клеток, но и усиливает способность макрофагов глотать больше апоптотических клеток (рис. 2).

Доза-зависимое торможение эффффероцитоза по Mer блокировки.
В другом наборе экспериментов, мы обнаружили, что около 15% макрофагов стал CFSE позитивные, когда CFSE-помечены апоптозных тимоцитов (рацион 6:1) были добавлены в макрофагов культуры для 4 ч, указав, что они гофцитические макропаги (рис. 3 B). Одна из функций Mer на макрофагах заключается в признании и опосредуют фагоцитоз апоптотических клеток через мостовая молекула, Gas6. Чтобы проверить процент эффер-цитоз, приписываемых мер ингибирование, мы добавили анти-Mer антител в культуру, чтобы блокировать Mer-опосредованного эффоцитоз. Мера антитела блокирует макрофагов эффроцитоз в дозозависимые образом (рис. 3C, рис. 3D) и общая блокировка может составляют около 30% от эффективности эффртоцитоз в текущем настройки (рис. 3) , Эти данные также подтвердил в нашем предыдущем исследовании с Mer нокаут макрофаги13. Затем мы протестировали эффективность торможения с недавно утвержденных FDA ингибитор там рецепторов, RXDX-106, который подавляет все там рецепторы с различными сродства (Аксель > > Tyro3 > Mer). RXDX-106 был добавлен в культуру макрофагов за 2 часа до соинкубации апоптотических тимоцитов. Как показано на рисунке 4, rxdx-106 ингибирует Макрофаг эффероцитоз в дозе зависимой манере. Концентрация насыщенности ингибирования составила около 100 Нм (Рисунок 4, сплошная линия), концентрация, которая, как представляется, более эффективна, чем Mer-дефицит (Рисунок 4 пунктирная линия) или Mer антитела (рис. 3, панель D) в одиночку. Поскольку макрофаги выражает все три там рецепторы на поверхности16, ожидается, что более высокие концентрации RXDX-106 (более 100 Нм) будет блокировать все три рецепторы, и, следовательно, будет более эффективным в блокировании эффероцитоз, чем таргетинга одного там рецептора, Mer.

Figure 1
Рисунок 1 . Процент фагоцитоза апоптозных тимоцитов брюшной Апоптотические тимоциты индуцированные инкубации с 1 мм ставроспорина для 4 ч и добавил в макрофагов культуры в соотношении, как указано в рисунке панелей: (a) 1:0; B) 1:1; C) 1:2; D) 1:4; E) 1:6; (F) 1:8; (G) 1:10; (H) 1:12. Данные были приобретены с потоком cytometer. Был проанализирован процент фагоцитических макрофагов с использованием программного обеспечения, связанного с потоком cytometer. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Микроскопический анализ эффразоцитоза. Эффффероцитоз был подготовлен как на рисунке 1. Фагоцитические макропаги были запятнаны на месте на плите с CD11b-PE, зафиксированными с параформальдегидом, и оценены. Изображения были приобретены с помощью флуоресцентного микроскопа и проанализированы с программным обеспечением, связанным с микроскопом. Представительные вставки были увеличены в цифровом формате и показаны ниже в каждом изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Ингибирование перитонеального макрофага эффоцитоз по анти-Mer антитела. Апоптотические клетки были подготовлены и совместно культивировали с макрофагами для 4 h как описано в протоколе. Anti-Mer AB было добавлено в культуру макрофагов немедленно перед Co-культурой с апоптотической клетками. Фагоцитические макромаги были отделены и окрашены в анти-мышь CD11b-PE антитела на льду в течение 20 мин. данные были приобретены и проанализированы как на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . RXDX-106 опосредованное ингибирование макрофагов эффероцитоз. Эффффероцитоз был создан как описано на рисунке 3. RXDX-106 был добавлен два часа до Co-культуры с апоптотических тимоцитов. Mer-дефицитные перитонеальных макрофагов были подготовлены аналогично и служил в качестве контрольной группы. Данные были приобретены и процент фагоцитических макрофагов были закрытый на CD11b положительных клеток и проанализированы с помощью потока cytometer программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Апоптоз является высоко консервативны клеточной смерти процесс, который включает в себя множество каскадов сигнала и индуцирует выражение белка, секреции и транспортировки. Апоптоз часто ассоциируется с клеточными изменениями морфологии17. Апоптотические клетки активно выпускают цитокинов и хемокинов, которые привлекают фагоцитов к миграции на участок и инициируют процесс затопления, чрезвычайно сложного пути под жестким контролем18. С другой стороны, некротической клеточной смерти релизы опасности сигналы, которые вызывают воспалительные реакции1. Дефектный или длительный зазор апоптотических клеток приведет к вторичным некрозом этих клеток19. Таким образом, сроки в апоптоз индукции очень важно в эксперименте. Есть множество способов индуцировать клеточный апоптоз20. Однако длительность и сила индукции зависят от типа клеток. Мы рекомендуем создать эксперимент титрования для определения оптимального состояния максимума (90-95%) апоптоз производства. Использовался набор для обнаружения апоптозных-V/7-ААД, и в нашей лаборатории следовали инструкциям по оценке эффективности инсульта. Наша лаборатория пробила два различных способа индуцировать апоптоз тимоцитов в прошлом. Гамма-излучение, кажется, лучший метод, так как он не имеет никаких химических остатков в культуре и индуцирует несколько некротических смертей клеток. Мы подвергаем тимоцитов 500 рад g-излучения следуют 4-h культуры в RPMI1640 среде. Мы наблюдали около 95% апоптотических тимоцитов13. Когда радиатор недоступен, мы индуцированных тимоцитов пройти апоптоз с 1 мкм ставроспорина в культуре для 4 ч (шаг 1,15). Первичные клетки, как правило, более чувствительны к апоптозу индукции. Обширные шаги Стиральная также необходимы для удаления химических веществ из культуры перед со-культуры с фагоцитов. Существует множество способов обозначения апоптотических клеток. Хотя токсичность была связана с высокой концентрацией, CFSE очень эффективно сохраняется в цитоплазме, когда тщательно оптимизированы21. pHrodo является кислотно-чувствительным красителя, который увеличивается в флуоресценции, как рН окружающей среды уменьшается. Из-за низкого рН фаголисосома, гофцитированные Апоптотические клетки можно легко отличить от физически прикрепленной, но не охваченная апоптотической клетками в пробирках22.

