Summary
Her presenterer vi en protokoll for en on-membran fordøyelsen teknikk for utarbeidelse av prøver for masse massespektrometri. Denne teknikken forenkler praktisk analyse av protein-protein interaksjoner.
Abstract
Tallrike intracellulære proteiner fysisk samhandler i samsvar med deres intracellulære og ekstracellulære omstendigheter. Faktisk er cellulære funksjoner i stor grad avhengig av intracellulære protein-protein interaksjoner. Derfor forskning om disse interaksjoner er uunnværlig for å tilrettelegge forståelsen av fysiologiske prosesser. Co-utfelling av tilknyttede proteiner, etterfulgt av masse massespektrometri (MS) analyse, gjør det mulig identifisering av romanen protein interaksjoner. I denne studien har vi gitt detaljer om romanen teknikk av immunutfelling-flytende kromatografi (LC)-MS/MS analyse kombinert med on-membran fordøyelsen for analyse av protein-protein interaksjoner. Denne teknikken er egnet for råolje immunoprecipitants og kan forbedre gjennomstrømningen av Proteomikk analyser. Tagged rekombinant proteiner ble utløst ved hjelp av spesifikke antistoffer; neste, immunoprecipitants blotted på Polyvinylidene polyvinylidenfluorid membran stykker ble utsatt for reductive alkylation. Etter trypsinization ble fordøyd protein rester analysert ved hjelp av LC-MS/MS. ved hjelp av denne teknikken, var vi i stand til å identifisere flere kandidat tilknyttede proteiner. Dermed er denne metoden praktisk og nyttig for karakterisering av romanen protein-protein interaksjoner.
Introduction
Selv om proteiner spiller konstituerende roller i levende organismer, blir de kontinuerlig syntetisert, bearbeidet og degradert i intracellulære miljø. Videre intracellulære proteiner ofte fysisk og biokjemisk samhandle, noe som påvirker funksjonen til en eller begge1,2,3. For eksempel, den direkte binding av spliceosome-assosiert protein homologe CWC22 med eukaryote oversettelse Initiation faktor 4A3 (eIF4A3) er nødvendig for montering av ekson Junction kompleks4. I samsvar med denne, en eIF4A3 mutant som mangler affinitet for CWC22 unnlater å lette ekson Junction kompleks-drevet mRNA skjøting4. Dermed er studiet av protein interaksjoner avgjørende for presis forståelse av fysiologiske regulering samt av cellulære funksjoner.
Nylige fremskritt i masse massespektrometri (MS) har blitt brukt på omfattende analyse av protein-protein interaksjoner. For eksempel, co-utfelling av endogene proteiner eller exogenously innført merkede proteiner med sine tilhørende proteiner, etterfulgt av MS analyse, gjør det mulig identifisering av romanen protein interaksjoner5. Imidlertid, ettall større flaskehalsen av MULTIPLE SCLEROSIS/MULTIPLE SCLEROSIS analyse er fattig det å bli frisk fra tryptic fordøyer av protein eksemplar. For å gjennomføre Proteomikk analyser på celle lysater, i-gel og på-membran fordøyelsen teknikker er generelt brukt til å forberede MS/MS prøver. Vi har tidligere sammenlignet en in-gel fordøyelsen prosedyre med en on-membran fordøyelsen teknikk6, og viste at sistnevnte var assosiert med bedre sekvensdekning. Polyvinylidene polyvinylidenfluorid (PVDF) membran kan være egnet for dette formålet fordi det er mekanisk robust og motstandsdyktig mot høye konsentrasjoner av organiske løsemidler7,8, tillater enzymatisk fordøyelse av immobilisert proteiner i nærvær av 80% acetonitril9. Videre kan immobilisering på en membran indusere conformational endringer i målet proteiner, noe som fører til forbedringer i tryptic fordøyelsen effektivitet10. Følgelig, i denne artikkelen, har vi beskrevet bruken av immunutfelling-LC/MS/MS analyse av protein interaksjoner med en on-membran fordøyelsen teknikk. Denne enkle metoden forenkler praktisk analyse av protein-protein interaksjoner selv i ikke-spesialist laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunutfelling
Merk: vi brukte ikke-natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS) lyseringsbuffer og citrate eluering, som beskrevet i de følgende avsnittene. Imidlertid kan bruk av en alternativ in-House immunutfelling teknikk også være aktuelt for å forberede LC-MS/MS prøver.
- Transfect kulturperler celler med vektorer koding en epitope tag alene eller en fusjon protein. For å anskaffe representative data, Overfør J774-celler (1 x 106) med vektorer som koder grønt fluorescerende PROTEIN (GFP) alene eller GFP-smeltet Capn6 (calpain-6-genet) ved hjelp av kationiske liposomer.
- Bøy antistoffer mot magnetiske perler.
- For dette formålet, bland anti-GFP antistoff (2 μL/reaksjon) med magnetiske perler (25 μL/reaksjon) i 500 μL av citrate fosfat buffer (24,5 mM sitronsyre, 51,7 mM dibasic natrium fosfat; pH 5,0) i et 1,5 mL reagensrør.
- Roter blandingen ved 50 RPM for 1 time ved romtemperatur. Deretter vaske IgG-bøyd perler tre ganger med citrate fosfat buffer som inneholder 0,1% Polyoksyetylensorbitanmonooleat (20) sorbitan sorbierittmonolaurat.
- Lyse de transfekterte cellene ved hjelp av en passende lyseringsbuffer. For å innhente representative data, lyse de transfekterte cellene i 30 minutter på is i 400 μL av lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM NaCl, 0,5% Poly (oxyethelene) octylphenyl Eter) som inneholder 40 mikromol/L phenylmethylsulfonyl fluor, 50 μg/mL leupeptin, 50 μg/ mL aprotinin, 200 mikromol/L natrium orthovanadate og 1 mM etylen glykol Tetraacetic syre (EGTA) i 1,5 mL reagensrør 24 h etter transfeksjoner.
- Fjern lysat ved å sentrifugering på 15 000 x g i 5 min og samle supernatanten.
- Preclearens lysat. Tilsett umerkede magnetiske perler (25 μL/reaksjon) i et 1,5 mL-test rør. Vask perlene tre ganger med 500 μL av citrate fosfat buffer. Etter fjerning av citrate fosfat buffer i siste vask, tilsett cellen lysat over magnetiske perler. Roter blandingen med Rotator ved 50 RPM i 30 min ved romtemperatur.
- Plasser reagensglasset på et magnetisk stativ i 5 minutter for magnetisk separasjon, og samle inn celle lysat. Bruk av det magnetiske stativet som er angitt av produsenten anbefales.
- Bind målet proteiner til bøyd perler. Plasser immunglobulin (IG) G-bøyd perler på et magnetisk stativ i 5 min for magnetisk separasjon, forkaste citrate buffer, og deretter legge til cellen lysat til de separerte perlene.
- Roter blandingen ved 50 RPM for 1 time ved romtemperatur.
- Skill mål proteinene fra frie, ikke-målrettede proteiner. Vask perlene tre ganger med 500 μL av citrate fosfat buffer som inneholder 0,1% Polyoksyetylensorbitanmonooleat (20) sorbitan sorbierittmonolaurat. Etter siste vask, tilsett 30 μL av citrate buffer (pH 2 – 3), og ruge i 5 min ved romtemperatur for å eluere mål proteinene.
Merk: Hvis gjenoppretting fra immunutfelling ikke er tilstrekkelig, kan bruk av alternative epitope merker, som flagg eller hans, forbedre effektiviteten. Hvis eluering effektivitet ikke er tilstrekkelig, kan bruken av andre eluants, for eksempel en SDS-basert løsning, forbedre effektiviteten.
2. on-membran fordøyelse av proteiner
Merk: bruk av protein-frie materialer og utstyr er nødvendig for å unngå forurensning med eksogene proteiner. I tillegg anbefales det at operatøren bruker en kirurgisk maske og hansker for å unngå forurensning av humane proteiner.
- Skjær PVDF membraner i 3 mm x 3 mm stykker ved hjelp av kirurgiske saks som har blitt tørkes med metanol og tørket umiddelbart før bruk.
- Tilsett 2 – 5 μL av etanol på deler av PVDF-membranen på ren aluminiumsfolie.
- Før de tørker helt, tilsett eluant (2 – 5 μL hver, 4 – 6 stk per prøve) på de hydrofile PVDF-membraner, og luft-tørk deretter membraner til membran overflaten blir Matt. Tørkede membraner kan oppbevares ved 4 ° c.
- Overfør alle membraner til 1,5 mL plastrør, tilsett 20 – 30 μL av etanol for å gjøre membraner hydrofile, og fjern deretter etanol ved hjelp av en pipette.
- Før membranen tørker helt ut, tilsett 200 μL av dithiotreitol (DTT)-baserte reaksjons løsning (80 mM NH4HCO3, 10 mm DTT, og 20% acetonitril) og ruge det ved 56 ° c for 1 time.
- Erstatt reaksjons løsningen med 300 μL av iodoacetamide oppløsning (80 mM NH4HCO3, 55 mm iodoacetamide, og 20% acetonitril), og ruge for 45 min ved romtemperatur i mørket.
- Vask membraner to ganger med 1 mL destillert vann og en gang med 1 mL 2% acetonitril ved Vortex blanding for > 10 s.
- Løs opp lyofilisert MS-grade-Trypsin (innholdsfortegnelsen) direkte i reaksjons løsningen (30 mm NH4HCO3 inneholdende 70% acetonitril). Tilsett 100 μL av reaksjons løsningen som inneholder 1 mikrogram Trypsin (Material tabell) (30 mm NH4HCO3 inneholdende 70% Acetonitril) og ruge ved 37 ° c over natten.
- Overfør reaksjons løsningen som inneholder tryptic fordøyer, til et rent 1,5 mL test rør med en pipette.
- Tilsett 100 μL vaskeløsning (70% acetonitril/1% trifluoroacetic syre) til membranen og ruge den ved 60 ° c for 2 h. samle vaskeløsningen og bland den med reaksjons løsningen. Tilsett ytterligere 100 μL av vaskeløsning til membranen og sonikere den i 10 min. Deretter samle vaskeløsningen og bland med reaksjons løsningen.
- Dekk reagensglasset med et stykke laboratorie film og lage et par små hull med en nål. Tørk løsningen med et vakuum konsentrat.
- Oppløse rester i 10 μL av 0,2% maursyre syre. Etter sentrifugering (12 000 × g, 3 min ved romtemperatur), Overfør supernatanten til et prøverør.
Merk: vasken er de kritiske trinnene i denne delen. Under på-membran protein fordøyelsen, vask av membraner som inneholder immobilisert proteiner etter reduksjon og alkylation med destillert vann, etterfulgt av 2% acetonitril, for mer enn 10 sek hver, er avgjørende for fjerning av reagensene.
3. LC-electrospray ionisering (ESI)-MS/MS analyse
- Aktivere en ESI-MS/MS instrument (tabell av materialer) kombinert med en nano-LC HPLC system (tabell av materialer). Koble en forhånds kolonne (tabell med materialer) og en analytisk kolonne (tabell med materialer).
- Før analysen, kalibrere massen spektrometer bruker tryptic fordøyer av storfe serum albumin oppløst i 0,2% maursyre syre, som gir standard peptider.
- Analyser prøvene ved hjelp av positiv ion-modus og et masse område på 400 – 1250 m/z; deretter erverve opptil 10 MS/MS Spectra (100 MS hver) med en masse utvalg av 100-1600 m/z og en lineær stigning på 2%-80% acetonitril og 0,2% maursyre syre for 80 min ved en strømningshastighet på 300 nL/min.
- Analysere Output data ved hjelp av programvare for protein identifisering (tabell av materialer) for å identifisere kandidaten tilhørende proteiner. For positiv identifisering av en kandidat protein, påvisning av minst ett High-Fidelity peptid fragment (> 95% Fidelity) er nødvendig.
- Utelat proteiner som er tilsvarende utløst i GFP-uttrykker lysater (transfeksjoner av vektor uttrykke en GFP tag alene) fra listen over kandidat proteiner.
Merk: Hvis noen proteiner er identifisert i databasen analyse, endring av MS/MS oppkjøpet forhold (f. eks, endre tiden fra 100 MS hver til 50 MS hver) kan øke antall proteiner identifisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor beskrevet, ble immunoprecipitants analysert med LC-MS/MS (figur 1). Etter utelukkelse av exogenously avledede proteiner (proteiner fra andre arter og IgG) ble 17 proteiner identifisert i calpain-6-assosiert immunoprecipitants (tabell 1) og 15 proteiner ble IDENTIFISERT i GFP-assosiert immunoprecipitants ( Tabell 2). Av calpain-6 og GFP-assosierte proteiner ble 11 identifisert i begge immunoprecipitants (figur 2). Når disse og calpain-6 selv ble ekskludert, fem kandidat calpain-6-Associated proteiner forble: komplement C1q Delkomponenten delenhet C, keratin type II cytoskjelettkomponenter 8, IgE-bindende protein, ADP/ATP translocase 1, og ubiquitin.
Figur 1. Ordningen for on-membran fordøyelsen teknikken
Celle lysater ble utløst ved hjelp av magnetiske perler bøyd med spesifikke antistoffer. Eluant fra immunutfelling ble blotted på deler av PVDF membran. Deretter ble membraner behandlet med reagenser for reductive alkylation, og deretter inkubert med Trypsin. Reaksjons løsningen ble deretter analysert ved hjelp av LC-MS/MS. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oversikt over representative data
Sytten proteiner ble identifisert i calpain-6-assosiert immunoprecipitant og 15 proteiner ble påvist i GFP-assosiert immunoprecipitant. Av disse ble 11 proteiner identifisert i begge immunoprecipitants. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Tiltredelse | Peptider (95%) | % Pakter |
| Utgangen, cytoplasmatiske 2 | Hvordan gjøre | P63260 | ACTG | 5 | 18,4 |
| Utgangen, aorta glatt muskulatur | Hvordan gjøre | P62737 | Acta | 5 | 18,57 |
| Utgangen, cytoplasmatiske 1 | Hvordan gjøre | P60710 | ACTB | 5 | 18,41 |
| Utgangen, Alpha Skjelettmuskel | Hvordan gjøre | P68134 | Fungerer | 5 | 13,53 |
| Utgangen, Alpha hjerte muskel 1 | Hvordan gjøre | P68033 | ACTC | 5 | 13,53 |
| Utgangen, gamma-enteric glatt muskel | Hvordan gjøre | P63268 | ACTH | 5 | 13,56 |
| Forlengelse faktor 1-alfa 1 | Hvordan gjøre | P10126 | EF1A1 | 3 | 33,33 |
| Forlengelse faktor 1-Alpha 2 | Hvordan gjøre | P62631 | EF1A2 | 3 | 16,2 |
| Keratin, type II cytoskjelettkomponenter 8 | Hvordan gjøre | P11679 | K2C8 | 3 | 22,65 |
| Komplement C1q Delkomponenten delenhet C | Hvordan gjøre | Q02105 | C1QC | 2 | 8,94 |
| IgE-bindende protein | Hvordan gjøre | P03975 | IGEB | 2 | 21,72 |
| Calpain-6 | Hvordan gjøre | O35646 | CAN6 | 1 | 15,91 |
| ADP/ATP-translocase 2 | Hvordan gjøre | P51881 | ADT2 | 1 | 27,52 |
| ADP/ATP-translocase 1 | Hvordan gjøre | P48962 | ADT1 | 1 | 19,13 |
| Ubiquitin | Hvordan gjøre | P62991 | UBIQ | 1 | 40,79 |
| Runt-relatert transkripsjon faktor 3 | Hvordan gjøre | Q64131 | RUNX3 | 1 | 15,89 |
| Isoformen 2 av runt-relatert transkripsjon faktor 3 | Hvordan gjøre | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 13 |
| "Peptider (95%)" indikerer antall peptider identifisert med en Fidelity-poengsum > 95% i MS/MS-data. "% Pakter" viser til prosentandelen av aminosyren rester identifisert i alle peptider (med > 95% Fidelity) i forhold til det totale antallet av aminosyre rester som utgjør det tilsvarende proteinet. For å forbedre klarheten, blir eksogene proteiner (proteiner fra andre arter og IgG), ribosomal proteiner og histoner ikke vist. | |||
Tabell 1. Calpain-6-assosierte proteiner
| navn | Tiltredelse | Peptider (95%) | % Pakter |
| Forlengelse faktor 1-alfa 1 | Hvordan gjøre | P10126 | EF1A1 | 3 | 24,24 |
| Forlengelse faktor 1-Alpha 2 | Hvordan gjøre | P62631 | EF1A2 | 3 | 24,41 |
| Utgangen, Alpha Skjelettmuskel | Hvordan gjøre | P68134 | Fungerer | 3 | 13,53 |
| Utgangen, Alpha hjerte muskel 1 | Hvordan gjøre | P68033 | ACTC | 3 | 13,53 |
| Utgangen, gamma-enteric glatt muskel | Hvordan gjøre | P63268 | ACTH | 3 | 13,56 |
| Utgangen, cytoplasmatiske 2 | Hvordan gjøre | P63260 | ACTG | 3 | 13,6 |
| Utgangen, aorta glatt muskulatur | Hvordan gjøre | P62737 | Acta | 3 | 13,53 |
| Utgangen, cytoplasmatiske 1 | Hvordan gjøre | P60710 | ACTB | 3 | 13,6 |
| ADP/ATP-translocase 2 | Hvordan gjøre | P51881 | ADT2 | 2 | 25,5 |
| rRNA 2 '-O-methyltransferase fibrillarin | Hvordan gjøre | P35550 | FBRL | 2 | 14,37 |
| Prohibitin | Hvordan gjøre | P67778 | PHB | 1 | 9,19 |
| Heterogen kjernefysiske ribonucleoprotein U | Hvordan gjøre | Q8VEK3 | HNRPU | 1 | 10,63 |
| Runt-relatert transkripsjon faktor 3 | Hvordan gjøre | Q64131 | RUNX3 | 1 | 39,12 |
| Isoformen 2 av runt-relatert transkripsjon faktor 3 | Hvordan gjøre | Q64131-2 | RUNX3 | 1 | 26 |
| Forlengelse faktor 1-gamma | Hvordan gjøre | Q9D8N0 | EF1G | 1 | 12,36 |
| "Peptider (95%)" indikerer antall peptider identifisert med en Fidelity-poengsum > 95% i MS/MS-data. "% Pakter" viser til prosentandelen av aminosyren rester identifisert i alle peptider (med > 95% Fidelity) i forhold til det totale antallet av aminosyre rester som utgjør det tilsvarende proteinet. For å forbedre klarheten, blir eksogene proteiner (proteiner fra andre arter og IgG), ribosomal proteiner og histoner ikke vist. | |||
Tabell 2. GFP-assosierte proteiner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har tidligere beskrevet en analyse av oksidativt modifikasjoner av Apolipoprotein B-100 i oksidert lav tetthet lipoprotein ved hjelp av LC-MS/MS innledes med en on-membran fordøyelsen teknikk6. I den foreliggende studien kombinerte vi denne teknikken med immunutfelling og har identifisert flere calpain-6-assosierte proteiner. Denne romanen teknikken representerer en praktisk metode for screening for kandidat tilknyttede proteiner. Calpain-6 er et ikke-proteolytiske medlem av Calpain proteolytiske familie11 som har angivelig endre cellulære funksjoner gjennom protein-protein interaksjoner12,13. Ved hjelp av en on-membran fordøyelsen teknikk, har vi tidligere identifisert andre calpain-6-assosiert proteiner ansette en annen MS oppsett12. Derfor anbefaler vi å teste flere MS vilkår for å maksimere antall kandidater identifisert. Av samme grunn er evalueringen av immunutfelling forhold, for eksempel hvilke typer epitope, vaskemiddel og eluering løsning som brukes, viktig for å oppnå optimale utganger.
I denne studien identifiserte vi 11 proteiner i både calpain-6-og GFP-assosierte immunoprecipitants. Flertallet av de overlappende proteinene var utgangen isotypes, og forurensning med utgangen cytoskjelettkomponenter proteiner er vanlig i analysene av cellulære protein-protein interaksjoner fordi uttrykket nivåer av disse proteinene er svært høy. Disse kandidatene bør derfor utelates fra videre analyse. I tillegg ble det påvist forlengelse faktorer i begge immunoprecipitants. De regulerer hastigheten og troskap av proteinsyntese og påvirker protein-folding14, og derfor co-immunutfelling av forlengelse faktorer er ikke overraskende. Disse proteinene bør også utelates fra ytterligere evaluering.
Immunoprecipitants kan utsettes for reductive alkylation og enzymatisk fordøyelsen direkte i eluering løsning15, og dette i løsningen fordøyelsen metoden kan også anvendes for utarbeidelse av prøver for MS/MS. Men vi anser bruk av on-membran fordøyelsen å ha betydelige fordeler fremfor i løsningen fordøyelsen. PVDF membran fungerer som et stillas for den påfølgende reductive alkylation og enzymatisk fordøyelse, noe som betyr at løsnings midlene som kreves for disse prosessene kan erstattes enkelt. Følgelig er det mulig å bruke en rekke eluering løsninger for immunutfelling. Omvendt, for fordøyelsen i løsningen, kan det være utfordrende å bruke SDS-baserte eller lave pH eluering løsninger fordi protease aktivitet kan begrenses under slike forhold. Videre kan immobilisering av mål proteinene gjøre den påfølgende vaskeprosedyren enklere. Derfor, on-membran fordøyelsen er svært egnet for utarbeidelse av immunoprecipitants for MS/MS analyse. Et begrenset antall proteaser kan være passende for denne protokollen. Hittil er bare Lysyl-C, annet enn Trypsin, angivelig aktiv i nærvær av opptil 80% acetonitril6,9,10,15.
Vår on-membran fordøyelsen teknikken er egnet for identifisering av proteiner i en liten mengde immunoprecipitant med en svært følsom deteksjon grense. Det bør imidlertid huskes at deteksjons effektiviteten for et mål protein avhenger av hvor mye som er tilstede. Proteiner som er til stede i større mengder er fortrinnsvis oppdaget og de kan hindre at andre proteiner tilstede i mindre mengder oppdages av MS. Under normale omstendigheter oppdages likevel mange proteiner med LC-MS/MS-analyse, og andre analyser må brukes for å klargjøre hvilke av kandidat proteinene som er av passende biologisk betydning.
I denne studien har vi evaluert en on-membran fordøyelsen teknikk for analyse av immunoprecipitants. En slik praktisk og omfattende metode for analyse av protein-protein interaksjoner bør være allment anvendelig for å forbedre gjennomstrømningen av fremtidige Proteomikk analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet delvis av Japan Society for fremme av science KAKENHI Grant Number 17K09869 (til AM), Japan Society for fremme av science KAKENHI Grant Number 15K09418 (til TM), et forskningsstipend fra Kanehara Ichiro Medical Science Foundation og et forskningsstipend fra Suzuken Memorial Foundation (alle til TM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Wako | 014-00386 | |
| Citric acid | Wako | 030-05525 | |
| DiNA | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography | |
| DiNa AI | KYA Tech Co. | nanoflow high-performance liquid chromatography equipped with autosampler | |
| DTT | Nacalai tesque | 14112-94 | |
| Dynabeads protein G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| Formic acid | Wako | 066-00461 | |
| HiQ Sil C18W-3 | KYA Tech Co. | E03-100-100 | 0.10mmID * 100mmL |
| Iodoacetamide | Wako | 095-02151 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | Clontech | 632380 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | |
| NH4HCO3 | Wako | 018-21742 | |
| Nonidet P-40 | Sigma | N6507 | poly(oxyethelene) octylphenyl ether (n=9) |
| peptide standard | KYA Tech Co. | tBSA-04 | tryptic digests of bovine serum albumin |
| PP vial | KYA Tech Co. | 03100S | plastic sample tube |
| Protease inhibitor cooctail | Sigma | P8465 | |
| ProteinPilot software | Sciex | 5034057 | software for protein identification |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | trypsin |
| Sodium orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 71643 | |
| TFA | Wako | 206-10731 | |
| trap column | KYA Tech Co. | A03-05-001 | 0.5mmID * 1mmL |
| TripleTOF 5600 system | Sciex | 4466015 | Hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer |
| Tris | Wako | 207-06275 | |
| Tween-20 | Wako | 160-21211 |
References
- Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. Co-translational protein folding: progress and methods. Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79 (2017).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).
- Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly. Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).
- Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).
- Obama, T., et al. Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS. Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).
- Matsudaira, P. Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes. The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).
- Yamaguchi, M., et al. High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).
- Iwamatsu, A. S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing. Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).
- Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems. Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).
- Miyazaki, T., Miyazaki, A. Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).
- Tonami, K., et al. Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1. Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).
- Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. Protein elongation, co-translational folding and targeting. Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).
- Bunai, K., et al. Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile. Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).
