Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für eine On-Membran-Verdauungstechnik zur Vorbereitung von Proben für die Massenspektrometrie vor. Diese Technik erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Abstract
Zahlreiche intrazelluläre Proteine interagieren physisch in Übereinstimmung mit ihren intrazellulären und extrazellulären Umständen. Tatsächlich hängen die zellulären Funktionen weitgehend von intrazellulären Protein-Protein-Wechselwirkungen ab. Daher ist die Forschung über diese Wechselwirkungen unerlässlich, um das Verständnis physiologischer Prozesse zu erleichtern. Die Ko-Ausfällung assoziierter Proteine, gefolgt von einer Massenspektrometrie-Analyse (MS), ermöglicht die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen. In dieser Studie haben wir Details der neuartigen Technik der Immunpräzipitations-Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Analyse in Kombination mit der On-Membran-Verdauung für die Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen bereitgestellt. Diese Technik eignet sich für rohe Immunpräzipitantien und kann den Durchsatz proteomischer Analysen verbessern. Tagged rekombinante Proteine wurden mit spezifischen Antikörpern gefällt; als nächstes wurden Immunpräzipitanten, die auf Polyvinylidendifluorid-Membranstücke gefleckt wurden, einer reduktiven Alkylierung unterzogen. Nach der Trypsinisierung wurden die verdauten Proteinrückstände mit LC-MS/MS analysiert. Mit dieser Technik konnten wir mehrere kandidatenassoziierte Proteine identifizieren. Daher ist diese Methode praktisch und nützlich für die Charakterisierung neuartiger Protein-Protein-Wechselwirkungen.
Introduction
Obwohl Proteine in lebenden Organismen eine konstitutive Rolle spielen, werden sie in der intrazellulären Umgebung kontinuierlich synthetisiert, verarbeitet und abgebaut. Darüber hinaus interagieren intrazelluläre Proteine häufig physikalisch und biochemisch, was die Funktion eines oder beider1,2,3. Beispielsweise ist die direkte Bindung des spliceosomenassoziierten Proteinhomologs CWC22 mit dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 4A3 (eIF4A3) für die Montage des exon-Junction-Komplexes4erforderlich. In Übereinstimmung damit, eine eIF4A3 Mutante, die Affinität für CWC22 fehlt nicht exon Junction komplexe mRNA spleißen4zu erleichtern. Daher ist die Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen entscheidend für das genaue Verständnis der physiologischen Regulation sowie der zellulären Funktionen.
Jüngste Fortschritte in der Massenspektrometrie (MS) wurden auf die umfassende Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen angewendet. Zum Beispiel ermöglicht die Ko-Ausfällung von endogenen Proteinen oder exogen eingeführten markierten Proteinen mit ihren zugehörigen Proteinen, gefolgt von einer MS-Analyse, die Identifizierung neuartiger Proteinwechselwirkungen5. Ein großer Engpass bei der MS/MS-Analyse ist jedoch die schlechte Erholung von tryptischen Digests von Proteinproben. Zur Durchführung proteomischer Analysen an Zelllysaten werden in der Regel In-Gel- und On-Membran-Verdauungstechniken zur Vorbereitung von MS/MS-Proben eingesetzt. Wir haben zuvor ein In-Gel-Verdauungsverfahren mit einer On-Membran-Verdauungstechnik6verglichen und gezeigt, dass letztere mit einer besseren Sequenzabdeckung verbunden war. Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran kann für diesen Zweck geeignet sein, weil es mechanisch robust und beständig gegen hohe Konzentrationen von organischen Lösungsmitteln7,8, ermöglicht die enzymatische Verdauung von immobilisierten Proteine in Gegenwart von 80% Acetonitril9. Darüber hinaus kann die Immobilisierung auf einer Membran konformationale Veränderungen in Denkproteinen auslösen, was zu Verbesserungen der tryptischen Verdauungseffizienz10führt. Dementsprechend haben wir in diesem Artikel die Verwendung von Immunpräzipitation-LC/MS/MS-Analysen von Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membran-Verdauungstechnik beschrieben. Diese einfache Methode erleichtert die bequeme Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen auch in nicht spezialisierten Laboratorien.
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Protocol
1. Immunitizipation
HINWEIS: Wir verwendeten Nicht-Natriumdodecylsulfat (SDS) Lysepuffer und Citrat-Elution, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben. Die Verwendung einer alternativen internen Immunpräzipitungstechnik kann jedoch auch für die Herstellung von LC-MS/MS-Proben geeignet sein.
- Transfekte kultivierte Zellen mit Vektoren, die ein Epitop-Tag allein oder ein Fusionsprotein kodieren. Zur Erfassung repräsentativer Daten übertragen Sie J774-Zellen (1 x 106) mit Vektoren, die allein für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) oder GFP-fused Capn6 (Calpain-6-Gen) mit kationischen Liposomen kodieren.
- Konjugieren Sie Antikörper gegen magnetische Perlen.
- Zu diesem Zweck anti-GFP-Antikörper (2 l/Reaktion) mit magnetischen Perlen (25 l/Reaktion) in 500 l Citratphosphatpuffer (24,5 mM Zitronensäure, 51,7 mM dibasisches Natriumphosphat; pH 5,0) in einem 1,5 ml-Reagenzglas mischen.
- Drehen Sie die Mischung bei 50 Umdrehungen für 1 h bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die IgG-konjugierten Perlen dreimal mit Citratphosphatpuffer, der 0,1% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat enthält.
- Lyse die transfizierten Zellen mit einem entsprechenden Lysepuffer. Zur Erfassung repräsentativer Daten lysieren Sie die transfizierten Zellen für 30 min auf Eis in 400 l Lysepuffer (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% Poly(Oxyethelene) Octylphenylether) mit 40 x Mol/L Phenylmethylsulfonylfluorid, 50 g/ml Leutin, 50g/ mL Aprotinin, 200-Mol/L-Natriumorthovanadate und 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) in 1,5 ml-Reagenzgläsern 24 h nach Transfektion.
- Löschen Sie das Lysat durch Zentrifugieren bei 15.000 x g für 5 min und sammeln Sie den Überstand.
- Löschen Sie das Lysat. Fügen Sie unbeschriftete Magnetperlen (25 l/Reaktion) in ein 1,5 ml-Teströhrchen ein. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 l Citratphosphatpuffer. Nach der Entfernung des Citratphosphatpuffers in der Endwäsche, fügen Sie die Zelle Lysat über die magnetischen Perlen. Drehen Sie das Gemisch mit Rotator bei 50 Umdrehungen für 30 min bei Raumtemperatur.
- Legen Sie das Reagenzglas für 5 min für die magnetische Trennung auf einen magnetischen Ständer und sammeln Sie das Zelllysat. Die Verwendung des vom Hersteller bezeichneten Magnetständers wird empfohlen.
- Binden Sie die Zielproteine an die konjugierten Perlen. Das Immunglobulin (Ig)G-konjugierte Perlen für 5 min für die magnetische Trennung auf einen magnetischen Ständer legen, den Citratpuffer entsorgen und dann das Zelllysat zu den getrennten Perlen hinzufügen.
- Drehen Sie die Mischung bei 50 Umdrehungen für 1 h bei Raumtemperatur.
- Trennen Sie die Zielproteine von freien Nichtzielproteinen. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 500 l Citratphosphatpuffer, der 0,1% Polyoxyethylen (20) Sorbitan-Monolaurat enthält. Nach der letzten Wäsche 30 l Citratpuffer (pH 2–3) hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Zielproteine zu löschen.
HINWEIS: Wenn die Erholung von der Immunpräzipitation unzureichend ist, kann die Verwendung alternativer Epitop-Tags, wie FLAG oder HIS, die Effizienz verbessern. Wenn die Effizienz der Elution nicht ausreicht, kann die Verwendung anderer Eluants, wie z. B. einer SDS-basierten Lösung, die Effizienz verbessern.
2. On-Membran-Verdauung von Proteinen
HINWEIS: Die Verwendung von proteinfreien Materialien und Geräten ist notwendig, um eine Kontamination mit exogenen Proteinen zu vermeiden. Darüber hinaus wird empfohlen, dass der Bediener eine chirurgische Maske und Handschuhe trägt, um eine Kontamination durch menschliche Proteine zu vermeiden.
- SCHNEIDEN Sie PVDF-Membranen mit chirurgischer Schere in 3 mm x 3 mm Stücke, die unmittelbar vor der Verwendung mit Methanol abgewischt und getrocknet wurden.
- Fügen Sie 2–5 l Ethanol auf die Stücke der PVDF-Membran auf saubere Aluminiumfolie.
- Bevor sie vollständig trocknen, fügen Sie das Eluant (je 2–5 l, 4–6 Stück pro Probe) auf die hydrophilen PVDF-Membranen auf, und trocknen Sie dann die Membranen lufttrocken, bis die Membranoberfläche matt wird. Getrocknete Membranen können bei 4 °C gelagert werden.
- Übertragen Sie alle Membranen in 1,5 ml Kunststoffrohre, fügen Sie 20–30 l Ethanol hinzu, um die Membranen hydrophil zu machen, und entfernen Sie dann das Ethanol mit einer Pipette.
- Bevor die Membran vollständig austrocknet, fügen Sie 200 L Dithiothreitol (DTT)-basierte Reaktionslösung (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT und 20% Acetonitril) hinzu und inkubieren Sie sie bei 56 °C für 1 h.
- Ersetzen Sie die Reaktionslösung durch 300 l Iodoacetamidlösung (80 mM NH4HCO3, 55 mM Iodoacetamid und 20% Acetonitril) und brüten 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Waschen Sie die Membranen zweimal mit 1 ml destilliertem Wasser und einmal mit 1 ml 2% Acetonitril durch Wirbelmischung für >10 s.
- Lyophilisiertes Trypsin(Materialtabelle) direkt in der Reaktionslösung auflösen (30 mM NH4HCO3 mit 70% Acetonitril). Fügen Sie 100 l der Reaktionslösung hinzu, die 1 g Trypsin (Materialtabelle) (30 mM NH4HCO3 mit 70 % Acetonitril) enthält, und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Übertragen Sie die Reaktionslösung, die die tryptischen Digests enthält, mit einer Pipette in ein sauberes 1,5 ml-Reagenzglas.
- 100 l Waschlösung (70% Acetonitril/1% Trifluoressigsäure) in die Membran geben und bei 60 °C für 2 h inkubieren. Die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung vermischen. Fügen Sie der Membran weitere 100 L Waschlösung hinzu und beschallen Sie sie 10 min. Dann die Waschlösung sammeln und mit der Reaktionslösung mischen.
- Bedecken Sie das Reagenzglas mit einem Stück Laborfolie und machen Sie ein paar kleine Löcher mit einer Nadel. Trocknen Sie die Lösung mit einem Vakuumkonzentrator.
- Lösen Sie den Rückstand in 10 l 0,2% Ameisensäure. Nach der Zentrifugation (12.000 g, 3 min bei Raumtemperatur) den Überstand in ein Probenrohr geben.
HINWEIS: Die Washes sind die kritischen Schritte dieses Abschnitts. Bei der Proteinverdauung auf der Membran ist das Waschen der Membranen, die die immobilisierten Proteine enthalten, nach Reduktion und Alkylierung mit destilliertem Wasser, gefolgt von 2% Acetonitril, jeweils mehr als 10 Sek., entscheidend für die Entfernung der Reagenzien.
3. LC-Elektrospray-Ionisation (ESI)-MS/MS-Analyse
- Aktivieren Sie ein ESI-MS/MS-Instrument (Materialtabelle) gekoppelt mit einem Nano-LC-HPLC-System (Materialtabelle). Verknüpfen Sie eine Vorspalte (Materialtabelle) und eine analytische Spalte (Materialtabelle).
- Kalibrieren Sie vor der Analyse das Massenspektrometer mit tryptischen Digests von Rinderserumalbumin, gelöst in 0,2% Ameisensäure, die Standardpeptide liefert.
- Analysieren Sie die Proben im positiven Ionenmodus und einem Massenbereich von 400–1.250 m/z; dann erreichen Sie bis zu 10 MS/MS-Spektren (je 100 ms) mit einem Massenbereich von 100–1.600 m/z und einem linearen Gradienten von 2%–80% Acetonitril und 0,2% Ameisensäure für 80 min bei einer Durchflussrate von 300 nL/min.
- Analysieren Sie die Ausgabedaten mithilfe einer Software zur Proteinidentifikation (Materialtabelle), um die zugeordneten Proteine zu identifizieren. Für die positive Identifizierung eines Kandidatenproteins ist der Nachweis von mindestens einem Hochtreue-Peptidfragment (> 95% Treue) erforderlich.
- Lassen Sie die Proteine, die in GFP-exzipierten Lysaten (Transfektion von Vektoren, die ein GFP-Tag allein exzessiieren) aus der Liste der Kandidatenproteine ausgefällt werden.
HINWEIS: Wenn in der Datenbankanalyse nur wenige Proteine identifiziert werden, kann die Änderung der MS/MS-Erfassungsbedingungen (z. B. Änderung der Zeit von jeweils 100 ms auf 50 ms) die Anzahl der identifizierten Proteine erhöhen.
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Representative Results
Mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens wurden Immunpräzipitantien mit LC-MS/MS analysiert (Abbildung 1). Nach dem Ausschluss exogen abgeleiteter Proteine (Proteine anderer Arten und IgGs) wurden 17 Proteine in Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitantien (Tabelle 1) und 15 Proteinen in GFP-assoziierten Immunpräcipitantien ( Tabelle 2). Von den Calpain-6- und GFP-assoziierten Proteinen wurden 11 in beiden Immunpräcipitantien identifiziert (Abbildung 2). Nachdem diese und Calpain-6 selbst ausgeschlossen wurden, blieben fünf Kandidaten-Calpain-6-assoziierte Proteine übrig: Komplement C1q Untereinheit C, Keratin Typ II Cytoskelett 8, IgE-bindendes Protein, ADP/ATP-Translocase 1 und Ubiquitin.
Abbildung 1. Schema für die On-Membran-Gärungstechnik
Zelllysate wurden mit magnetischen Perlen, die mit spezifischen Antikörpern konjugiert wurden, gefällt. Das Eluant aus der Immunpräzipation wurde auf Stücke der PVDF-Membran gefleckt. Anschließend wurden die Membranen mit Reagenzien zur reduktiven Alkylierung behandelt und anschließend mit Trypsin inkubiert. Die Reaktionslösung wurde dann mit LC-MS/MS analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Überblick über die repräsentativen Daten
Siebzehn Proteine wurden im Calpain-6-assoziierten Immunpräcipitant identifiziert und 15 Proteine wurden im GFP-assoziierten Immunpräzipatitant nachgewiesen. Davon wurden 11 Proteine in beiden Immunpräcipitantien identifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| name | thronbesteigung | Peptide(95%) | %Cov |
| Actin, zytoplasmatisch 2 | sp| P63260| ACTG | 5 | 18,4 |
| Actin, aortenglatter Muskel | sp| P62737| Acta | 5 | 18.57 Uhr |
| Actin, zytoplasmatisch 1 | sp| P60710| Actb | 5 | 18.41 Uhr |
| Actin, Alpha-Skelettmuskel | sp| P68134| Rechtsakte | 5 | 13.53 Uhr |
| Actin, Alpha-Herzmuskel 1 | sp| P68033| Actc | 5 | 13.53 Uhr |
| Actin, gammaenterischer glatter Muskel | sp| P63268| Acth | 5 | 13.56 Uhr |
| Dehnungsfaktor 1-alpha 1 | sp| P10126| EF1A1 | 3 | 33,33 |
| Dehnungsfaktor 1-alpha 2 | sp| P62631| EF1A2 | 3 | 16,2 |
| Keratin, Typ II Zytoskelett 8 | sp| P11679| K2C8 | 3 | 22,65 Uhr |
| Komplement C1q Untereinheit C | sp| Q02105| C1QC | 2 | 8,94 |
| IgE-bindendes Protein | sp| P03975| IGEB | 2 | 21,72 |
| Calpain-6 | sp| O35646| CAN6 | 1 | 15.91 Uhr |
| ADP/ATP-Translocase 2 | sp| P51881| ADT2 | 1 | 27,52 |
| ADP/ATP-Translocase 1 | sp| P48962| ADT1 | 1 | 19.13 Uhr |
| Ubiquitin | sp| P62991| UBIQ | 1 | 40,79 |
| Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 3 | sp| Q64131| RUNX3 | 1 | 15,89 |
| Isoform 2 des Runt-bezogenen Transkriptionsfaktors 3 | sp| Q64131-2| RUNX3 | 1 | 13 |
| "Peptide (95%)" gibt die Anzahl der Peptide an, die mit einem Genauigkeitswert > 95 % in den MS/MS-Daten identifiziert wurden. "%Cov" bezieht sich auf den Prozentsatz der Aminosäurerückstände, die in allen Peptiden (mit > 95 % Genauigkeit) im Verhältnis zur Gesamtzahl der Aminosäurerückstände, die das entsprechende Protein bilden, identifiziert wurden. Zur Verbesserung der Klarheit werden exogene Proteine (Proteine anderer Arten und IgGs), ribosomale Proteine und Histonen nicht gezeigt. | |||
Tabelle 1. Calpain-6-assoziierte Proteine
| name | thronbesteigung | Peptide(95%) | %Cov |
| Dehnungsfaktor 1-alpha 1 | sp| P10126| EF1A1 | 3 | 24,24 |
| Dehnungsfaktor 1-alpha 2 | sp| P62631| EF1A2 | 3 | 24,41 |
| Actin, Alpha-Skelettmuskel | sp| P68134| Rechtsakte | 3 | 13.53 Uhr |
| Actin, Alpha-Herzmuskel 1 | sp| P68033| Actc | 3 | 13.53 Uhr |
| Actin, gammaenterischer glatter Muskel | sp| P63268| Acth | 3 | 13.56 Uhr |
| Actin, zytoplasmatisch 2 | sp| P63260| ACTG | 3 | 13,6 |
| Actin, aortenglatter Muskel | sp| P62737| Acta | 3 | 13.53 Uhr |
| Actin, zytoplasmatisch 1 | sp| P60710| Actb | 3 | 13,6 |
| ADP/ATP-Translocase 2 | sp| P51881| ADT2 | 2 | 25,5 |
| rRNA 2'-O-Methyltransferase fibrillarin | sp| P35550| FBRL | 2 | 14.37 Uhr |
| Prohibitin | sp| P67778| Phb | 1 | 9.19 |
| Heterogenes Kernribonukleoprotein U | sp| Q8VEK3| HNRPU | 1 | 10.63 Uhr |
| Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 3 | sp| Q64131| RUNX3 | 1 | 39,12 |
| Isoform 2 des Runt-bezogenen Transkriptionsfaktors 3 | sp| Q64131-2| RUNX3 | 1 | 26 |
| Dehnungsfaktor 1-gamma | sp| Q9D8N0| EF1G | 1 | 12.36 Uhr |
| "Peptide (95%)" gibt die Anzahl der Peptide an, die mit einem Genauigkeitswert > 95 % in den MS/MS-Daten identifiziert wurden. "%Cov" bezieht sich auf den Prozentsatz der Aminosäurerückstände, die in allen Peptiden (mit > 95 % Genauigkeit) im Verhältnis zur Gesamtzahl der Aminosäurerückstände, die das entsprechende Protein bilden, identifiziert wurden. Zur Verbesserung der Klarheit werden exogene Proteine (Proteine anderer Arten und IgGs), ribosomale Proteine und Histonen nicht gezeigt. | |||
Tabelle 2. GFP-assoziierte Proteine
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Discussion
Wir haben zuvor eine Analyse der oxidativen Modifikationen von Apolipoprotein B-100 in oxidiertem Low-Density-Lipoprotein mit LC-MS/MS beschrieben, der eine On-Membran-Verdauungstechnik vorausgegangen ist6. In der vorliegenden Studie haben wir diese Technik mit Immunpräzipitation kombiniert und mehrere Calpain-6-assoziierte Proteine identifiziert. Diese neuartige Technik stellt eine bequeme Methode zum Screening auf Kandidaten-assoziierte Proteine dar. Calpain-6 ist ein nicht-proteolytisches Mitglied der Calpain-Proteolytikerfamilie11, das berichtenzufolge die zellulären Funktionen durch seine Protein-Protein-Wechselwirkungen12,13modifizieren kann. Mit einer On-Membran-Verdauungstechnik haben wir zuvor andere Calpain-6-assoziierte Proteine identifiziert, die eine andere MS-Einrichtung12verwenden. Daher wird empfohlen, mehrere MS-Bedingungen zu testen, um die Anzahl der identifizierten Kandidaten zu maximieren. Aus dem gleichen Grund ist die Bewertung der Immunpräzipitationsbedingungen, wie z. B. der verwendeten Epitop-Tag-, Waschmittel- und Elutionslösung, wichtig, um optimale Ausgänge zu erhalten.
In der vorliegenden Studie haben wir 11 Proteine sowohl in Calpain-6- als auch in GFP-assoziierten Immunpräcipitantien identifiziert. Die Mehrheit der überlappenden Proteine waren Aktin-Isotypen, und die Kontamination mit Aktin-Zytoskelett-Proteinen ist in den Analysen zellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen üblich, da die Expressionskonzentrationen dieser Proteine sehr hoch sind. Diese Kandidaten sollten daher bei der weiteren Analyse ausgelassen werden. Darüber hinaus wurden Dehnungsfaktoren bei beiden Immunpräcipitantien nachgewiesen. Sie regulieren die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Proteinsynthese und beeinflussen die Proteinfaltung14, und daher ist die Ko-Immunpräzipitation von Dehnungsfaktoren nicht überraschend. Diese Proteine sollten auch bei der weiteren Bewertung weggelassen werden.
Immunpräzipitane können einer reduktiven Alkylierung und enzymatischen Verdauung direkt in der Elutionslösung15unterzogen werden, und diese in-Lösungs-Verdauungsmethode kann auch für die Herstellung von Proben für MS/MS angewendet werden. Wir betrachten jedoch die Verwendung der On-Membran-Verdauung als erhebliche Vorteile gegenüber der in-LösungS-Verdauung. Die PVDF-Membran dient als Gerüst für die anschließende reduktive Alkylierung und enzymatische Verdauung, so dass die für diese Prozesse benötigten Lösungsmittel leicht ausgetauscht werden können. Daher ist es möglich, eine Vielzahl von Elutionslösungen für die Immunpräzipitation zu verwenden. Umgekehrt kann es für die In-Lösung-Verdauung schwierig sein, SDS-basierte oder niedrige pH-Elutionslösungen zu verwenden, da die Proteaseaktivität unter solchen Bedingungen eingeschränkt sein kann. Darüber hinaus kann die Immobilisierung der Zielproteine den anschließenden Waschvorgang erleichtern. Daher eignet sich die On-Membran-Verdauung hervorragend zur Herstellung von Immunpräcipitantien für die MS/MS-Analyse. Für dieses Protokoll kann eine begrenzte Anzahl von Proteasen geeignet sein. Bisher ist nur Lysyl-C, außer Trypsin, berichtend in Gegenwart von bis zu 80% Acetonitril6,9,10,15aktiv.
Unsere On-Membran-Verdauungstechnik eignet sich zur Identifizierung von Proteinen in einer kleinen Menge Immunpräzipitant mit hochempfindlicher Nachweisgrenze. Es sollte jedoch daran erinnert werden, dass die Nachweiseffizienz für ein Zielprotein von der vorhandenen Menge abhängt. Proteine, die in größeren Mengen vorhanden sind, werden bevorzugt detektiert und können verhindern, dass andere Proteine, die in kleineren Mengen vorhanden sind, von MS nachgewiesen werden. Dennoch werden unter normalen Umständen zahlreiche Proteine mittels LC-MS/MS-Analyse nachgewiesen, und es müssen andere Assays verwendet werden, um zu klären, welche der Kandidatenproteine von geeigneter biologischer Bedeutung sind.
In dieser Studie haben wir eine On-Membran-Verdauungstechnik für die Analyse von Immunpräcipitantien bewertet. Eine solche bequeme und umfassende Methode zur Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen sollte allgemein anwendbar sein, um den Durchsatz zukünftiger proteomischer Analysen zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde teilweise von der Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 17K09869 (to AM), Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant Number 15K09418 (to TM), einem Forschungsstipendium der Kanehara Ichiro Medical Science Foundation, unterstützt. und ein Forschungsstipendium der Suzuken Memorial Foundation (alle an TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
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