Многочисленные поверхностные рецепторы (там рецепторы, рецептор манноза, интегралы (CD11b/CD18), рецепторы приспособления, рецепторы FC, и др.) допускают фагоциты различать себя от патогенов и различать последующие реакции23. Различные рецепторы работают вместе, чтобы закончить довольно сложный процесс. Блокирование рецептора (ы), вероятно, приводит к частичному ингибированию фагоцитоза. Первичные макрофаги можно подготовить из различных ресурсов с различными методами (костный мозг производных макрофагов, перитонеальных макрофагов, селезенки макрофаги, и др.). Преимуществом тиоглисопоставления-индуцированных макрофагов является перекос фагоцитарного фенотипа; недостатком является то, что тиоглисопоставления должно быть в возрасте в темноте, по крайней мере 3 месяцев. Тем не менее, раствор тиоглисопоставления имеет срок годности 2 года. Постоянный запас решения должен преодолеть этот недостаток. При подготовке перитонеальных макрофагов, следовые количества красных кровяных телец в небрюшинной коллекции макро, не должны влиять на эксперимент, так как они собираются быть смыты вместе с плавающей клетки после 2 ч макрофаги культуры. Большое количество красных кровяных телец (видимых гранул) может потребовать лечения с ACK lysing буфер. Макрофаги, как правило, плотно прилегают к поверхности культуры. В литературе цитируются различные методы для отсоединения клеток адгезии с поверхности24. Фермент основе отряд дает высокий уровень восстановления клеток, но может повредить поверхностные рецепторы, нарушая функции клеток и связанных с ними анализов. Изменение поверхностных рецепторов может также повлиять на рецептор на основе потока цитометрии анализа. Лидокаин вызывает морфологию клеток, чтобы изменить к более сферической конформации из-за блокады ионных каналов кальция25. Это лучший способ отделить макрофаги от поверхности без заметного повреждения в нашем эксперименте.

Макрофаги, содержащие Апоптотические клетки, могут анализироваться путем анализа потока цитометрии или на основе микроскопа. FACS могут быть применены для анализа большого количества клеток в короткое время и может дополнительно идентифицировать подтипы клеток путем дифференциального окрашивания с антителами против конкретной поверхности или цитоплазматических белков. Оптимальная концентрация (соотношение) апоптотических клеточных чисел в системе Co-культуры также может быть решена с помощью анализа FACS. Микроскопический анализ имеет ограничения в отношении числа клеток и дифференциальных пятен по сравнению с анализом Сус. Тем не менее, Люминесцентная микроскопия обеспечивает углубленную информацию. Для исследования способности и кинетики макрофагов, чтобы глотать Апоптотические клетки, необходим микроскопический анализ, в котором находится макрофарг. Промежуток времени в целом прогрессии проглатывания может предоставить подробную информацию о том, сколько времени требуется, чтобы поглотить один апоптотических клеток, и сколько апоптотических клеток может глотать один макрофагов одновременно. Фагоцитические макрофаги могут также быть проанализированы Вестерн-блот, чтобы исследовать сигнальные молекулы, регулируемые процессом затопления. Профили экспрессии генов, связанные с этим процессом, могут быть оценены в режиме реального времени.

Наконец, этот протокол обеспечивает базовую платформу в экспериментальном анализе эффроцитоза. Другие типы клеток (дендритные клетки, мезангиальные клетки, эпителиоциты) могут также функционировать для поглощения апоптотических клеток на их жилых участках. Эти клетки имеют предпочтения в использовании различных рецепторов распознавать и инициировать процесс апоптотического клеточного допуска2. Общая фагоцитарная эффективность может зависеть от нескольких факторов, включая экспериментальные и клеточные специфические факторы. Переменные результаты сообщенных в словесности вероятно из-за 1) продолжительности Co-культуры; 2) ресурс и подготовка фагоцитов и апоптотических клеток; 3) методы, чтобы отделить Апоптотические клетки от фагоцитов. Описанный здесь протокол может применяться к фагоцитарный потенциал других клеток. Оптимизация может потребоваться для максимизации фагоцитарный потенциал клеток-мишеней. Мы проанализировали почечно-Мезангиальный клеточный фагоцитоз апоптозных тимоцитов, вырабатываемых таким же образом, как описано в этом протоколе. Нейтрофилы играют ключевую роль в врожденной иммунной системе путем устранения патогенных микроорганизмов. Нейтрофилов фагоцитоз помечены бактерии или частицы могут быть проанализированы потока цитометрии26. Однако, нейтрофилы имеют очень короткий полураспада (6-8 h) и нейтрофилов фагоцитоз бактерий или грибов происходит в течение нескольких секунд до минут27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Исследование в лаборатории Шао поддерживается научно-исследовательской премией от медицинского колледжа и экспериментальной премии младшего факультета от Департамента внутренней медицины, Университета Цинциннати и гранта ДК K01_095067 от NIDDK/НИЗ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
Экспериментальный анализ Апоптотического тимоцита с помощью макрофагов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter